Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклональных антител к фактору некроза опухоли @ человека

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам гибридных клеток, секретирующих антитела определенной специфичности. Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего высокий уровень биосинтеза МонАТ с высокой константой связывания. Штамм БМВ - продуцент МонАТ к рекомбинантному ФНО получен от слияния миеломных клеток X6XAG 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом рекомбинатного ФНО. Слияние проводят при помощи полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, содержащим 10% по объему диметилсульфоксида в фосфатно-буферном растворе. Штамм культивируется в стандартных условиях и может перевиваться в виде асцита. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N 229Д. Продуцируемые МонАТ относятся к подклассу IGG1. Продуктивность в культуральной жидкости 80 мкг/мл, в асцитной жидкости 9 мг/мл. Константа аффинности 3,4 .10 9М -1.

союз соВетских сОциАлистических

РЕС ВЬЛИК (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ по изоБРетениям и отнРытиям

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4457187/30-13 (22) 08.07.88 (46) 15.08.90. Бюл. 9 30 (71) Институт биоорганической химии им. N.N.1×åìÿêèíà (72) Н.П. Беркова, В.Г. Коробко, О.Г. Шамборант, В . Н.Добрынин и С.A.×óâïèëî (53) 578.085. 23(088.8) (S6) Авторское свидетельство СССР

Ф 1507791, кл. С 12 Н 5/00, A 61 К 39/395, 1987. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS NUSCHЛ18 — ПРОДУ 11ЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ о, ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам гибридных клеток, секретирующих антитела определенной специфичности, Цель

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам гибридных клеток, секретирующих антитела определенной специфичности.

Цель изобретения — получение штамма, обеспечивающего высокий уровень синтеза МонАТ с высокой константой связывания, Штамм получают следующим образом.

Отмытые средой RPNI 1640 60 -млн. клеток селезенки смешивают с клеткамй миеломы в соотношении 1:1 и центрифугируют 10 мин, 200 к g. .Надосадбчную жидкость осторожно удаляют и к клеточному осадку по каплям добавляЩ)5 С 12 Н 5/ОО А 61 К 39/395

2 изобретения — получение штамма, обеспечивающего высокий уровень биосинтеза МонАТ с высокой константой связывания. Штамм БМ — продуцент МонАТ к рекомбинантному ФНО получен от слияния миеломных клеток Х6ХАя 653 со спленоцитами мышии. иммунизированной препаратом рекомбинантного ФНО. Слияние проводят при помощи полизтиленгликоля с молекулярным весом 4000, содержащим 107. по объему диметилсульфоксида в фосфатно-буферном растворе.

Штамм культивируется в стандартных условиях и может перевиваться в виде асцита. Штамм депонирован под номером

ВСКК(ЕЕ) 1(229Д. Продуцируемые МонАТ относятся к подклассу IgGI. Продуктивность в культуральной жидкости

80 мкг/мл, в асцитной жидкости

9 мг/мл. Константа аффинности 3 4»

1 х10з М ют в течение 1 мин 1 мл 50Х-ного раствора полиэтиленгликоля 4000 с lOX no объему диметилсульфоксида в фосфатном буфере рН 7,2. Затем в течение 5 мин добавляют 10 мл среды RPNI 1640 ив— течение еще 10 мин доводят объем среды в пробирке до SO мл. Клетки цен трифугируют в течение 3 — 5.мин, осторожно удалают надосадочную жидкость, а к осадку добавляют

50 мл среды КРИТ 1 &40, содержащей

lOX змбриональной телячьей сыворотки, 1 х 10 M гипоксантина, 4»10 N аминоптерина, 1,6 10 M тимидина,"

200 шМ 1.-глютамииа, суспендируют 1585329

30 клетки пипетированией и распределяют в 96-луночные нлейты по 50«10 клеS ток в 100 мкл среды в лунки, в которые sa день до слияния высаживают мышиные перитонеальные макрофаги (5 10 клеток в лунку)

Клоны гидридных клеток становятся заметными через 7-10 дней. Тестирование клонов проводят, когда клоны заполняют лунку на 20%. Положительные культуры клонируют методом предельного разведения в 96-луночных панелях на фидерном слое перитонеальных макрофагов, внося по 30, 300 и 30000 клеток на панель., Штамм депонирован под номером

BCKK(II) У 229Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

При культивировании во флаконах клетки прикреплены к субстрату. При посеве 3 10 — 1 10" кл./мл через

4-5 дней плотность клеток составляет

2-5 10 кл./мл.

