Способ получения эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью узнавать и расщеплять последовательности нуклеотидов 5 @ -gpucgpyc-3 @ и 5 @ -catg-3 @

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к способам получения фермента, специфически расщепляющего даК. Рестриктазы могут быть использованы для исследования первичной структуры ДНК и в i генной инженерии. Цель изобретения - упрощение способа получения и повышениевыхода целевых продуктов. Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктаз используют штамм Haemophilus influenzae RFL I (BiaiM B-4035). Культивирование проводят в условиях аэрации на питательной среде до достижения оптической плотности суспензии клеток 1,8-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку ферментов из полученного бесклеточного экстракта путем хро матографии на фосфоцеллюлозе с последующей очисткой рестриктазы Hin И на голубой сефарозе и гепаринсефарозе и хроматографической очисткой рест риктазы Hin III на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе . При использовании способа получают высокие выходы высокоочищенных рестриктаз. Hin II и Hin III

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)4 С 12 N 9/22//(С 12 Н 9/22, С 12 К 1:21) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ЙРи Гкнт сссР (21) ) 4255590/28-13. (22) 03.06.87 (4b) 15.02.89. Бюл. М Ь (71) Научно-производственное объединение "Фермент" и Центральный научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (72) Л.Г. Лазарявичюте,.В.В. Буткус, З.П. Манялене, Э.Ю. Кюдулене, Ю.Б. Битинайте,; В.С. Лаучис, И.М.Грубер,. В.М. Иоляченко, И.Д. Горбачев и Э.А.-А. Янулайтис (53) 577.15(088.8) (56) Whitehead P.R.. and Brown N.L.

А: simple and горЫ method for ree-

ning bacteria for type I restriction endonucleases enzymesin АрЬаnothece halopligtica.-Arch. Nicrobiol., 1985, ч. 141, N 1, р. 70-75. .giang В.Q. Schildkrànt I. Iwo

unique restriction endonucleases

from Neisseria lactomica, Nucl.

Acids. Ros, 1986, v. 14,,1 5, . р. 1991-1999. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗРЕСТРИКТАЗ, ОБЛАДАЮЦИХ СПОСОБНОСТЬЮ

УЗНАВАТЬ И РАСЦЕПЛЯТЬ. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ-. НОСТИ НУКЛЕОТИДОВ 5 .-GPuCGPyG-3 и

5 -CATG-3

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству ферментов, в частности к способу получения рестриктаз.

Целью изобретения является упфощение способа получения и повышение выхода целевых продуктов. (57) Изобретение относится к микробиологической промыпленности, к способам получения фермента, специфически расщепляющего ДНК. Рестриктазы могут быть использованы:для исслеДования первичной структуры ДНК и в . генной инженерии. Цель изобретения—

1 упрощение способа получения и повышение. выхода целевых продуктов. Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктаз используют штамм Haemophilus influenzae RPL I (BKIIM В-4035). Культивирование проводят в условиях аэрации на питательной среде до достижения .оптической плотности суспензии клеток 1,8-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку ферментов из полученного бесклеточного экстракта путем хроматографии на фосфоцеллюлозе с последующей очисткой рестриктазы Hin II на голубой сефарозе и гепаринсефарозе и хроматографической очисткой рестриктазы

Hin III на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе. При использовании способа получают высокие выходы высокоочищенных рестриктаз Hin II u Hin III М (15000 и 1000 ед/г биомассы соответственно).

Штамм Haemophilus influenzae RFL I

Зо получен из ЦНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова и хранится во

Всесоюзной коллекции промьппленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" под номером ВКИМ В-4035.

Используемыи штамм Haemophilus

influenzae RFL I обладает следующими орфологическими, культуральными и физиологическими признаками. Клетки коккобациллярные. Грамотрицательные, неподвижные, бескапсульные; требует дЛя роста Х и У факторов; на плотных средах формируют прозрачные мелкие колонии; гемолиэ отсутствует. Штамм образует уреазу, расщепляет ксилозу; образует индол, не имеет р-галактозидаэы и не утилизирует орнитин (от носится к второму биотипу по Killian), На агаризованном экстракте мозга и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при 37 С образует мел— кие, круглые,, с ровными краями колонии. Колонии гладкие, блестящие, с агаром не срастаютсй. В мясо-пеп- 20 тонном бульоне культура не размножа ется. Оптимальная температура роста !

Способ осуществляют следующим образом 25

Пример 1, Получение рестрик. таэ Hin I I u Hin 1 II .из Haemophilus influenzae RFL I.

