Способ определения молекулярной массы реплицирующейся днк у двудольных растений

 

Изобретение относится к биохимии растений, в частности к изучению молекулярных механизмов репликации ДНК у двудольных растений. Разработан способ определения молекулярной массы реплицирующейся ДНК у двудольных растений. Способ предусматривает получение протопластов путем обработки клеток растений раствором, содержащим пектомацерин Г-10х, целлюлазу, пектиназу и мембраностабилизирующие компоненты, и проведения импульсного мечения, лизиса, ультрацентрифугирования в щелочном градиенте сахарозы с последующим определением молекулярной массы. 3 табл.

CO03 COBETCHHX

ФЭ«Ю «

РЕС(1У6/ИК (l% (11)

А1 (g1)g С 07 Н 21/04

ГООУАМ ОТВЕККЫЙ КОМИТЕТ

ПО 1 306РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О t ;ПА

1 (21) 4327729/31-13 (22) 12.11 ° 87 (46) 30.05.90. Бюл. М 20 (7 1) Институт биохимии растений

АН ГССР (72) Г.И. Квеситадзе и b.À. Таварткиладзе (53) 581.2 (088.8) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ

МАССЫ РЕШ(ИЦИРУПайся ДНК У ДВУДОЛЬ НЫХ РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к области биохимии растений, в частности к иэучеИзобретение относится к биохимии, в частности.к изучению молекулярных механизмов репликации ЛНК двудольных растений.

Способ состоит в следующем. Приготовленный ферментный раствор, содержащий 3,5-4,5% пектомацерина, 1,5-2,0% целлюлазы, 0,4-0,67 пектинаэы и мембраностабилизирующие компоненты, пропускают черсз мембранный фильтр, в колбу с ферментным раствором помещают исследуемую культуру, выдерживают ее при 25-30 С в течение 12- 15 ч, далее после вторичной фильтрации раствор подвергают центрифугированию.

ДНК метятся Н-тимидином, после импульсной метки раствор центрифугируют и полученный осадок промывают.

Далее проводят лизис в детергенте по

Мальцу, фракционируют в щелочном градиенте сахарозы и определяют молеку.лярный вес каждой фракции. Константу седиментации S и молекулярный вес

2 нию молекулярных механизмов репликации ДНК у двудольных растений. Разработан способ определения молекулярной массы реплицирующейся ДНК у двудольных растений. Способ предусматривает получение протопластов путем обработки клеток растений раствором, содержащим пектьмацерин Г-10х, целлюлазу, пектинаэу и мембраностабилизирующие компоненты, и проведения импульсного мечения, лиэиса, ультрацентрифугирования в щелочном градиенте сахарозы с последующим определением молекулярной массы. 3 табл. частицы М определяют по Штудиеру, Расчеты S и М для каждой фракции градиента при ультрацентрифугированин Я

ДНК в щелочном градиенте сахаровы

° приведены в табл. 1.

Средний молекулярный вес подсчи- © тывают по формуле (.Ь

XF;- М(CR (1) QQ

Ф где Р; — радиоактивность -фракции;

М вЂ” молекулярный вес i-фракции, Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

II р и м е р 1. Культура табака.

Готовят ферментный раствор — взвешивают 4 г пектомацерина Г-10х, целлюлазы 2 r, пектиназы 0,5 г и последовательно растворяют в 100 мп бидистиллированной воды, добавляют 7,3 r Sorbitol, 1,1 r СаС1 1 н раствор доводят до, пН 5,5. Приготовленный раствор пропус1567585 кают через мембранный фильтр размером пор 0,24 мкм, В колбу с ферментным раствором помещают 15 г каллюсной культуры табака и оставляют на ,-о, 14 ч при 27 0. Суспензию пропускают через капроновый фильтр и центрифугируют 2 раза по 3 мин при 800 об/мин. Ha дне центрифужного стакана осаждают1 ся протопласты, которые далее метят H-тимидином (0,4 ИБк/мл, удельная активность 185 ГВк/мл) в 20 мл жидкой питательной среды по Иурасиге и Скуга, время мечения 5 ч. После импульсной метки раствор центрифугируют при