Кратность рассева 5 раз.

Стандартные условия выращивания „

Среда RPNI-1640, .300 мг/мл l-глюта:мина, 1ОЙ эмбриональной телячьей сыворотки, 5 «1 О М меркаптоэтанола, 37 С, 5% СО .

Гибридные клетки перевивают и выращивают в виде асцитной опухоли в перитонеальной полости мьппей ВаЬВ/с.

За 10 дней до ввецения клеток мьппам предварительно вводят О 5 мл прнстана. При введении 2-5 млн. клеток через 14-20 дней обра=óåòñÿ асцит.

Характеристика МонАТ.

Штамм продуцирует МонАТ класса

IgGl. Выход МонАТ в культуральной жидкости 80 мкг/мл при плотности клеток 1 млн/мл, в асцнтной жидкости

9 мг/мл. Стабильность продуцирования

МонАТ сохраняется на. протяжении 5С пассажей в культуре.

Криоконсервирование.

Среда для замораживания 85% эмбриональной телячьей сыворотки, 15% диметилсульфоксида. Концентрация клеток

35«10 клеток/мл. Ампулы с клетками выдерживают при -70 С н течение недели и переносят в дюары с жидким азотом. Режим размораживания водяная баня при 37 С. Жизнеспособность клеток (65%) после криоконсервирования определена по окрашиванию с трипановым синим.

Контаминация.

Бактерии, грибы, микоплазмы вирусы отсутствуют .

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Иммуноферментный анализ МонАТ.

Образцы, содержащие антитела (супернатанты клеточных культур, либо асцитная жидкость), тестируют методом твердофаэного иммуноферментного анализа по связыванию с препаратом рекомбинантного ФНОо . В лунки 96-луночной плашки вносят по 200 нг белка в 50%-ном растноре концентрированной муравьиной кислоты в физиологическом растворе и оставляют на 18 ч при 4 С.

Плашку отмывают 0,1%-ным раствором твина 20 в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCI (ФСБТ), рН 7,2, инкубируют с 200 мкл

1%-ного раствора бычьего сынороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 37 С. Плашку отмывают 3-4 раза

ФСБТ и вносят в лунки по 50 мкл препарата, содержащего антитела. После инкубации в течение 1,5 ч при 37 С плашку отмывают ФСБТ и обрабатываюr раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгиронанных с пероксидазой хрена (50 мкл н лунку, разведение 1:1000, 1 ч при 37 С). Затем плашку отмывают и нносят 50 мкл раствора ортофенилендиамина (1мг/мл) н 1% ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05% Н О . Реакцию останавливают добавлением 50 мкл в лунку растнора 2 M серной кислоты.

Взаимодействие моноклональных антител БМВ с ФНО Ы, перенесенным на нитроцеллюлоэу после диск-электрофореэа н полиакриламидном геле, 13,5%.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использованием аппарата для вертикального электрофореэа, Лизат Escherichia coli и лизат продуцента ФНО Ан буфере для образца с меркаптоэтанолом прогревают 5 мин при 100 С и наносят н ячейки геля.

Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 35 мА.

Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм производят в приборе для полусухого иммуноблотинга н течение 1 ч. После пе5 1585329 6

Ц промывают дистиллированной внутрибрюшинно вводят 0,5 мл приставодой, затем помещают в 1 -ный раст- на . При введении 2-5 10 клеток чевор БСА на ФСБТ для блокировки неспе- рез 14-20 дней образуется асцит. цифической сорбции белка. Все инкуба- < После отделения клеток центрифуги ции проводят на аппарате с горизон- рованием (400 g) асцитную жидкость тальным перемешиванием. разбавляют до концентрации белка

