Способ получения автолизата дрожжей-сахаромицетов

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве игристых вин. Цель изобретения - повышение качества автолизата. Способ заключается в том, что процесс автолиза ведут в два этапа : на первом этапе дрожжи выдерживают в течение 6-12 ч в растворе хлористого калия или хлористого кальция или бикарбоната калия, или этилендиаминтетрауксусной кислоты концентрацией 0,1-0,15 М при PH 7,5-10,5 и температуре 20-50°С

на втором этапе дрожжи выдерживают также 6-12 ч в буферном растворе при PH 4,5-6,5 и температуре 42-60°С. После отделения оба автолизата объединяют и очищают от низкомолекулярных веществ. За счет оптимальных условий действия протеолитических ферментов концентрация общего азота в автолизате увеличивается в 2,0-2,5 раза, а концентрация белкового и пептидного азота - в 20-22 раза. В автолизате сохраняется активность гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабилизацию. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4487045/30-13 (22) 27.09.88 (46) 15,11.90, Бюл, Р 42 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт винограда и продуктов его переработки "Магарыч" .(72) Е,Н.Датунашвили, В,M.Степанов, Г.Н.Руденская, В,Г.Гержикова, А.К.Полонская, В.А.Бойко и В.М.Бойко (53) 663.14(088.8) (56) Патент США N- 4218481, кл. А 23 J 1/18, 1980.

Проект технических условий на автолизат дрожжей Дитонского университета, Франция, 1988. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВТОЛИЗАТА

ДРОЖЖЕЙ-САХАРОМИЦЕТОВ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве игристых вин. Цель изобретения — повышение качества.автолизата. Способ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения автолизата дрожжей, и может быть использовано в винодельческой промышленности при производстве игристых вин.

Цель изобретения — повышение качества автолизата.

Способ заключается в том, что на первом этапе продолжительностью 612 ч дрожжи-сахаромицеты выдерживают в растворе экстрагента, в качестве которого применяют раствор хлористо„„SU„„1606528 А 1

Щ)5 С 12 N 1/06, А 23 J 1/18//

// (С 12 N 1/06 С 12 Б. 1:86 заключается в том, что процесс автолиза ведут в два этапа: на первом этапе дрожжи выдерживают в течение

6-12 ч в растворе хлористого калия или хлористого кальция,или бикарбоната калия, или зтилендиаминтетрауксусной кислоты концентрацией 0,1-0,15 М при рН 7,5-10,5 и 20-50 С; на втором этапе дрожжи выдерживают также

6-12 ч в буферном растворе при рН 4,56,5 и температуре 42-60 С. После отделения оба автолизата объединяют и очищают от низкомолекулярных веществ.

3а счет оптимальных условий действия протеолитических ферментов концентрация общего азота в автолизате увеличивается в 2,0-2,5 раза. а концентрация белкового и пептидного азота в 20-22 раза. В автолизате сохраняется активность гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабилизацию. 2 табл. го калия или хлористого кальция, или бикарбоната калия, или ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 М, поддерживая рН 7,5-10,5 и температуру 20-50 С. о

Полученный автолизат, содержащий продукты гидролиза, под воздействием протеиназы Х (пептиды и аминокислоты) отделяют от дрожжей, а последние помещают в другой экстрагент— буферный раствор (например,. ацетатный, универсальный и др.}, обеспечивающий условия активного действия протенназы II. На втором этапе про3 )606528 должительностью 6-12 ч дрожжи выдерживают в буферном растворе при РН

4,5-6,5 и температуре 42-60 С. Полученный автолизат отделяют от дрожжей

5 одним из известных способов, например центрифугированием, и объединяют с автолизатом, полученным на первом этапе, а затем смесь очищают от низкомолекулярных веществ одним из известных способов, например диализом. Наиболее эффективной является вьдержка дрожжей на первом этапе автолиза при . РН 9,0 и температу :.

37 С а на втором этапе — при p1- 5, 9 ь и температуре 50-55 С. Полученный в результате применения предлагаемого способа автолизат характеризуется высоким содержанием азота, разнообразием его форм, а также ценными био- 20 логическими свойствами, обеспечивающими стабилизацию вин против коллоидных помутнений.

Сравнительная характеристика автолизатов по концентрации азотистых . 25 веществ и протеолитической активности приведена в табл.1.

Пептиды и белки являются поверх=, ностно-активными веществами, которые играют решающую роль в формировании пенистых свойств игристых вин, поэтому при разработке предлагаемого способа стремились получить автозщзат с повьппенным содержанием пептидного и белкового азота.

