Штамм бактерий viвriо сноlеrае сноlеrае серовара инаба, используемый в качестве продуцента холерного токсина

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении холерного токсина. Цель изобретения - повьш1ение продукции токсина. Новый штамм - продуцент токсина , получают путем введения гибридной плазмиды в клетки высокотоксигенного штамма V. cholerae cholerae 569 В Инаба. Штамм депонирован под номером КМ76 рС0107-2. При вьфащивании штамма в питательной среде получают 30-40 мг TOKCHHa.l1 л культурального фильтрата. а (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1460075 д1 (5В 4, С 12 N 1/20 //(С 12 N 1/20

С (2 R 1:63) P-."L..ИЗНМ : . Д». д(ЛЛ6М ., 1я311", .) . Е:- А

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ (2() 4255922/28-13 (22) 09.04.87 (46) 23.02.89. Бюл. Р 7 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (72) Н.И. Смирнова, Л.Ф.Ливанова, А.Л.Гинцбург, Н.В.Янишевский, Ю.В.Вертиев и Т.С.Ильина (53) 576.8.093 ° 1(088.8) (56) Mekalanos Т., Sublett R., Roming W. Genetic mapping of toxin regulatory mutations in Vibrio chole-.

rae — J. Bacteriol 1979, v. 139, 9 3, р. 859-865.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению штамма. холерного вибриона классического биовара серовара Инаба, продуцирующего токсин, Цель изобретания — повьппение продуКции токсина.

Штамм холерного вибриона классического биовара серовара Инаба получают путем введения гибридной плаэмиды рСО107-2, содержащей оперон vct, контролирующий синтез холерного токсина, в клетки Vibrio cholerae chmlerae 569 В Инаба. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института "Микроб" под номером КМ 76/

/pCOi07-2.

Характеристика штамма V. сЬо1егае

cholerae KM76 рС0107-2 Инаба. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE

СНОЬЕВАЕ CEPOBAPA ИНАБА ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТА ХОЛЕРНОГО ТОК-

СИНА (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении холерного токсина. Цель изобретения — повышение продукции токсина. Новыи штамм — продуцент токсина, получают путем введения гибридной плаэмиды в клетки высокотоксигенного штамма Ч. cholerae cholerae .

569 В Инаба. Штамм депонирован под номером КМ76 рСО107-2. При выращивании штамма в питательной среде получают 30-40 мг токсина..1 л культураль- с- ного фильтрата. ф

Культурально-морфологические признаки. Подвижные грамотрицательные Пиал палочки. Хорошо растет на простых фф полноценных средах и на средах с тет- фф рациклином (5-10 мкг/мл) и канами- 1", цином (50 мкг/мл), формируя на плотных средах типичные для холерного вибриона колонии

При посеве в жидкие среды вызывает © равномерное помутнение бульона.

Прототроф.

Физиологические свойства. Относят- ф ся к 1 группе Хейберга, ферментируя до кислоты беэ газа маннозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мп полимиксина.

1460075

Формула

Чувствителен к холерному диапностическому фагу С.

Агглютинируется до титра холерными сыворотками 0 и Инаба. g

Патогенные свойства, Вирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10 10Э микр. тел.

Пример. Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae cholerae

КМ76 засевают на агар Хоттингера рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамицина, и инкубируют 18 ч при 37 С °

Для сопоставления способности продуцировать экзотоксин штаммом КМ76 и исходным штаммом 569 В используют метод пассивного иммунного гемолиза.

Колонии штамма КМ76 и 569 В переносят методом реплик на чашки с 1К-ным синказным агаром, содержащим 17. отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. Посевы инкубируют 18 ч при

30 С, заливают слоем 0,57.-ного синказного arapa, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецепторную антитоксическую сыворотку, инкубируют 1-2 ч при 37 С и. наблюдают зону гемолиэа вокруг макроколоний, продуцирующих токсин во внешнюю среду. Исходный штамм V. cho1erae cholerae 569 В продуцирует меньше экзотоксина, поэтому зона гемолиза вокруг макроколоний этого штамма меньшего размера, .чем у штамма КМ76 рС0107-2., Для количественного определения холерного экзотоксина используют иммуноферментный метод С,Е11БА и метод титрации токсина на кроликах — кожную пробу по Крейгу.

При иммуноферментном методе

С„,ELISA в качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Чувствительность метода С,ELISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. В соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших.в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают количество продуцируемого холерного токсина исследуемым штаммом КМ76. Штамм V. cholerae cholerae

КМ76 продуцирует 30-40 мг токсина на

1 л культурального фильтрата, тогда как у исходного штамма 569 В продукция токсина составляет 8-10 мг/л.

Для получения экэотоксина и титрации его в кожной пробе по Крейгу агаровые культуры штаммов V. cholerae

cholerae КМ76 и U. cholerae cho10 .lerae 569В, взятого в качестве эталонного штамма — продуцента токсина, засевают в пробирки казаминового (казаминовые кислоты

30 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, 15 рН 7,6) бульона с 2 мкг/л тетрациклина или с 20-50 мкг/мл канамицина. Культуру, выращенную при интенсивной аэрации (30 С), центрифугируют. Полученный супернант (экэотоксин)

2О титруют в кожной пробе по Крейгу на трех кроликах. Препарат раститровывают двукратно, начиная с концентрации 1:100, и вводят внутрикожно в количестве 0 1 мл. Учет проводят через

24 ч. В случае штамма КМ76 положительная реакция зарегистрирована в разведении 1:5000-1:6000, у штамма

569 — 1: 1600 — 1: 2000.

Полученные пробы экзотоксина про30 дуцируемого штаммом КМ76, испытывают на наличие холерогенного эффекта на крольчатах-сосунках: 10-12 дневным крольчатам весом 130-160 г внутрикишечно ввоцят препарат экзотоксина в объеме 1 мл. Через 24 ч у крольчат наблюдают положитепьный холерогенный эффект.

Изучение стабильности свойств .штамма КМ76 продуцировать повышенное

4g количество токсина показало, что добавление в среду выращивания канамицина (20 мкг/мл) или тетрациклина (2 мкг/мл) обеспечивает 100Х. стабильность данного признака у штамма КМ76.

45 Таким образом, использование нового штамма позволяет стабильно получать холерный токсин. изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae

cholerae серовара Инаба КМ76 р

С0107-2, используемый в качестве продуцента холерного токсина.