Способ получения реагента для проведения реакции агглютинации

 

Изобретение касается медицины. .в частности иммунохимических peai е; .-- тов. Цель изобретения - повьшение чувствительности реагента. Для этого частицы носителя, составляющие часть реагента, размером 0,052-1,2 ьжм сен сибилизируют антигеном или антителом. Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспендированием в водной среде обрабатьшают стабилизатором, включающим аминокислоты , белки, полипептиды, не осаждающиеся в иммунологической реакции агглютинации. Водная среда с рН 5-10, в которой суспендируют носитель, имеет электропроводность 5,0 мс/см и . меньше и конечную концентрацию частиц 0,01-20%. 1 табл. о 9

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1 0 4 А 61 К 39/00 г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Г

Н ПАТЕНТ,Ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3430146/28-14 (22) 03.05.82 (31) 67332/8) (32) 02,05,81 (33) Jr (46) 15.10.88. Бюл. N- 38 (71) Мицубиси Кемикал Индастриз

Лимитед (ЗР) (7 2) Сатоси Тсутсуй, Тадамитсу Судо и Митио Ито (JP) (53) 615.373(088.8) (56) Jmmunochemiptry, vol, 12, р. 349-351, 1975. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ

ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ АГГЛ10ТИНАЦИИ (57) Изобретение касается медицины, „„SU ÄÄ 1431662 А 5.в частности иммунохимических реаг.-,.-тов . Цель изобретения — повышение чувствительности реагента. Для этого частицы носителя, составляющие часть реагента, размером 0,052-1,2 мкм сен сибилизируют антигеном или антителом.

Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспендированием в водной среде обраба гывают стабилизатором, включающим амико" кислоты, белки, полипептиды, не осаждающиеся в иммунологической реакции агглютинации. Водная среда с рН 5-10, в которой суспендируют носитель, имеет электропроводность 5,0 мс/см и ,меньше иконечную концентрацию частиц

0,01-20%. 1 табл.

1ч31б62

Изобретение относится к иммунохимическому реагенту, и может быть использовано в медицине, биохимии, гигиене и эпидемиологии при анализе следовых количеств соединений, особенно анти5 генов и антител.

Дель изобретения — повышение чувствительности реагента.

Способ осуществляется следующим .образом.

Частицы носителя, которые составляют часть реагента по данному изобретению, представляют собой частицы практически .нерастворимые в водной среде, Такие частицы носителя могут быть изготовлены из любого подходящего соединения, которое включает в себя латексы таких полимерных соединений, как полистирол, бутадиенстирольный сополимер, полиакрилат,полиметакрилат, сополимер акрилонитрила с бутадиеном и стиролом, латексы этих полимеров, активированные введением карбоксильных или амидных групп с помощью сополимеризации с акриловой кислотой,метакриловой кислотой, акриламидом и т.п. клетки „крови, такие бактерии, как стафилококки и стрептококки, вегratue marcescens, риккетсии, а также части этих бактерий.

Средний диаметр частиц носителей равен от 0 05 до 1,2 мкм или от 0,1 до

1,00 мкм, предпочтительно от 0,2 до

0,8 мкм, Если диаметр частиц носите35 ля слишком велик,то пределы анализа сужаются или становятся более нестабильными. С другой стороны, частицы носителя с малым диаметром приводят к экономическим потерям при получении реагента и имеют низкую чувствительность, Следовательно, частицы как с черезмерно большим, так и с черезмерно .малыми)". диаметрами испольэовать не следует.

Антигены, наносимые на частицы носителя реагента по данному изобретению включают в себя, например, белки, полипептиды, стероиды, полисахариды, липиды, пыльцу, пыль, гаптены и т.II, 50

Антитела включают в себя, например, белки, получаемые реакцией с указан: ными антигенами.

Концентрация частиц носителя обычно равна 0,03-0,3%, предпочтительно

0,05-0,2Х (конечная концентрация).

При более высокой концентрации частиц носителя необходимо использовать более сложное. оборудование для проведения анализа с реагентом по данному изобретению, причем дальнейшее увеличение эффективности не достигается, При низких концентрациях частиц не получают удовлетворительную чувствительность и реакционную способность.

Частицы носителя можно сенсибилизи" ровать антигеном или антителом по любой известной методике, т.е. физической адсорбцией антигена или антитела на частицах носителя, химическим связующим антигена или антитела с частицами носителя либо комбинацией этих способов, Количество антигена или антитела для сенсибилизации носителя выбирают в зависимости от конкретного типа антигена или антитела и нужной точности анализа с помощью данного реагента.