Кроме того, что протеолитические ферменты целесообразно использовать в виноделии для стабилизации вин против коллоидных помутнений.

В автолизате, полученном по пред- 4 лагаемому способу, протеолитические ферменты (протеиназы I и II) сохраняются в активной форме, благодаря чему при введении такого автолизата в шампанизируемое кюве не только по- 45 вьппаются пенистые свойства шампанс- кого, но и достигается стабилизация его против коллоидных помутнений за счет использования активности собственных ферментов дрожжей.

Пример 1 (по известному спо.собу). Дрожжи осажденные расы Феодосия 1-19 вида Saccharomyces cerevisiae в количестве 100 г помещают в

500 см 10Х-ного спиртового раствора

55 с РН 5 0 и в течение 18 ч выдерживаi ют при 45 С. Затем смесь центрифугируют. В отделенном от дрожжей автолизате определяют активность протеолитических ферментов по гидролизу

1 аэоказеина и концентрацию различных форм азота (опыт 1 табл.2). Затем проводят инактивацию ферментов термическим шоком при 75ОC. Измерения показывают, что протеолитическая активность в автолизате исчезает (опыт 2 табл. 2), Пример 2 (предлагаемый способ при оптимальных режимах). Осажденные дрожжи расы Феодосия 1-.19

Saccharomyces cerevisiae в количестве

100 r помещают в 250 см 0,1 N раст-. вора бикарбоната калия, доводят РН смеси до 9,0 1 н, щелочью NaQH и в течение 12 ч выдерживают в термостате при 37 С, после чего. дрожжи отделяют центрифугированием- от полученного автолизата, помещают в 250 см

0,2 М ацетатного буфера с РН 5,0 и в течение 12 ч выдерживают в термостате при 55 С. Затем смесь центрифугируют и отделенный от дрожжей автолизат ббъединяют с автолизатом, по; лученным на первом этапе. Для отделения низкомолекулярных веществ (солей, кислот и т.д.) проводят диализ смеси. В полученном автолиэате концентрация азота составляет, мг/дмз: общий 430; аминный 100; пеп» тидный и белковый 201; активность протеолитических ферментов составляет

10 2 ед/г (опыт 3 табл.2).

Пример 3. Способ осуществля.ют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но в качестве источника азотистых веществ и протеолитическнх ферментов используют молодые винные дрожжи расы Феодосия 1-19, отделенные от бродящего виноградного сусла во время экспоненциальной фазы их роста. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм общий 432, аминный 98; пептидный и белковый 205; активность протеолитических ферментов составляет

12 0 ед/г (опыт 4 табл.2), Пример 4. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но в качестве источника азотистых веществ в протеолитических ферментов используют осажденные винные дрожжи расы 47-К. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм : общий

435; аминный 96; пептидный и белко6528

5

16О вый 212, протеолитическая активность составляет 10,5 ед/г (опыт 5 табл,2), Пример 5.- Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и и в примере 2, но в качестве экстрагирующего раствора на II этапе автолиза используют универсальный буфер с рН 5,0. В полученном автолизате концентрация азота составляет, мг/дм: общий 428; аминный 98; пептидныи и белковый 200; активность протеолитическнх ферментов составляет 10,4 ед/г „опыт 6 табл.2), Пример 6. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением .тех же режимов, что и в примере 2, но на I этапе автолиза для улучшения проницаемости дрожжевых оболочек и экстракции продуктов гидролиза дрожжевого белка в растВор вводят различные реагенты, применяемые для этих целей в практике биохимии: 0,05-0,5 M KC1; 0,050,5 М СаС1, 0,05-0,5 М ЭДТА; 0,50,5 М NaCl 20 -ный ацетон; 20%-ный хлороформ; 20 -ный толуол; 20%-ный этиловый спирт (опыты 3, 7-?3 табл.2).

Лучшие результаты получены при использовании ЗДТА, солей хлорида калия хлорида кальция, бикарбоната калия в концентрациях не менее 0,1 М, В по-. лученных автолизатах концентрация азота составляет, мг/дм : общий 380430; аминный 46-100; пептидный и белковый 156-?12 9 протеолитическая активность составляет 8,2.-12,0 ед/г (опыты 3, 7-13 табл.2). В вариантах предусматривающих использование указаннъ х экстрагBHTQB в меньших концентрациях (опыты 20-23 табл.2) и других реагентов (опыты 14-19 табл.2), получены автолизаты с недостаточной концентрацией азотистых веществ и незначительной протеолитической активностью. Так, концентрация общего азота в них составляет 10-230 мг/дм

s аминного азота 0-40 мг/АР, пептидно го. и белкового азота 0-100 мг/дмз; протеолитическая активность составляет 0-4,5 ед/г.

