Штамм гриба аllеsснеriа теrrеsтris - продуцент целлюлаз

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению нового продуцента термостабильных целлюлоз. Цель изобретения - получение штамма гриба Allescheria terres- tris ВКПМ F-364 (H-l) - продуцента термостабильных целлкшаз с более высокой активностью, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу и работающих в оптимальном диапазоне рН 4,5-4,6. Изобретение позволяет получить целлюлазы, в частности эндоглюканазу - 3,3 ед/мл, целлобиазу - 1,5 ед/мл, активность по NaKMU. - 5,8 ед/мл, активность по фильтровальной бумаге - 0,5 ед/мл. Ферментный препарат, выделенный из Allescheria terrestris H-l, обладает термостабильностью. Штамм быстрорастущий. Растет на синтетических средах, признаки штамма устойчивы. Образует богатую белком биомассу (35-40 мас.%). Для получения целлюлаз используется сравнительно дешевая синтетическая среда. (Л

,SU„„164

СОЮЗ СОВЕТСжиХ

РЕСПУБЛИК

А1

51) С 12 N 9/42, .1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н ASTOPCNOMY СИИДатВЪствм (21) 4418174/13 (22) 29,04,89 (46) 23 04а 91, Бюп ° N 15 (71) Институт биохимии растений

АН ГССР (72) Г.И Квеситадзе,.Л Л ° Êâà÷àäçå и Н,Н Кватадзе (53) 577&15(08898) (56) Авторское свидетельство СССР

М - 1 252336, кл С 12 N 9/42, 1984, б (54) ШТАММ ГРИБА ALLESCHERIA TERRESTRIS — ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛ10ЛАЗ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению нового продуцента термостабильных целлюлаз ° Цель изобретения получе ние штамма гриба А11escheria terrestris ВКПМ Г-364 (Н- 1) — продуцента

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению целпкт. лаз микробного происхождения, используемых в процессе осахаривания целлюлозы„

Цель изобретения получение штамма гриба Allescheria terrestris

ВКПМ Р-364 (Н-1) — продуцента термо стабильных с более высокой активнос тью целлюлаз, катализирующих преврашение целлюлозы в глюкозу и работак щих в оптимальном диапазоне рН 4,5

4,6 °

Штамм A terrestris Н-1 получен в результате ультрафиолетового облучения исходного штамма Allescheria сеггевсгхз дозой 20 Дж/м а

2 термостабильных целлюлаз с более вы. сокой активностью, катализ ирующих превращение целлюпозы в глюкозу и работающих в оптимальном диапазоне рН 4,5-4,6 ° Изобретение позволяет получить целлклазы, в частности эндо» глюканазу — 3,3 ед/мл, целлобиазу ™

1,5 ед/мл, активность по НаИЩ5,8 ед/мп, активность по фильтровальной бумаге - 0,5 ед/мл Ферментный препарат, выделенный из Allescheria

terrestris Н-1, обладает термостабильностью, Штамм быстрорастущий.

Растет на синтетических средах, признаки штамма устойчивы, Образует богатую белком биомассу (35-40 мас %). Для получения целлкпаз используется сравнительно дешевая синтетическая среда.

Культурально-морфологические признаки Культура хорошо развивается на 8%-ном кислом сусло-агаре с полоской ф льтровальной бумаги на поверхности скошенного агара, на видоизмененной твердой среде Чапека (0,22% пептона вместо NANO>), на модифицированной твердой среде Чапека Докса с добавлением кукурузного . экстракта и полоской фильтровальной бумаги на поверхности агара.

Кислый 8% ный сусло-агар, рН 4, 5, колония быстрорастущая, мни елий ллотнопушистый, белый, обратная сторона колоний бесцветная, гифы тонкие, ровные, гладкие, диаметром 4-5 мк, спороношение очень обильное, кони»! 643608 диеносцы простые, как правило, оди ночные, конидии чаще круглые диаметром 4, -5,0 мк, удлиненные, обратно грушевидные, размером 3-3,5х5-6 мк, физиолого-биохимические признаки, Штамм хорошо усваивает лактозу, глю" козу, ксилозу, галактозу, крахмал, маннит, Не усваивает рамнозу, рафинозу, маннозу и сорбит, Иэ источни ков азота хорошо усваивает органи ческие и неорганические соединения азота Наиболее интенсивный рост наблюдается на нитратах» Усваивает разнообразные фосфорные соединения, однако более интенсивно одно и двух:эамещенный фосфорнокислый калий

Штамм высокие эндоглюканазную (эндо-l, 4P-глюканаза) и целлобиазну.ю активности выявляет в пределах рН 4,54;6, Оптимальная температура для роста и биосинтеза 40оС» Штамм гидро-, лизует целлюлозу (разные целлюпозные субстратш), Наблюдается эндоглюканазная и высокая целлобиазная актив- 25 ности на среде, содержащей микро кристаллическую целлюлозу ЛТ в ка честве единственного источника углерода, Целлюпаза данного штамма термостабильна, после ведения ферментативной реакции при 70 С в течение