Частицы носителя, сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспендированием в водной среде могут быть обработаны стабилизатором,включающим в себя аминокислоты, полипептиды, белки и т.п., которые не осаждаются в данной иммунологической реакции, причем в качестве стабилизатора предпочтительно испольэовать сывороточный альбумин. Обработку стабилизатором предпочтительно проводить известным способом, с точки зрения хранения и стабильности реакции. Особенно значительный эффект достигается в тех случаях, когда антиген или антитело физически адсорбированы на носителе.

Водная среда, в которой суспендирован носитель, сенсибилизированный ан" тигеном или антителом, должна иметь электропроводность, равную 5,0 или

2,5 мс/см, предпочтительно 1,0 мс/см и ниже. При электропроводности, превышающей 5,0 мс/см, реагент нестабильный, что приводит к снижению точности анализа.

Водная среда может представлять собой воду, буферный раствор и т.п, и содержать одну или более добавку, выбранную из стабилизаторов, консервантов, хелатных агентов, поверхностноактивных соединений и т.д. Буферные растворы включают в себя глициновые буферы, буферы на основе фосфорной кислоты, цитратные буферы, барбиталовые буферы, боратные буферы, буферы на основе системы трис(трис)гидроксиметил(аминометан)-соляная кислота, трис-малатные буферы, аммонийные буферы и т.п.

Стабилизаторы включают в себя, например, указанные стабилизаторы в концентрациях 0,001 вЂ, предпочтительно

0,05-0,6/.

Предлагаемые консерванты включают

5 в себя мертиолат и азид натрия, В качестве хелатных агентов используют этилен-диаминтетрауксусную кислоту, нитрилтриуксусную кислоту, цикло- 1О гександиаминтетрауксусную кислоту и т.п., в качестве поверхностно-активных соединений — неионогенные поверхностно-активные соединения. рН водной среды равен 5-10 или

6-9,5, предпочтительно 6,5-8,5, Если рН водной среды меньше чем 5, то реагент нестабильный, хотя чувствительность повышается, Водная среда, имеющая значение рН,более 10, приводит к 20 снижению чувствительности и в некоторых случаях к нестабильности хранения реагента.

Частицы носителя, сенсибилизирован.ные антигеном или антителом, суспен- 25 дируют в водной среде в концентрации

0,01-20%, предпочтительно 0,05-10/.

При более низкой или более высокой концентрациях результирующий реагент ь имеет, пониженную стабильность, его использование становится неудобным и ограниченным, Предлагаемый реагент получают сенсибилизацией описанных частиц носителя антигеном и антителом известным способом с последующей обработкой сенсибилизированного носителя стабилизатором и суспендированием носителя в водной среде известным способом, Реагент по данному изобретению при"40 годен в качестве реагента или основного раствора реагента для проведения реакции на стеклянной пластинке или в испытательной пробирке с визуальным наблюдением за агглютинацией или при проведении реакции в оптической кювете с оптическим контролем за ходом реакции.

Реагент может быть использован для анализа иммунологической реакции. Для Б0 этого предлагаемый реагент разбавляют буферным раствором и доводят концентрацию носителя, сенсибилизированного антигеHQM или антителом, до уровня, пригодного для анализа иммунологической реакции.

Концентрация реагента зависит от вида анализируемого антитела или антлгена, их концентрации и реакционной способности, что определяется экспериментально. В случае оптического изменения иммунологической реакции конечная концентрация носителя равна не менее 0,03 вес. . или от 0,05 до

1 вес.7. и более, предпочтительно

0,1-0,5 вес. ..

В случае визуального наблюдения иммунологической реакции результирующая концентрация лежит в интервале от 0,05 до 0,8 вес.%, предпочтительно от 0 1 до 0 5 вес. ..

Буферные растворы, которые можно использовать для разбавления реагента, включают в себя глициновые буферы, боратные буферы, буферы трисхлористоводородная кислота, трпс-малатные буферы, аммонийные буферы и т.п. рН используемых буферных растворов 7,6-9,6, предпочтительно.8,0-9;О, Буферный раствор с более низкими зна" чениями рН вызывает агглютинацию и, следовательно, делает реагент непригодным, хотя и приводит к повышению чувствительности. При более высоких значениях рН снижается чувствительность и могут нарушаться свойства прп хранении при повышенных температурах, что нежелательно.

Таким образом, при визуальном наблюдении иммунологической реакции заданное количество реагентов и образца, содержащего антиген или антитело, смешивают на стеклянной пластинке или в испытательной пробирке и наблюдают агглютинацию сенсибилизированных частиц.

