Способ получения гиалуронидазы

 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, используемой для приготовления препаратов Ронидаза и Лидаза, оказывающих положительное действие при лечении контрактур и тугоподвижности суставов, рубцов, длительно незаживающих ран и язв. Цель изобретения - повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения. Изобретение заключается в том, что проводят экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, температуре 60-70°С в течение 30-40 мин и;в при- .сутствии поливинилхлорида и лактата кальция при их соотношении соответственно 20-40 г и 1-2 г на 1 кг сырья с последующей очисткой осаждением гиалуронидазы из экстракта водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2-6,8 и переосаждением этиловым спиртом и сушкой фермента. 1 табл. Ј

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (ям С 12 N 9/26

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (21) 4753323/13 (22) 27.10.89 (46) 30.03.92. Бюл. М 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт текстильно-галантерейной промышленности (72) Л.И.Стекольников, В.В,Рыльцев, В.Н. Филатов и Г. Г, Шилов (53) 663.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N . 566875, кл. С 12 N 9/26, 1977.

Авторское свидетельство СССР

N- 1666534, кл. С 12 N 9/26, 27.10.1990. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ (57) Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, используемой

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, используемой для приготовления препаратов-"Ронидаза" и "Лидаза", оказывающих положительное действие при лечении контрактур и тугоподвижности суставов, рубцов, длительно незаживающих ран и яэв.

Цель изобретения — повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения.

Способ осуществляют следующим образом.

Измельченные семенники крупного рогатого скота. заливают водным раствором

„„Я2„„1723122 А1 для приготовления препаратов "Ронидаза" и "Лидаза", оказывающих положительное действие при лечении контрактур и.тугоподвижности суставов, рубцов, длительно незаживающих ран и язв. Цель изобретения— повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения, Изобретение заключаетвя в том, что проводят экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, температуре 60 — 70 С в течение 30-40 мин и,в присутствии поливинилхлорида и лактата кальция при их соотношении соответственно 20-40 r и 1 — 2 r на 1 кг.сырья с последующей очисткой осаждением гиалуронидазы иэ экстракта водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2 — 6,8 и переосаждением этиловым спиртом и сушкой фермента. 1 табл. уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, добавляют поливинилхлорид из расчета 20-40 г на 1 кг сырья и лактат кальция из расчета 1 — 2 г на

1 кг, Экстракцию проводят при 60-70 30-40 мин при постоянном перемешивании, Жмых отделяют сепарированием, в экстракте после охлаждения осаждают гиалуронидазу водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2 — 6,8 с последующим переосаждением этиловым спиртом и досушиванием на воздухе.

Поливинилхлорид получают суспензионной или эмульсионной полимериэацией винилхлорида, молекулярная масса около

150000, плотность 1,35 — 1,43 г/см, т.пл.

150 — 2000, не растворим в воде и спиртах, 1723122 растворим в циклогексане и тетрагидрофуране.

Выход целевого продукта 10 — 12 от массы сырья, а его активность 2048-4096 ед/100 мг.

Пример 1. 100 кг семен ников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:1), 2 кг поливинилхлорида (20 г/кг сырья) и 0,1 кг лактата кальция (1 г/кг сырья), устанавливают рН 4,5 и проводят экстракцию при 60 С и постоянном перемешивании 30 мин, Жмых отделяют сепарированием, а к 115 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 20 С 0,1 н. раствор NaOH до рН 6,2, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 3 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 12 л (4 объема) охлажденного до 4 С этилового спирта, образовавшийся осадок отделяют, промывают многократно спиртом и досушивают на воздухе, Получают 10 кг порошка гиалуронидазы (выход 10% от массы сырья} с величиной гиалуронидазной активности 2048 ед/100 мг, Пример 2. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 150 л 0,1 н, водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:1,5), 3 кг поливинилхлорида (30 r/êã сырья) и 0,15 кг лактата кальция (1,5 г/кг сырья), устанавливают рН 4,6 и проводят экстракцию при 65 С и постоянном перемешивании 37 мин, жмых отделяют сепарированием, а к 145 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 22 С 0,1 н. раствор Na0H до рН 6,4, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 4 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 16 л (4 объема) охлажденного до 5 С этилового спирта, образовавшийся осадок отделяют многократно промывают спиртом и досушивают на воздухе, Получают 11 кг (выход 11% от массы сырья) порошка гиалуронидазы с величиной гиалуронидазой активности 4096 ед/100 мг.