3 ч активность почти полностью сохраняется, Для размножения штамма применяют

87.-ный кислый сусло-агар с полоской фильтровапьной бумаги на поверхнос ти скошенного arapa, РН среды 4,5, Посевным материалом служит 10-ти сУточная кУльтУРа штамма Для полу 40 чения целлюлаз используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л: . КН<РО < 6 8; (ЫН4)д 804, 1 3

М8$04 ° 7Н О 0,5; микрокристаллическая целлапоза ЛТ 17.; СаС1 0,2; пептон . 45

1,5; кукурузный экстракт 1,5Х, рН среды 5;5 °

150 мл питательной среды в кони ческих колбах емкостью 750 мп сте рилизуют 40 мин при 1 ати, Максималь ная активность целлюпаз отмечается

I при выращивании штамма на термоста тированной качалке, делающей 220 об/

/мин, при 40 С в течение 96.ч» Ак тивность биосинтезируемой штаммом целлюлазы следующая, ед/мп: по Цап

5,8; по фильтровальной бумаге 0,5; по целлобиозе 1,5 °

Эндоглюканазную активность целлк лазного комплекса определяют вискозиметрическим методом, в основе которого лежит определение начальной скорости уменьшения относительной вязкости раствора карбоксиметилцеллкг» лозы при добавлении культурапьной жидкости»

Для определения активности по

НИЩ 1 ип 1,5Х-ного раствора субстрата в 0,05 M ацетатном буфере (РН 4,7) и 1 мп культуральной жидкости инкубируют в течение 30 мин при 60 С, За единицу активности принимают количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих сахаров при 1Х-ной концентрации субстрата в минуту» Ко личество восстанавливающих сахаров определяют по методу Сомоджи-Нельсона»

Для определения активности по фильтровальной бумаге 50 мг фильтровальной бумаги Ватман к- 1 (1х6 см) в 1 мп 0,05 M ацетатного буфера (pH 4 р 7) и 1 MI культуральной жидко с" ти инкубируют в течение 1 ч при 55 С, За единицу активности принимают количество фермента, образующего

1 мкмоль восстанавливающих сахаров в минуту» Количество восстанавливающих сахаров опредепяют по методу Сомоджи-Нельсона, Дпя определения целлобиазной активности 0,2 мл 2 10 М целлобиозы, 1,6 мл 0,05 M ацетатного буфера (РН 4,7) и 0,2 мп раствора культуральной жидкости инкубируют в течение

10 мин при 55 С. За единиц активности принимают количество фермента, образующее 2 мкм глюкозы (проводят глюкоз ооксидаз ным методом) .

Кроме высокоактивных целлюпаз, продуцент образует богатую белком (35-40X) биомассу, Пример 1 ° Штамм Allescheria

terrestris Н-1 выращивают на агаризованном 8Х-иом кислом сусло-агаре с полоской фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 4,5 °

Культивирование проводят в течение 98 ч при 40 С» Суспензией спор, полученной смывом с указанной среды, засевают колбы емкостью 750 мп, со» держащей 150 мп среды следующего со става, г/л: микрокристаллическая целлюпоза ЛТ 1,0X; (NH )

0,5; СаС1 0,2; кукурузный -экстракт

Штамм гриба Allescheria terrestris

ВКПМ Г-364 — продуцент целлюпаз, Со ставитель: И,Привалова

Техред. M.Ìîðãентал . Корректор:0 Кравцова

Редакто р: Н» Рогулич

Заказ 1221 Тираж 373 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

16

1,5Х; рН среды 5,5 ° Выращивание культуры проводят на круговой качалке, делающеи 220 об/мнн прн 40 С в течение 96 ч Зномассу отделяют фильтрованием и в культурапьной жидкости определяют активности целлюлаз по указанным методам Активность биосинтезируемой штаммом целлюпазы следук щая, ед/мп: по зндоглюканазе 3, 3; по NaIQ5 5,8; по фильтровальной бумаге 0,5; по целлобиаэе 1;5

При выдерживании препарата при ф Ъ

70 С в течение 3 ч активности целпкг лаз почти полностью сохраняются °

Способность штамма расти при повышенной температуре (40 С) ограничивает возможность заражения посторонней микрофпорой °

431. 08 6

Получены опытные партии целлюлаз

Allescheria terres tris Н-1 в двухсот» литровых и двухкубовых ферментерах.

При выращивании на лигно-целлюS лозных отходах пищевой промышленнос ти и сельского хозяйства штамм Allescheria terrestris Н-1 образует богатую белком биомассу и может служить источником белка для кормления крупного рогатого скота и птиц В науч-. ных целях, в особенности в генной инженерии, целпюлазы указанного штамма могут быть применены дпя раэруше15 ния клеточной стенки, Формула из о бретения