В случае оптического измерения иммунологической реакции заданное количество реагента и образца, содержащего антиген или антитело, смешивают и определяют в оптической кювете изменение светопропускания, светорассеяния или помутнения, Если оптическое измерение проводят определением светопропускания, то обычно используют свет с длиной волны, большей чем средний диаметр частиц носителя, с соотношением длины волны к диаметру частиц, равным не менее 1,1 или не менее 1,5 и предпочтительно не менее 2. Длина волны обычно лежит в интервале от 600 до 2400 нм, предпочтительно от 800 до 1800 нм, Если свет имеет меньшую длину волны, то для получения подходящего светопропускания необходимо использовать час1431662 тицы носителя в достаточно низкой концентрации, а также реагент, имеющий крайне высокую диспергируемость, что приводит к трудности увеличения чувствительности и в некоторых случаях к обратимому протеканию реакции. Большая длина волны также нежелательна из-за снижения чувствительности. Свет может быть как монохроматическим, так 10 и полихроматическим. Оптическая кювета, используемая для измерения светопропускания имеет толщину от 0,2 до

10 мм.

Измерение пропускания можно прово-; дить определением времени, требуемого для достижения заданного значения поглощения, либо определением повышения поглощения за определенный промежуток времени.

Оптическое измерение с использованием светорассеяния проводят, как при определении светопропускания.

Предлагаемые реагенты представляют 25 собой сепсибилизированные частицы реагента для использования в иммунологических реакциях, С их помощью можно определять количества антигена или антитела в различных образцах с хоро- 30 шей воспроизводимостью и высокой точностью, Кроме того, они эффективны после замораживания и размораживания и, следовательно, могут быть лиофилиэованы и испольэоганы повторно, Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример !.Глобулиновое антитело. против Q -фетопротечна растворяют в

0,1 Г1 глициновом буфере (pH 8,8). Чис-- 10 ло глобулиновых антител соответствует

800-1500 на каждую латексную частицу (имеющую диаметр О, 052 мкм, производство фирмы Dow Сйеш1.cal). Затем раствор смешивают с равным объемом латекс-45 глицинового буфера (pH 8,8 при перемешивании и комнатной температуре для достижения адекватной сенсибилизации), После разделения центрифугированием супернатант удаляют и осадок обрабаты-50 вают соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, Получен, ные таким образом сенсибилизированные частицы суспендируют в буферном растворе с концентрацией частиц 1,0%, име-55 ющем электропроводность 1,5 мс/см и содержашем соответствующее количество консерванта, после чего суспензию оставляют на хранение, С результирующим реагентом достигается отличная точность анализа, Для анализа иммунологической реак" ции реагент разбавляют глициновым буфером (рН 8,6).

Результаты анализа представлены в таблице.

Образец сыворотки, нг/мл

Опыт

3 (950,0) 2 (195,6) 1 (45,0) 906, 2

917,5

887, 5

90l,3

906,3

937,1

885,0

9l 8, О

913,5

925,3

921, 0

887, 2

Среднее значение 41,9

187,7 908,8

Стандартное отклонение 2, 26

4,49

16,4

Коэффициент вариации 5,4%

2,4%

l,8%

П р и м е ч а н и е. Значения в скобках йолучены радиоиммунным анализом.

Пример 2. Антитело анти-СРБ (С-реакционноспособного белка) рас творяют в 0,2 Г1 боратном буфере (рН

8,8) и латексные частицы (диаметр

0,220 мкм, производство Dow Chemical) суспендированные в таком жe буфере, сенсибилизируют результирующим раствором таким образом, чтобы каждая частица несла на себе 800-1800 анти1 45,2

2 41,3

3 42,0

44,5

5 44,6

6 . 43,6

7 42,5

8 42,0

9 38,9

10 38,6

11 40,2

12 39,7

189,2

190,5

195,8

181,1

190,5

189,7

180,1

184,5

180,5

184,2

185,6

190,1

1431662 генов, Сенсибилиэированные латексные частицы обрабатывают бычьим сывороточным альбумином и суспендируют в соответствующем количестве боратного буфера (4,0 мс/см) с концентрацией час5 тиц 2,0, Результирующий реагент обладает очень высокой точностью измерения.