Пример 7. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют продолжительностью вьдержки на обоих этапах приготовления автолизата (опыты 24-29 табл.2), Снижение времени выдержки до б ч при одвт к снижению качества автолизата на 40-47, которое выра.жается в концентрации общего азота .234-287 мг/дм ; аминного азота 475. 50 мг/дм, пептидного и белкового азота 92-96 мг/дмэ и активности протеолитических ферментов 5,2-5,4 ед/г (опыты 24-26 табл.2) . Дальнейшее снижение вьдержки приводит к потере качества автолизата íà 501 и более и выражается в концентрации общего азота 162-212 мг/дмз, аминного азота

32-44 мг/дмь, пептидного и белкового азота 68-77 мг/дмЭ и активности протеолитических ферментов 3,0-4,8 ед/г (опыты 27-29 табл.2)..

Пример 8, Способ осуществляют в той же последовательности и с

2О соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют величиной рН на первом этапе автолиза. Для этого доводят экстрагирующий раствор до рН 7,0; 7,5; 9,0; 10,5; 11,0 (опыты

25 3, 30-34 табл.2) . Результаты показывают, что автолизаты, приготовленные при рН 7,5-10,5, на первом этапе содержат концентрацию общего азота

212-430 мг/дм, аминного азота 651 00 мг/дмэ, пептидного и белкового азота 150-201 мг/дм, а активность протеолитических ферментов составляет 5,0-10,2 ед/г (опыты 3, 31-32. табл.2). Дальнейший сдвиг рН в щелочную или кислотную зону приводит к снижению концентрации азотистых веществ и протеолитической активности более, чем на 50 от величины этих показателей при оптимальном рН 9,0

40 (опыты 30,33 табл,2), Пример 9. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют величиной

45 рН на втором этапе автолиза. Для этого доводят экстрагирующий раствор до рН 4,0; 4,5; 5,0; 6,5; 7,0 (опыты 3, 34-37 табл.2). Результаты показывают, что автолизаты, приготовленные при рН 4,5-6,5 на втором этапе, содержат концентрацию общего азота

198-430 мг/дмЗ, аминного азота 52—

100 мг/дм, пептидного и белкового азота 158-201 мг/дм, а активность

Ь протеолитических ферментов 5,51 О, 2 ед/г (опыты 3, 35-36 табл.2).

Дальнейший сдвиг рН в щелочную или кислотную зону приводит к снижению протеолитической активности и кон) 606528

25 центрации азотистых веществ более, чем на 50 от величины этих показателей при оптимальном рН 5,0 (опыты 34, 37 табл,2).

П р и.м е р 10. Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьируют температурой на первом этапе автолиза, Для этого температуру доводят до 18, 20, 37, 50 и 52 С (опыты 3, 38-41 табл.2).

Результаты показывают, что автолизаты, приготовленные при температурах

20-50 С на первом этапе автолиза, содержат концентрацию общего азота 182-430 мг/дмэ, аминного азота 60100 мг/дм, пептидного и белкового азота 104-201 мг/дгР, а активность протеолитических ферментов 6,010,2 ед/г (опыты 3, 39-40 табл.2).

Автолиз при температуре ниже 20 С и выше 50 С снижает протеолитическую активность и концентрацию азотистых веществ в автолизате более, чем Hà 50% от величины этих показателей при оптимальной температуре

37 С (опыты 38, 41 табл.2).

Пример 11, Способ осуществляют в той же последовательности и с соблюдением тех же режимов, что и в примере 2, но варьирует температурой на втором этапе автолизат. Для этого температуру доводят до 40, 42, 55, 60 и 62 С (опыты 3, 42-45 табл.2).

Результаты показывают, что автолиза35 ты„ приготовленные при 20-50 С на втором этапе автолиза, содержат концентрацию общего азота 200-430 мг/дм аминного азота 54-100 мг/дм, пептид- 40 ного и белкового азота 98-201 мг/дмз, а активность протеолитических ферментов 5,4-10,2 ед/г (опыты 3, 43"44 табл.2). Лвтолиз при температуре ниже 42 С и выше 62 С снижает протеоли- 15 тическую активность и концентрацию азотистых веществ в автолизате более, чем на 50% от величины этих показателей при оптимальной температуре 55"С (опыты 42, 45 табл.2).

