Способ получения регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к культивированию изолированных тканей растений и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения существующих сортов растений. Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза. Способ предусматривает получение из незрелых зародышей растений регенерантов путем двухэтапного культивирования на модифицированных питательных средах Мурасиге-Скуга и Гамборга Bs. ы fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4803717/13 (22) 19.03.90 (46) 23.03.92. Бюл. М 11 (71) Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова (72) А.К.Гапоненко и И.П.Воронина (53) 578. 085.23(088.8) (56) Greco В., Tanzarella О.А., Саггоззо G., Blanco А. Callus induction and shoot

regeneration In sunflower (Helianthus

annuus L) Plant. Sci Lett., 1984, ч. 36, В 1„р.

73-78.

Murashlge Т. and Skoog F. А revised

medium of rapid growth апб Ыоаззауз with

tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 1962, ч. 15, р. 473-497.

Finer 1.1. Direct somatic embriogenesis

and plant regeneration from immature

embryos of hybrid sunflower (Helianthus

annuus L.) on à high sucrose - containing

medium. Plant. Cell. Reports., 1987, ч. 6, ЬЬ 5, р. 372-374.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию изолированных тканей растений, и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения уже известных сортов растений.

Одним из лимитирующих факторов выращивания изолированных тканей и клеток подсолнечника является низкая регенерация растений.

Известны способы получения растений-регенерантов подсолнечника путем прямого и непрямого соматического эмбриогенеза, основанные на подборе типа экса > ЯХ ао 1 72059б А 1 (st)s А 01 Н 4/00, С 12 N 5/04

Gamborg О. .„Miller R.A„OJima К.

Nutrient requirements of suspension cultures

of soybean root сепз. Ехр. Cell. Res., 1968, ч.

50, р. 151-158.

Патент Франции N. 2605839, кл. А 01 Н 5/00, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА В КУЛЬТУРЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию изолированных тканей растений и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения существующих сортов растений. Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза.

Способ предусматривает получение из незрелых зародышей растений регенерантов путем двухэтапного культивирования на модифицированных питательных средах Мурасиге-Скуга и Гамборга В5. плантата и оптимального состава среды.

Было показано влияние гормонов 6-бензиламинопурина (БАП) и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) на ряд эксплантатов синтетического сорта

Sannace, а именно на листья, участки котиледонов, апексы побегов, сегменты гипокотиля. Оказалось, что среда (MS)

Murashige and Skoog в сочетании с 2,4-Д и

БАП и MS с 2,4-Д не вызывает образования побегов из каллуса ни для одного эксплантата, на среде М$ с добавкой 1 мг/л EAll наблюдали регенерацию из глобулярного каллуса, полученного при культивировании

1720596 сегментов гипокотиля. Недостаток этого veтода в том, что он касается только одного редкого генотипа.

Известен прямой соматический эмбриогенез и регенерация растений из незрелых зародышей на среде с повышенным содержанием сахарозы. Через шесть дней начала культивирования показано образование белых соматических зародышей непосредственно из котиледона зиготических, без образования каллуса. Незрелые зародыши на 7-14-й день после опыления помещали на среды, содержащие MS соли; витамины среды Gamborgs (Bs); различные концентрации сахарозы (3%, 6%, 12%); в качестве добавок — 2,4-Д, дикамба, пиклорам, ф-индолил-3-уксусная кислота (ИУК), и а-нафтил-уксусная кислота (НУК). Показано, что образование соматических зародышей не происходило на средах с 3% сахарозы и использованием в качестве добавок ИУК или НУК. Оптимальными являлись среды с 6 и 12% сахарозы в сочетании с 1 мг/л 2,4-Д или 3,3 мг/л дикамба, При помещении на данные оптимальные среды зрелых зароды.шей или тканей асептических проростков (листьев, апексов, гипокотилей) прямого соматического эмбриогенеза не наблюдалось, Недостатки этого способа в том, что он применим только к определенному типу эксплантатов, а именно к незрелым зародышам на 7-14 день после опыления (следовательно, малым гибкость), кроме того, степень регенерации полученных всходов остается еще не очень достаточной.

Из известных способов наиболее близким по своей сущности является способ регенерации подсолнечника, применимый к восьми сортам подсолнечника, описывающий регенерацию из незрелых зародышей на 4 — 21-й день после опыления. Культивирование по известному способу осуществляется в три этапа. Первый этап образования эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирующей среде, содержащей соли и витамины MS, аминокислоты, 9% сахарозы, гормон цитокининового типа

БАП в концентрации 0,5 — 1 мг/л. Второй этап — культивирование эмбриогенных каллусов для их роста, развития и прорастания в среде, содержащей соли и витамины MS, аминокислоты, 3% сахарозы, 0,1 — 0,5 мг/л

БАП. Третий этап состоит в перенесении проростков для их роста и развития на среду, содержащую соли и витамины Bs, 1% сахарозы, гормон ауксинового типа — ИУК в концентрации 0,1 — 0,2 мг/л, 5

Недостатки этого способа состоят в необходимости осуществления изменений сред между первым, вторым и третьим этапами, что ведет к большей вероятности инфицирования, а также невысокой частоте регенерации.

Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза, Способ предусматривает культивирование эксплантата подсолнечника в питательной индуцирующей среде, содержащей гормоны для инициации эмбриогенных каллусов и дальнейшее культивирование эмбриогенных каллусов для их роста, развития и прорастания, позволяющее получить растения-регенеранты.

Использование способа приводит к множественному образованию побегов из одного зародыша путем непрямого соматического эмбриогенеза.

Способ осуществляется следующим образом, Используют восемь генотипов подсолнечника: сорта Передовик, Надежный, Енисей, Ультраскороспелый, Ржаксинский; инбредную линию 36-29; две гибридные линии M 1 65/1 А х НА 234 А х К 3064.

В качестве эксплантата для индукции каллуса используют незрелые зародыши на

9 — 21-й день после опыления. Изолированные в асептических условиях незрелые зародыши помещают на питательную среду

MS c 3% сахарозы, дополненную 5 г/л КЙОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП и 5 мг/л НУК с дальнейшим получением морфогенетического каллуса. Каллусную ткань выращивают в термостате при с = 26-28 С, далее при фотопериоде 16 ч день — 8 ч ночь при

t = 26 — 28 С с перенесением каждые

25-30 дней на свежую питательную среду. Затем после роста каллусной ткани отделенные побеги переносят на среду для корнеобразования, содержащую соли В, 0,5% сахарозы, 2 мг/л

ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина HCI, Пример 1. Растения подсолнечника сорта Ржаксинский выращивают в теплице в сосудах с почвой. В момент цветения каждое растение отмечают этикеткой с указанием даты цветения. На 9 — 21-й день после опыления семянки стерилизуют путем погружения на 1 мин в 50%-ный этанол, далее на 10 мин в 9%-ный раствор продажного хлорамина Б, затем промывают трижды стерильной дистиллированной водой. Изолированные в асептических условиях зародыши размером 0,1 — 0,8 см помещают на среду, содержащую соли и витамины MS, 1720596

Аналогично проводят испытания с другими генотипами подсолнечника.

Предлагаемый способ ускорил в 1,2 раза по сравнению с известным процесс образования зон морфогенеза и зачатков побегов путем непрямого соматического эмбриогенеза. Через 12-14 дней наблюдали образование зон морфогенеэа и зачатков побегов на индуцирующей питательной среде. Повысилась частота образования морфогенетических линий в 1,5 раза, увеличилось число множественных зон морфогенеэа в 4-6 раз.

Предлагаемый способ позволит получить регенерацию подсолнечника путем непрямого соматического эмбриогенеза.

50

Составитель А.Гопоненко

Редактор Н.Лазаренко Техред М.Моргентал Корректор М.Шароши

Заказ 904 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

З сахарозы, 4 г/л КИОз, 90 мг/л инозитола, 400 мг/л казаминовых кислот, 0,4 мг/л

БАП,4 мг/л НУК. В течение первых 20дней клеточные культуры выращивают в термостате при t = 26-28 С, далее — при фОтопе- 5 риоде 16 ч день — 8 ч ночь при 1 = 26-28 С.

Через 25-30 дней выросший каллус пересаживают на свежую питательную среду, одновременно отделяя образовавшиеся побеги и перенося их на среду для корнеоб- 10 разования, содержащую соли Вв, 0,5$ сахарозы, 1 мг/л ИМК, 0,4 мг/л пиридоксин HCI.

В каждом пассаже учитывают количество полученных растений-регенерантов и образовавшихся эон морфогенеза. 15

Пример 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, различие состоит в составе питательных сред для индукции каллуса и корнеобразования. Питательная индуцирующая среда содержит соли и вита- 20 мины MS, 3 сахарозы, 5 г/л КИОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП, 5 мг/л НУК. Вторая среда содержит соли В> 0,5 сахарозы, 2 мг/л

ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина HCI. - 25

Пример 3. В среду для индукции каллуса, содержащую соли и витамины М$, З сахарозы, добавляют 6 г/л КЙОз, 110 мг/л инозитола, 600 мг/л казаминовых кислот, 0,6 мг/л БАП и 6 мг/л НУК. Среду для 30 корнеобразования, содержащую соли Bs, 0,5 сахарозы дополняют Змг/л ИМК и 0,6 мг/л пиридоксин HCI. Остальные приемы осуществляют аналогично примеру 1.

Пример 4. Незрелые зародыши сорта 35

Енисей, собранные на 9-21-й день после опыления, когда они достигают размеров

0,1-0,8 см. стерилизуют, изолируют в асептических условиях и далее процесс культивирования ведут flo примеру 2. 40

Формула изобретения

Способ получения регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток, включающий зксплантацию незрелых зародышей на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, получение на ней морфогенетического каллуса, регенерацию побегов, перенос их на модифицированную питательную среду Гамборга Bs для корнеобраэования и адаптацию полученных растений к условиям открытого грунта, отличающийся тем, что, с целью павы шения выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеэа, получение каллуса и регенерацию побегов осуществляют в один этап с добавлением в питательную среду 4000-6000 мг/л нитрата калия, 90 — 110 мг/л инозитола, 400-600 мг/л казаминовых кислот, 0,4-0,6 мг/л 6-бензиламинопурина, 4-6 мг/л а-нафтилуксусной кислоты и корнеобразование проводят в и рисутствии 1-3 мг/л индолил масля ной кислоты, 0,4 — 0,6 мг/л пиридоксина HCI,