Ilоследовательность операций.

I. Культивирование штамма и полу- 30 чение биомассы.

II. Выделение и очистка рестрик. таз:

1 . Разрушение клеток

2. Хроматография ня фосфоцеллюлозе, 3.1. Очистка рестриктазы Н1п 1 I:

3.1.1. Фракционирование белков на голубой сефарозе.

3.1.2. Хроматография на гепарин- 4р сефарозе.

3.2. Очистка рестриктазы Hin 1 II:

3.2.1. Хроматография на ДЗАЭ-целлюлоз е, 3 ° 2, 2 ° XpoMaToI рафия на гепарин- 45 сефарозе, 1. Для получения биомассы Haemophilus influenzae RFL I используют аппаратуру: лабораторный ферментер

"Биолафит" (Франция), рН-метр, термостат, автоклав, круговые качалки, спектрофотометр СФ-2б, проточная центрифуга типа "llEIla" (ФРГ), бокс

; аминарный.

Для размножения и культивирования штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Brain Heart Infusion

"Difco",с добавлением Х и У факторов.

Питательная среда в своем составе!

1458388 содержит 3,7/ экстракта мозга и сердца теленка, 0,02Х никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и 0,1% гемина, рН 7,0. Сердечно-мозговой экстракт стерилизуют при 1 атм в течение

20 мин, раствор гемина — при 70 С в течение часа, раствор НАД вЂ” ультрафильтрацией.

Штамм Н. influenzae RFL I поддерживают в лиофильно высушенном виде при +4 С. Криозащитную среду для хранения культуры готовят отдельно следующим образом: раствор сахарозы и желатины стерилизуют,при 0,9 атм в течение 30 мин два раза через сутки и перед приготовлением бактериальной суспенэии в так приготовленный .стерильный раствор в асептических условиях добавляют такое же количество бычьей сыворотки.

Для оживления культуры в две пробирки с питательной средой (сердечно-мозговой экстракт, НАД и гемин) и две пробирки с мясо-пептонным бульоном (для контроля чистоTt» культуры) переносят лиофильно высушенную культуру, Пробирки инкубируют

18 ч при 37 С, затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и мясо-пептонным бульоном и помещают на круговые качалки при

80-100 об/мин. Через 18-20 ч культивирования проводят третий пассаж— для непосредственного засева ферментера: по 0,25-0,30 мл таким образом полученной суспензии клеток добавляют в две колбы с О, 25 л в каждой

° среда. Инокулят выращивают на термостатированных круговых качалках при 200 об/мин, 37 С в течение 1820 ч, Оптическая плотность суспенэии инокулята при длине волны 540 нм составляет 3,0-3,5 о.е. Полученный инокулят засевают в лабораторный ферментер "Биолафит", содержащий

I0 л питательной среды. Культуру

Н. influenzae RFL I выращивают при

37 С, рН 7,0-7,2 со скоростью перемешивания в первый час культивирования 150 об/мин и далее до 250 об/мин а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в первый час роста культуры с постепенным увеличением до

5 л/мин на б-м часу роста. Заданную рН во время выращивания культуры поддерживают добавлением насыщенного, раствора бикарбоната натрия °

58388 б

3а условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за

1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага лямбда.

Все операций но выделению и очистке фермента проводят при +4 С.

1» Разрушение клеток. 30 r био-..

10 массы, полученнои при культивировании Н. influenzae RFL I суспенго 0,1 И НаС1, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т в

15 течение 15 мин и центрифугируют при

20000 об/м н на центрифуге Бекман

Ж-21Ц, ротор ЖА-20.

2. Хроматография на фосфоцеллюлозе. Полученный бесклеточный экстракт

20 со скоростью 30 мл/ч наносят на ко30

5 14

Во время культивирования периоди" чески отбирают пробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток;

Культивирование штамма проводят до поздней логарифмической фазы ростаоптическая плотность суспензии клеток составляет 1,8-2,5 о.е. (длина волны

540 нм).

Культуральную жидкость охлаждают до +4 С и центрифугируют на проточной центрифуге типа ЦЕПА при 2,5 10> об/

/мин. Полученную биомассу хранят при

-20 С. Выход сырой биомассы 2,5-, >

3,5 г/л культуральной жидкости.

ХХ. Для выделения и очистки рестриктаз используют следующую аппаратуру: ультразвуковой дезинтегратор

УЗДН-2Т, центрифугу Бекман Ж21Ц, холодильную камеру "Миниколдлаб", хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания.

