Способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа

 

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве , промышленности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является ускорение способа за счет одновременного определения двух антигенов . Цель достигается тем, что в анализе используется иммуносорбент с антителами к двум определяемым антигенам, а проявление антигенов осуществляют смесью двух антител к ним, которые мечены двумя различными металлопорфиринами. Спектральные свойства используемых порфиринов позволяют селективно определять каждый из них в смеси и по ним определять два антигена Регистрацию проводят из объема после десорбции или непосредственно с поверхности твердой фазы, В качестве двух антигенов могут выступать два эпитопа одного макромолекулярного антигена. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/533

ГОСУДАРСТВЕ Н ЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1")-4686532/14 (22) 31.03.89 (46) 23.09.91. Бюл. М 35 (71) Институт биохимии им. А, Н. Баха, Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт и Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения, (72) Д. Б. Папковский, А. П. Савицкий, В. А.

Мищенко, M.)Ì. Побережный, Г. В. Пономарев, Н. С, Осин и В, Н. Злобин (53) 615.373(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1464089, кл. G 01 N 33/53, 1987. (54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО ФОСФОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (57) Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в ветеринарии, медицине, биологической промышленности для определения биологически активных соединений.

Цельюизобретения является ускорение способа за счет одновременного определения двух антигенов в одной пробе.

Способ осуществляют следующим образом.

Для анализа пробы, содержащей одновременно два антигена, используют комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум определяемым антигенам.

В лунках панелей происходит связывание антигенов с сенсибилизированными антителами. Отмывка лунок панелей позволяет Ы „1679382 А1 использовано в медицине, сельском хозяйстве, промышленности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является ускорение способа за счет одновременного определения двух антигенов, Цель достигается тем, что в анализе используется иммуносорбент с антителами к двум определяемым антигенам, а проявление антигенов осуществляют смесью двух антител к ним. которые мечены двумя различными металлопорфиринами.

Спектральные свойства используемых порфиринов позволяют селективно определять каждый из них в смеси и по ним определять два антигена. Регистрацию проводят из объема после десорбции или непосредственно с поверхности твердой фазы. В качестве двух антигенов могут выступать два зпитопа одного макромолекулярного антигена. ааЪ удалить из смеси непрореагировавшие компоненты. Внесение смеси двух антител,: с ( меченных двумя разными металлорпорфи- О ринами, последующее инкубирование и отмывка сорбента позволяют получить следующие цепочки; твердая фаза — антигенспецифические антитела — антиген-коньюгат антигенспецифических антител с метэллопорфиринами. Концентрация дан- )» ного металлопорфирина на твердой фазе а пропорциональна концентрации того антигена, к которому специфичен данный коньюгат антител с металлопорфирином, Для измерения интенсивности фосфоресценции металлопорфиринов осуществляют десорбцию специфически связанных с сорбентом коньюгатов в обьем щелочным раствором или измеряют фосфоресценцию

1679382

50 раствором или измеряют фосфоресценцию с поверхности лунок после добавления бисульфита (удаление растворенного кислорода), Интенсивность фосфоресценции каждого металлопорфирина измеряют путем смены длин волновозбуждения и (или) регистрации (с помощью монохроматоров ион наборов фильтров с полушириной пропускания 10 — 50 нм), Учет результатов реакции проводят по величинам интенсивности фосфоресценции на соответствующих длинах волн, В табл, 1 приведены спектральные характеристики различных Pd-порфиринов, Пример 1, На поверхность лунок полистирольного микропланшета адсорбировали смесь антител кролика к вирусу ящура типов А и О по 10 мкг/мл из 0,1 мл 0,1 M карбонатного буфера, рН 9,2 в течение 3 ч при 37 С. Затем раствор выливали и промывали лунки 3 раза фосфатно-солевым буфером с Тритоном Х вЂ” 100 (0,01 M К-фосфат, рН

7,4, 0,15 M NaCI, 0,057, ТХ вЂ” 100; ФСБТ).

Конъюгаты анти-А-антител с Pd-копропорфирином и анти-0-антител с Pd-тетракис(п-карбоксифенил)порфином получали по методике, описанной в прототипе, В лунки с адсорбированными антителами наливали по 0,1 мл станрастворов коммерческого антигена вируса ящера типа А (производства ВНИЯИ, Владимир) в ФСБТ и инкубировали 1 ч при 37 С. После этого растворы выливали, промывали лунки 3 раза ФСБТ, заливали в них по 0,1 мл ФСБТ, содержащего по 10 мкг!мл обоих конъюгатов антител с Pd-порфиринами (концентрации обоих конъюгатов подбирались в предварительных опытах по параметру максимального соотношения сигнала в опыте и в контроле без антигена). Инкубировали еще 1 ч, после чего снова отмывали лунки 3 раза ФСБТ.

Десорбцию меченных соединений проводили 0,01 M раствором КОН, содержащим

0,2 ь ТХ вЂ” 100, после чего (через 20 мин) добавляли бисульфит натрия в конечной концентрации 5 мг/мл.

Регистрацию фосфоресценции, (возбуждение) проводили азотным лазером (337 нм) с частотой 100 Гц и полушириной вспышки 10 нс. Регистрацию осуществляли последовательно с использованием интерференционных фильтров с максимумами пропускания 670 и 710 нм.

Время задержки 0,3 мс, счета 0,7 мс, Время накопления сигнала 10 с. Результаты представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 определяется типовая принадлежность вируса ящура; сигнал при 670 нм в 3,2 раза выше, чем при 700 нм, В десорбирующем растворе находится только Pd-xonponopgupv a I. Это свидетельствует о принадлежности вируса ящура к типу А, По калибровочной кривой при 670 нм (2-й столбец, табл, 2) определяется концентрация вируса ящурэ типа А (в единицах разведения).

Пример 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, но исследуемый образец содержит оба типа антигена вируса ящура. Измеряют интенсивности фосфоресценции при 670 и 700 нм. Затем, решая систему уравнений:

I56O = Х + Ау, 1що= Вч+ у, где А = 1тоо/1мо для Pd-копропорфирина, а

В = 1ыо/1тоо для Pd-тетра(п-карбоксифенил)порфина, коэффициенты, определяемые из табл. 2 и 3, равные соответственно

0,26 и 0,31), определяют интенсивность свечения Pd-копропорфирина I (Х) и Pd-тетра(пкарбоксифенил)порфина (V). Затем по калибровочным кривым из примеров 1 и 2 по интенсивности свечения определяют концентрации антигенов типа А и типа О вируса ящура.

Способ позволяет одновременно определить 2 антигена в случае ограниченного количества исследуемого образца.

Формула изобретения

Способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа, включающий получение антител, ковалентно меченных металлопорфиринами, десорбцию меченного соединения после проведения иммуной реакции на сорбенте, и определение интенсивности фосфоресценции раствора, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа за счет определения двух антигенов в одном образце одновременно, используют комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум антигенам, меченные двумя различными металлопорфиринами, а определение антигенов ведут последовательно по интенсивности фосфоресценции соответствующего металлопорфирина, 1679382

Таблица 1

Таблица 2

Составитель И.Башкаев

Редактор А.Шандор Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Заказ 3210 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101