По осле этого НЦ промывают в раство- 10 мг/мл, высалнвание и дальнейшую ре ФСБТ/Твин 3-4 раза, и помещают НЦ очистку иммуноглобулинов проводят, в культуральную жидкость, содержащую 10 как описано выше. антитела, на 4 ч при комнатной тем- Определение концентрации БМВ анти. пературе. Затем НЦ 3-4 раза промыва- тел в культуральной и асцитной жидют раствором ФСБТ/Твин и добавляют костях. кроличьи антимышиные антитела в В лунки 96-луночной плашки вносят ,ФСБТ с 1 BCA при разведении 1:1000, 15 по 250 кг кроличьих антител к IgG

Через 18 ч тщательно промывают НЦ ТБР мыши в 0,05 М бикарбонатном буфере, и проявляют реакцию в растворе суб- рН 9,6, и инкубируют 18 ч при 4 С. страта, содержащем 4-хлор-1-нафтол и Затем лунки плашки отмывают ФСБТ и

0,005Х Н О . Для хранения и фотогра- инкубируют с 200 мкл 1Х-ного BSA фирования НЦ промывают в дистиллиро- 20 (1 ч, 37 С) . После отмывки лунок ванной воде и высушивают на воздухе. ФСБТ по плашке раститровывают образПример 2. Получение и очист- цы, содержащие МонАТ (50 мкл) (в кака моноклональных антител. честве стандарта используют нормальПолучение и очистка БМВ антител ные мышиные: иммуноглобулины) и иниз культуральной и асцитной жидкости. 25 кубируют ),5 ч при 37 С. Далее ИФА

Гибридные клетки наращивают в плас- проводят, как описано в примере 1. тиковых матрасах в среде RPMI 1640, Концентрация моноклональных антител содержащей 10 /о ЭТС, 300 мг/л L-глу- в культуральной жидкости составляет тамина, 5 <10 Л меркаптоэтанола при

-Ь 80 мкг/мл, в асцитной жидкости 9мг/мл.

5 посевнои концентрации 3 «I O млн, 30 Определение константы связывания клеток/мл. Максимальная продукция МонАТ БМВ с ФНО c(, иммуноглобулинов через 5-6 дней сос- Константу связывания определяют тавляет 80 мкг/мл. Антитела, находя- при помощи ИФА по уравнению К = щиеся в культуральной жидкости, осаждают сульфатом аммония (27,7 г на 4МА — 2МАВ

100 мл культуральной жидкости), про- ция антител, соответствующая 50 мывают 0,2 M сульфатом аммония, даль- связыванию от максимального, МАВ— нейшую очистку иммуноглобулинов осу- концентрация антител, соответствующествляют при помощи аффинной хрома- щая 50Х связыванию от максимального тографии с использованием ФНО, им- 40 в случае нанесения на плашку вдвое мобилизованного на бромцианактивиро- меньшего количества антигена. На лунванной сефарозе: осажденные сульфа- ку плашки наносят соответственно 1 том аммония образцы наносят на колон- и 2 мкг ФНО а и ИФА проводят,как в ку объемом 5 мл, колонку промывают примере 1. Константа связывания антифосфатно-буферным раствором, содер- 4 тел с ФНО о(составляет 3,4 10 М .. жащим 0,5М NaC1, рН 7,4. Специфичес- Использование штамма позволяет кие иммуноглобулины элюируют буфером получать антитела в количестве глицин/НС1, рН 2,8. Элюат сразу же 80 мкг/мл культуральной жидкости нейтрализуют 1 M раствором трис, рН (в прототипе 1 4-20 мк г/мл), кон11 Раствор иммуноглобулинов диали- станта аффинности. 3,4 «10 s M. (в проэуют против забуферного физиологичес- тотипе — 2,9 10 М ) . кого раствора, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофоре- Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я за в 10 -ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Штамм гибридных культивируемых

При получении иммуноглобулинов из. клеток животныхMus musculus BCKK(II) асцитной жидкости гибридные клетки У 229Д вЂ” продуцент моноклональных прививают мышам линии BaLB/с. За 10- антител к фактору. некроза опухоли

14 дней до инъекции клеток мышам . Q человека.