ДНК фага лямбда выделена по известной методике (Salto Н., Miura 2

К.I. B ochem. Biophya Acta, 1963, 72, 619-629).

При разрушении клеток и хроматографии используют буферный раствор (В): 10 мМ калийфосфатный буфер рН

7,4, содержащий 10 мМ 2-меркаптоэтанола. дируют в 100 мл буфера В, содержащелонку размером 2,5<15 см с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером

В, содержащим О, 1 M NaC1. Колонку промывают 150 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом NaC1 от О, 1 до 1,0 M в 500 мл буфера В.

Отдельно собирают фракции, элюируемые при 0,25-0,36 М NaC1 содержащие основную часть активности рестриктазы Hin 1 I и фракции, элюируемые при 0,58-0,7 M содержащие активность рестриктазы Hin 1 II. Далее очистку рестриктаз Hin 1 I u Hin 1 II провоАктивность рестриктаз тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим . разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой

Hin 1 I содержит 10 MM трис-НС1 рН

8,5, 25 мМ NaC1, 5 MM ИяС1

100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37ОС 5 мин. Реакционная смесь для гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазой Hin.! II содержит

10 мМ трис-НС1 рН 8,5, 50 мМ NaC1, 10 мМ MgC1 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента.

Реакцию проводят при 37 С 10 мин. о

Электрофорез проводят в 0,1 М натрийборатном буфере рН 8,2, 2 мИ

ЭДТА в течение 2 ч при напряжении

100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете, 35

55 дят отдельно.

3.1. Очистка рестриктазы Hin 1 I.

3.1.1. Фракционирование белков на голубои сефарозе.

Фракции, содержащие активность рестриктазы Н1п 1 I, объединяют и диализируют в течение 16 ч против буфера В, содержащего 0,2 М NaC1

Ферментный раствор после диализа со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 10 см с голубой сефарозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М 11аС1, и промывают

60 мл того же буфера. Собирают элюрт, содержащий основную часть рестриктазной активности (фракции I).

3.1.2. Хроматография на гепаринсефарозе.

Фракцию 1 со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 7 см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М NaC1, промывают тем же буфером (30 мл) и элюируют линейным градиентом концентрации NaC1 от 0,2 до 0,6 M в

240 мл буфера В. Фракции, элюируемые

5 .-GCG CATG ССС, 3 -ССС <;TAC) Сса, / 14583 1ри 0,3-0,4 М NaC1, объединяют и ферМентный препарат концентрируют путем диализа против буфера В, содержащего

0,1 M НаС1, 0,1 MM ЭДТА и 501 глиВ

Церина (по объему) . Ферментный прег1арат хранят при -20 С. Из одного грамма биомассы получают 15000 еди« иц активности рестриктазы Hin 1 I.

3.2. Очистка рестриктазы Hin 1 II, 0

3.2.1. Хроматография на ДЭАЭ-целт юлозе.

Фракции, содержащие активность естриктазы Hin 1 II, объединяют и иализируют в течение 16 ч против уфера В. После диализа раствор фермента центрифугируют при 20000 об/мин

« а центрифуге Бекман >К-21Ц, ротор

-20.

Полученный супернатант со скорос — 20 ью 20 мл/ч наносят на колонку разме— ом 1,5 15 см с ДЭАЭ-целлюлозой, равновешенной буфером В„npoMbIBatoT тим же буфером (80 мл) и элюируют нейным градиентом NaC1 от 0,0 до 2В ,5 М в 280 мл буфера В. Фракции, элюируемые при 0,04-0,12 М NaCl, фбъединяют; они содержат. основную часть рестриктазной активности (фрак1) . 30

3. 2. 2. Хроматография на. гепаринСефароз е, Фракпию 1 со скоростью 20 мл/ч найосят на колонку размером 1,5 6 см

С гепаринсефарозой, уравновешенной буфером В, содержащим О, 1 М 11аС1, 1 ромывают 30 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом конценТрации NaC1 от 0,1 до 1,0 М в 120 мл буфера В. Фракции, элюируемые при 4О

0,Ü8-О,8 M NaC1, объединяют и ферМентныи препарат концентрируют путем циализа против буфера B содержащего

U,1 1 NaC1, О,! мМ ЭДТА и 50Х глицерина (по объему). Ферментный препа- 45 рат хранят при -20 С. Из одного грамма биомассы йолучают 1000 единиц активности рестриктазы Hin 1 II.