800 об/мин, супернатант выливают, а осадок промыв.ают в том же растворе

2 раза, 0,2 мл суспензии протопластов (концентрация 5 10 4 пр/мл) помещают на дно центриАужного стакана, добавляют О, 1 мл заранее приготовленного, лизирующего раствора по Иальцу (0,005 н. Na0M; 1/ додецильсульфат натрия, 0,21 дезоксихолат натрия, 0,006 Г! цитрат натрия, 0,05 Г1 ЭЛТА, рН 12), оставляют на 90 мин при комнатной температуре. После лизиса наносят на щелочные градиенты сахарозы, приготовленные заранее (начальная

5, конечная 30 ) Центрифугируют

30 на ультрацентрифуге на бакет-роторе при 42 000 об/мнн, 20 С, 150 мин, После остановки ротора осуществляют разделение Аракций. Каждую фракцию наносят на Аильтры, промывают фильтры 3 раза в ледяной 101-ной трихлор- 35 уксусной кислоте и 96 -ном этаноле, сушат и подсчитывают радиоактивность в стандартном сцинтилляционном растворе. В табл.2 приведено количество радиоактивности каждой фракции гра- 40 диента (время подсчета 1 мин), Подсчитывают ЕР;:1, = 14133, 128 .10 и

;ф . = 5188. Средний молекулярный вес

1 подсчитывают по Аормуле (1) — M < =

12,25 .10

Пример 2. Культура юкки.

Готовят Аерментный раствор: взвешивают 3,5 пектомацерина Г-10х, целлю-! лазы 1,5 r пектинаэы 0,4 r и последовательно растворяют в 100 мп бидистиллированной воды, потом добавляют 7,3 г Sorbitol, 1,1 r СаС1 и раствор доводят до рН 5,3. Дальнейшие определения проводят по техноло" гии и в релммах,описанных в примере 1.55

В табл.3 приведены количественные значения радиоактивности каждой фракции ДНК юкки, Подсчитывают: $1 ;И, 88261,327 1О Е = 3955,0; И w 22 3, 10 с

Таким образом разработан способ определения молекулярного веса реплицирующейся ДНК у двудольньг растений.

Способ может быть рекомендован для генетических исследований сельскохозяйственных культур.

Формула,изобретения

Способ определения молекулярной массы реплицирующейся ДНК у двудольных растений, включающий получение протопластов из растительных клеток в растворе, содержащем 3,5-4,5 пектомацерина Г-10, 1,5-2,0Ж целлюлозы, 0,4-0,6/ пектинаэы, 0,73Х сорбитола и О, 11_#_ СаС1, инкубацию протопластов в среде, содержащей зН-тимндин, лизис раствором детергента по Иальцу,,фракционирование в щелочном градиенте сахарозы и последующий расчет молекулярной массы по формуле где 7; — радиоактивность i-ой фракции, Г1; — молекулярная масса i-oA

Аракции.

Таблица 1

Фракция (от дна) Mi

2

4

6

8

11

12

13

14

16

17

18

19

1,8

5,4

8,9

12,5

16,1

19,6

23,2

26,8 .

30,4

33,9

37,5

41,1

44,6

48,2

51,8

55,4

58,9

62,5

66,1

69,7

63,3

55,5

48,2

41,6

35,6

30,1

25,2

20,8

16,9

13,4

10,5

7,9

5,8

4,1

2,7

116

0,86

0,37

0,10

0,0007

Таблица 2

1567585

Фракция

Количество радиоактивности

Р1, имп/мин

Количество радиоактивности

F i имп/мин

Фрак ция с

Таблица 3

Количество радиоактивности

F i импl мин фракция

Фракция

Количество радиоактивности

Fi, имп/мин

Составитель Т, Забойкина

Редактор М, Недолухенко Техред А.Кравчук Корректор О. Кравцова

Заказ 1300 Тирах 298 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

2

4

6

8

10

2

4

6

8

10

169

194

214

189

208

313

201

334

721

588

171

123

197

148

91 . 155

135

11

12

13

14

16

17

18

19

11

12

13

14

16

17

18

19

511

248

248

211

296

169

196

176

210

161

264

171

151

164

151

136

114

210