Пример 3. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 200 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:2), 4 кг поливинилхлорида (40 г/кг сырья) и 0,2 кг лактата кальция (2 гlкг сырья), устанавливают рН 4,7 и проводят экстракцию при 70 С и постоянном перемешивании 40 мин, жмых отделяют сепарированием, а к 175 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 25 С 0,1 н, раствор NaOH до рН 6,8, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 5 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 20 л (4 объема) охлажденного до 6 С этилового спирта, осадок

5 отделяют, многократно промывают спиртом и досушивают на воздухе. Получают 12 кг (выход 12 QT массы сырья) порошка гиалуронидазы с величиной гиалуронидазной активности 4096 ед/мг.

10 Пример 4. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что экстра15 кцию проводят 30 мин при 50 С, Получают

8 кг порошка гиалуронидазы (выход 8 от массы сырья) с активностью 2040 ед/100 мг.

Пример 5. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волч20 ке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что экстракцию проводят 30 мин при 80 С. Получают

10 кг порошка гиалуронидазы (выход 10 от

25 массы сырья) с активностью 512 ед/100 мг, Пример 6, 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, 1 кг поливинилхлорида

30 (10 г/кг сырья) и 0,05 кг лактата кальция (0,5 г/кг сырья) и далее поступают как в примере

1, Получают 8 кг порошка гиалуронидазы с активностью 64 ед/100 мг, Пример 7, 100 кг семенников крупного

35 рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и 2 кг поливинилхлорида и далее поступают как в примере 1. Получают 10 кг порошка гиалуронидазы (выход

40 10 от массы сырья) с активностью 256 ед/100 мг, Пример 8. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волч45 ке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и 0,1 кг лактата кальция (1 г/кг сырья) и далее поступают как в примере

1, Уже через 10 мин после начала эКстракции образуется резиноподобный осадок, 50 почти не растворимый в воде, не обладающий гиалуронидазной активностью.

Пример 9. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора

55 уксусной кислоты и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что в экстракте после отделения жмыха устанавливают рН 5,8. Получают 4 кг порошка (4% от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 64 ед/100 мг.

1723122

Формула изобретения

* Величину гиалуронидазной активности определяли по методу предупреждени образования муцинового сгустка, описанному в ВФС 42-182 — 72 на "Лидазу"

30

Составитель Е.Воробьева

Техред М,Моргентал Корректор Э.Лончакова

Редактор Н,Горват

Заказ 1042 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Пример 10. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что в 5 экстракте устанавливают рН 7,2. Получают

5 кг порошка (выход 5 от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 64 ед/100 мг.

B таблице приведен сопоставительный 10 анализ технико-экономических показателей предлагаемого и известного способа, Из таблицы видно, что процесс получения гиалуронидазы по предложенному способу занимает меньше времени (на 6-10 ч) 15 по сравнению с известным. При этом увеличивается выход целевого продукта (на 23 ) и его гиалуронидазная активность (примерно в 2 раза)..

Способ получения гиалуронидазы, предусматривающий экстракцию фермента из измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5 — 4,7, последующую очистку и сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности фермента, а также сокращения времени его получения, экстракцию проводят при 60-70 С в течение 30 — 40 мин в присутствии поливинилхлорида и лактата кальция, ко — îðûå вносят в количестве соответственно 20-40 г и 1 — 2 г на 1 кг сырья., а очистку проводят путем осаждения гиалуронидазы из экстракта водным раствором гидроокиси натрия при рК

6,2 — 6,8 и переосаждения этиловым спиртом,