Характеристика автолизата дрожжей в зависимости от режима автолиза приведена в табл,2.

Из данных табл.2 следует, что на осуществление предлагаемого способа раса дрожжей-сахаромицетов и их физиологическое состояние не оказывают существенного влияния. Снижение времени автолиза до 6 ч на каждом в отдельнбсти или на обоих вместе этапах ведет к незначительной потере концентрации азотистых веществ и протеолитической активности (теряется 10-45 по сравнению с вариантами с выдержкой 12 ч), а дальнейшее снижение времени автолиза ведет к потере 50, что снижает ценность полученных автолизатов, Выбор режимов (температура, рН) проведен из соображений экономической целесообразности, которая заключается в следующем: внесение в игристое вино автолизата с концентрацией пептидного и белкового азота не менее 80 мг/дм обеспечивает повышение его пенистых свойств не менее, чем в 1,5 раза, применение же автолизата, с меньшей концентрацией пептидного и белкового азота для достижения таких же пенистых свойств потребует недопустимого разбавления вина. Из применяемых на первом этапе автолиза реагентов лучшими являются хлористый калий, хлористый кальций, бикарбонат калия и ЭДТА в концентрации 0,1-0,15 М. Для создания рН на втором этапе автолиза природа применяемого буфера не имеет значения.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в повышении активности протеолитических ферментов дрожжей в 2-2,5 раза за счет оптимизации условий их действия и, как следствие, повышение качества автолизата за счет обеспечения перевода в автолизат максимального количества азота, представленного значительно большим, чем в известном, разнообразием. Так, концентрация общего азота увеличивается в

2-2,5 раза, а пептидного и белкового азота — в 20-22 раза. Кроме того, исключение термической обработки автолизата позволяет сохранить его биологи ески ценные свойства, заключающиеся в сохранении активности гидролитических ферментов дрожжей, которые воздействуя на биополимеры вин, обеспечивают их стабильность.

Формула изобретения

Способ получения автолизата дрожжей-сахаромицетов, предусматривающий выдерживание дрожжей в растворе экстрагента и отделение автолизата отдрожжей, отличающийся тем

1606528

l0 что, с целью повьппения качества автолизата, выдерживание дрожжей осуществляют в два этапа, продолжительность

6-12 ч каждый, при этом на первом эта(ге в качестве экстрагента используют раствор хлористого калия или хлористого кальция, или бикарбоната калия, или этилендиаминтетрауксусХарактеристика автолизата

Способ

Известный Предлагае210 215-435

105 46-100

45 86-212

0 5,0-12,0

Т а 6 л В зз а 2 ге рак терзвстзаа актолмеата

tawe assaaasa

Раса и фаэа рее ва дроииеД

Ьомпеитрапми аэота, мт/дм Э лк тик зюста

ЗЗРО ТЕОЛЗЗТИ

° ескмк Оер"

МЕ ИТОЭ, ед/r

Тевозература, rC

Ьр Идар км, а

Экс тра гмрумиид рас теор обюзп ЛиииюИВ оептидЗИЗЙ И белкоэвав

1 этап Н этап

1 этап !I этап 1 этап 11 этаи

1 этап II этап

50 45

102 зиив.

ИОДМОслмрто«мд

1 Феодосие -1-19 осаидаиие (aa» толи тат ло пока) 2 феодосмд 1-19 осалдамзизе (аи тоаиэат посла те рэююка )