Определение последовательностей нуклеотидов, узнаваемых рестриктаза- gp ми Hin I u Hin 1 II.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Н).п 1 I, использовали ДНК фага лямбдa. .11роведено расщепление этой

ДНК рестриктазой kin 1 I, рестриктазой А ha II (которая узнает и расщенляеT последовательность нуклеотид< 5 -GPuCGPyC-3 ) и совместно

88

b этими рестриктазами. Во всех случаях электрофореграммы совпадают с элект-. рофореграммой, полученной после обработки ДНК фага лямбда только. рестриктазой Hin 1 I. Это указывает на то, что эти рестриктазы являются изошизомерами, т.е. расщепляют после.,I довательность нуклеотидов 5-GPuCGPy(:-3.

Для подтверждения узнаваемой последовательности нуклеотидов и определения места расщепления проводили частичный гидролиз 5 — Р мечен .

l 31 ных Hin 1 I фрагментов ДНК pBR322.

Двухмерное разделение полученного гидролизата электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией в тонком слое ДЭАЭ-целлюлозы привело к фингерпринту, из которого выявлено, что гомологичной последовательностью в участке расщепления явчяются тетрануклеотиды 5 -CG(T/Ñ)С-3 . .Следовательно, рестриктаза Hin 1 I раст щепляет узнаваемый участок между вторым и третьим основаниями, образуя фрагменты с 5 -выступающими липкими концами:

5 -GPuCGPy С-З ;

3 -CPyGCPuG-5, Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Hin 1 II, использовали ДНК фагов ф «1 74, и й и плаз миды р BR322 с из вестнои первичной структурой. Их обрабатывали рестриктазой Hin 1 II и полученные данные о числе и длине фрагментов сравнивали с табличными (Fuchs C. et al Gene (1978), 4, 1-231

Fuchs С. et al Gene, 1980, 10, 357370). Сравнение этих результатов позволило обнаружить, что последовательность нуклеотидов 5 -CATG узнаваемая рестриктазой Nla III, имеет такую же частоту встречаемости на использованных субстратах, как и Hin 1 II. Из этого делали предположение, что рестриктаза Hin 1 II обладает идентичной субстратной специфичностью с рестриктазой Nla III. Окончательное подтверждение специфичности исследуемой рестриктазы было получено после определения места расщепления субстрата. Для этого использовали самокомплементарныи синтетический декадвзоксинуклеотид, содержащий участок, узнаваемый исследуемым ферментом:

9 14583

После введения 5 — Р— концевой метки двухспиральный субстрат обрабатывали рестриктазой Hin 1 II и меченные продукты рестриктазной реакции анализировали в тонком слое ДЭАЗцеллюлозы. В параллельной дорожке анализировали частичный 3 -экзонуклеаэный гидролизат этого же меченно- . го декануклеотида, входящего в сос- 10 тав исследуемого дуплекса. Единственным меченным. продуктом расщепления оказался гептануклеотид 5 - pGCGCATG.

Полученные результаты свидетельствуют, что рестриктаза Hin 1 II расщепляет субстрат

5 -CATG-3 ;

3 -СТАС-5, ф в местах, указанных стрелками.

Составитель И. Ходарев

Редактор А. 31ежнина Техред М.дидык Корректор М, демчик

Заказ 326/29 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ получения эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью уз- 2В навать и расщеплять последователь.ности нуклеотидов 5 -GPuCGPyC-3 и

j5 -САТС-3,включающий культивирование продуцента до достижения заданной плотности клеток на жидкой пи- 30 тательной среде, содержащей сердечномозговои экстракт и факторы биосинте"

88 10 за фермента, разрушение клеток ульт;т развуком и последующее получение це" левого продукта с использованием хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе в калийфосфатном буфере и элюции ферментов градиентрм хлористого натрия, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения способа получения и повышения выхода целевых продуктов, в качестве продуцента используют штамм Haemophilus

influenzae ВКПМ В-4035, после хрома1 тографической очистки рестриктаз, разделяющихся на фосфоцеллюлозе, осуществляют дополнительную очистку для рестриктаэы, узнающей и расщепляющей

I последовательность нуклеотидов 5—

-GPuCGPyC-3, путем хроматографии на голубой сефарозе и гепаринсефарозе с элюцией фермента буфером, содержащим 0,2 M NaCl, при хроматографии на голубой сефарозе и градиентом

NaCl 0,2-0,6 М при хроматографии на гепаринсефарозе, а хроматографическую очистку рестриктаэы, узнающей . и расщеплякицей последовательность нуклеотидов 5 -CATGс3, осуществляют на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе с элюцией фермента градиентом NaCl

0,0-0,5 М и 0,1-1,0 М NaC1 соответственно.