Пример 3. Антитело F (аЬ ) 10 крысы или козы против человеческого фибриногена растворяют в 0,1 М трисмалатном буфере (рН 8,6), а латексные частицы (диаметром 1,091 мкм, производство Dow Chemical), суспендированные в таком же буфере, сенсибнлизируют результирующим раствором, чтобы чувствительность результирующего реагента была равна величине порядка

100 нг/мл, Затем частицы обрабатывают 2п бычьим сывороточным альбумином и суспендируют в водном растворе, содержащем 0,1 азида натрия (1,0 мс/см) при концентрации частиц 0,0l . При исполь.зовании реагент разбавляют тряс-ма- 25 латным буфером (рН 8,4) или буфером трис-хлористоводородная кислота (рН

8,4) до нужной концентрации латекса и проводят реакцию на стеклянной пластинке либо реагент может использовать-30 ся без разбавления для оптического анализа, При реакции на стеклянной пластинке с использованием этого реагента различают агглютинирующую и неагглютинирующую системы, 35

Пример 4, Глобулиновое антитело козы против человеческого растворяют в 0,1 М трис-малатном буфере (рН 8,8) н раствором сенсибилизируют латексные частицы (диаметром 0,312 мкм,4р производство Dow Chemical) суспендированные в таком же буфере. Сенсибилиэированные частицы обрабатывают затем бычьим сывороточным альбумином и в конце суспендируют в водном раст- 45 воре с концентрацией частиц 2Х имею" щем проводимость, равную приблизительно 3,0 мс/см, При использовании суспензию разбавляют 0,1 М трис-малатным или трис-НС1 буфером до требуемой 50 концентрации нли используют сам по себе, Пример 5. Крысиное антитело

F (аЪ ) против человеческого IgA растворяют в 0,2 М боратном буфере (рН 8,3), раствор обрабатывают также, как в примере 4, и получают целевой реагент в суспензии с концентрацией

1 за исключением того, что водный раствор, используемый для конечного суспендирования сенсибилиэированных частиц, имеет проводимость, равную приблизительно 0,5-0,8 мс/см.

Пример 6„ Латексные частицы сенснбилизируют высокоочищенным кры-. синым антителом против человеческого

1gM в глициновом буфере с рН 9,6.

Количественные соотношения изменяют в зависимости от качества антител н от нужной чувствительности, Сенснбилизированные частицы обрабатывают сост« ветстветствующим количеством бычьего сывороточного альбумнна, а затем сус" пендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно

1,2 мс/см, который может содержать приблизительно 0,05 бычьего сывораточного альбумина, в результате чего получают целевой реагент с концентрацией частиц 2,51. Пример 7. Высокоочищенное крысиное антитело F (аЬ ) против hCG растворяют в 0,2 M трус-НС1 буфере (рН 8,6) и результирующий раствор используют для сенсибилиэации в нем латексных частиц (днаметром 0,220 мкм, производство Dew Chemical), суспендированных в таком же буфере, при ком" натной температуре. После обработки соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина сенсибилизнрованные частицы суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно 0,8 мс/см, н концентрацию частиц l и затем оставляют на хранение, Пример 8, Латексный реагент получают в условиях примера 7, за исключением того, что используют античеловеческое igg-антитело f(ab )> и латексные частицы, имеющие диаметр

0,089 мкм (производство Dow Chemical) .

Концентрация латекса равна 0 25Х, Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа, Пример 9. Латексный реагент получают в условиях примера 7 эа нск" лючением того, что используют анти" сеа (канцероэнбиотический антиген) антитело f (аЬ ) и латексные частицы, имеющие диаметр 0,8 мкм (производство

Dow Chemical), Концентрация латекса равна 1 . Результирующий реагент пока-. зывает хорошую точность анализа, Пример 10, Латексный реагент для анализа cl-фетопротеина получают по методике, описанной в примере 1, 1,31662! 0 ти тел, приближая сь по чувствительности к радиоиммунному анализу.

Составитель Г,Крюкова

Техред Л. Олийнык Корректор О.Кравцова

Редактор И .Иедолуженко

Заказ 5356/ 58 Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. ч/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 за исключением того, что электропро-, водность доводят до 5 мОм"/см. Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа, 5

Пример 11. Повторяют методику примера 1 с использованием частиц латекса размером l,20 мкм. Реагент показывает высокую точность измерений, Пример 1 2. Повторяют методику 10 использованную в примере 2, с использованием буферной среды, электропроводность которой составляла 2,5 мОм /

-f

/см, Реагент показывает высокую точность измерений, 15

Таким образом, предлагаемый реагент обладает высокой чувствительностью при обнаружении антигенов и анФ о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения реагента для проведения реакции агглютинации, включающий сенсибилизацию частиц носителя антигеном или антителом и суспендирование в водной среде, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности реагента, для сенсибилиэации используют частицы носителя размером О, 052-1, 2 мкм и суспендирование осуществляют в среде с электропроводностью 5,0 мс/см и меньше и с концентрацией частиц 0,0120 .