З фе 1-19

Осеидаииме

210 105 45

50 45

1О,2

1оо го1

37 55: 430

5,0

9,0

12 12

О,1М йЯСОэ лпетат» а 67Фер

Зг,о е

5,0

9зо

12 12

4 феодосие 1-19 а экспоиамзаз° лэиоо фаэа рОс ta

5 Раса 47-8

Осаидеюизе б Феодосик 1 19

Осаидеюиве

37 55 435

12 12 90

96 212

98 200

1О,5 е

s,о

So 37

1О,4

55 428

12 12 90

Уимаерс юаВ буфер лпе тат» ивав буфер

О,ЗМ

«йсоэ

5,0 37

1О,О

92 !8S

12 12

9,0

O,1М кс1

37 55 З98

8,2

65. 160 е

s,о

9зо

12 ° 12

12 12 9зо 5зо

9 6

1О

llt8

98 208

94 188

67 1$6

SO, 19В

s,î

9,0

l0 2

5,0

9,О

9„o

5ЗО

8,2

12

13 е

9 f

9,0 5,0

2.7

32 75

s,î

9,0 е

2ЗS

5,0

9,0

90 50 о,в

16 а

S5 124

01М сас1с

0 1 эДТЛ

0,5 М бансов

О,5М

КС1

O,5м

Сага

0 5м эдтл

O,1М даог о,s и

WCI

2(12Юзй

Концентрация азота, мг/дм общего аминного пептидного и белкового

Протеолитическая активность, ед/г

12, 12

12 12

12

1г 12

12 12

1г 1г

12 12 ной кислоты в концентрации

0,10-0,15 М при рН 7,5-10,5 и температуре 20-50 С, а на втором — буферный раствор при рН 4,5-6,5 и тер1пературе 42-60 С, а после отделения от дрожжей оба автолиэата объединяют и очищают от ниэкомолекулярных веществ.

Таблица 1

210 98 48 4З2

37 55 432 98 205

37 $5 380 46 102

37 SS 430

37 5$ 400

37 SS 395

37 55 380

37. 55 166

37 $5 168!

606528

Продолжение табл. 2 — 1

Ревни автопиэа

Paca N фаэ та дровней рактеристнка автопизата ипеитрацнп азота, иг/3паэ

Об и Пе ид

BblA Н ивовый

L Актив ности п ротеопнтнческик фериентов ед/r еипература, аС

1 ) агир3ащнй створ

an II эт ап 11 эт этап I I эт этап 11 этап

17 Феодосии 1-19 ос авще и а3ае

202-ный

Аде тат ный бэ" фер

37 55 . 102 35 62

9,0 5, 0

12

0,5

О О

9 О 5,0

315 56!

О 0

220 12

«и» l2

90 50 37 55

l9!

4,5!

20

Э,5

37 55 230 40

12

9 ° 0 510

9" О StО

90 50

12 12

«N

37 55

37 55

37 55

37 56

203 36

180 35

212 24

281 49 .

2,0

12

22 N

23

12

1,$

12 . 90 50

72 2,4 и

94 п

9,0 5 0

5,6

272 50

234 47

212 44

162 32

200 39

186 34

2$

26

21

28

29

30 феодосие 19 ос виденные

5 5

5,5

9,0 5 0

9,0 5,0

910 5,0

9 ° 0 5 0

9,0 5,0

1,0 5,0

37

37

37

37 .37

6

6

$,5

5,5

96

92

77

68

12

5,4

$,2

4 8

3,0

4 ° 2

412

«и

° I и

It

° 1

° 1

0,1 Н

36tC0 g ацетат-" вый бт" фер ч

I°

«ч

44

46 феодосии 1 19 осандениые

° 1

От1 M

KHCOtI ацез atный буфер

9,O $,0 47

90 50 37

41

10,2

10,3

4Э2 11"2

42S 100

198 и

12

11 ч

Составитель B,Голимбет

Техред М.Ходанич

Корректор Т. Малец

Редактор Н.Горват

Заказ 3528 Тираж 498 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина, 101

33 tt .32

ЗЗ

34

36 tt

37

38

39 «и

4!

42

43 кпо ро» форы

202-аюй топуоп

202-иый этаноп

0,05 Н

88008

0,05 Н

8ÔI 005M

33aCI<

0,0$ Н

333ТЛ

O,1 M

33ВСОЗ

N п

tt и

° е

11 и

N

В .ч и

11 и

"It

11

11, N

N и

° t

12

l2

12

12

12

12

12

t2

12 .12

12

12

12

l2

12

12

12

12

I2

12

32

12

12

12

12 !

12, 12

12

l2

7,S

10 5

11 0

9,0

9,0 9а0

9,0

9 0

9,0

9,0

9,0

9 O

9 0

9,0

9,0

9,0. 5,0

5,0 5,0

4,0

4 ° 5

6,5

7,О

5 0

5,0

5 0

5,0

5,0

5,0

5 0

5,0

5,0

37

31

37

37

37

37

37 !

52

37

37

37

37

5$

42

62

212 65

302 74

200 . 40

1 70 42

204 52

1 9S . 60

168 . 30

154 38

1 82 60

1 90 75

162 45

172 50

200 98

208 llo

168 48

425 98

12

74

158

72

104

96

76

96

86

66

200

6 S

4 О 3,0

$,5

6 0

3,2

6, 2

6 0

6 0

38

5,4

5,6

6 2

la,O