Способ антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита

 

Использование: в медицине, вирусологии . Сущность изобретения: антигенную дифференциацию штаммов вируса клещевого энцефалита проводят путем постановки реакции связывания комплемента, используя в качестве специфической сыворотки иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена - сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реакции проводят раздельно с сахарозоацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25% и выше штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25% и менее - как гетерологичный прототипному. 1 табл Наиболее близким к предлагаемому является способ внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий диффузию в геле с помощью сывороток, адсорбированных гетерологическими вирусами. Однако известный способ имеет следующие недостатки Практика использования способа показывает, что он является трудоемким из-за необходимости получения культуральных концентрированных антигенов прототипных и испытуемых штаммов, для чего требуется большое количество дорогостоящих клеточных культур, импортных химреактивов и дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуга). Кроме того, способ менее точен из-за отсутствия количественной оценки внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа J (Л С Ч| СА СП 00 ON ГО fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5125 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4705402/13 (22) 05.05.89 (46) 23.05.92. Бюл. N. 19 (71) Институт эпидемиологии и микробиологии Восточно-Сибирского филиала АН

СССР (72) В.И.Злобин, Д.А.Дрокин, П.Г.Мансуров и О.Б.Калмин (53) 568,066(088,8) (56) Рубин С.Г. Вопросы серологической дифференциации арбовирусов, полиовирусов лабораторной диагностики некоторых вирусных заболеваний. Концентрация, очистка вирусных антигенов, разработка новых модификаций серологической техники. Диссерт. докт. М.: 1972. с

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии.

В настоящее время циркулирует по крайней мере три антигенных подтипа вируса клещевого энцефалита: западный, восточный и сибирский (Айна/1448). Имеются также сообщения об обнаружении штаммов вируса клещевого энцефалита, в частности в Западной Сибири, отличающихся по антигенным свойствам от дальневосточного и западного вариантов, что подтверждает необходимость и важность внутривидовой дифференциации штаммов.

Известен способ идентификации флавирусов комплекса клещевого энцефалита путем типирования по растворимому антигену. Однако данным способом не осуществлялось типирование штаммов вируса клещевого энцефалита и не было разработано количественных критериев для установления степени антигенного родства испытуемых штаммов. Ы„„1735362 А1 (54) СПОСОБ АНТИГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА (57) Использование: в медицине, вирусологии. Сущность изобретения: антигенную дифференциацию штаммов вируса клещевого энцефалита проводят путем постановки реакции связывания комплемента, используя в качестве специфической сыворотки иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена — сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реакции проводят раздельно с сахарозоацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25 /, и выше штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25 /, и менее — как гетерологичный прототипному, 1 табл.

Наиболее близким к предлагаемому является способ внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий диффузию в геле с помощью сывороток, адсорбированных гетерологическими вирусами.

Однако известный способ имеет следующие недостатки. Практика использования способа показывает, что он является трудоемким из-за необходимости получения культуральных концентрированных антигенов прототипных и испытуемых штаммов, для чего требуется большое количество дорогостоящих клеточных культур, импортных химреактивов и дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуга). Кроме того, способ менее точен из-за отсутствия количественной оценки внутривидовой антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа, 1735362

Это достигается тем, что антигенная дифференциация штаммов вируса клещевого энцефалита включает постановку иммунологической реакции специфической сыворотки к прототипному штамму с антигеном, приготовленным из испытуемого штамма, учет результатов реакции и заключение о штаммовой принадлежности испытуемого штамма, Новым в достижении цели является то, что в качестве серологической реакции используют реакцию связывания комплемента, в качестве специфической сыворотки используют иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена — сахарозоацетоновый и растворимый антиген. При этом постановку реакции связывания комплемента проводят раздельно с сахарозоацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25% и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров 6,25% и менее— как гетерологичный прототипному.

Способ осуществляется следующим образом, Суспензией мозга мышей, инфицированных прототипными штаммами вируса клещевого энцефалита Софьин (восточный подтип), А-53 (сибирский или Айна/1448— подтип), Преголя — 8 (западный подтип), заражают в мозг необходимое количество мышей-сосунков и через 3-4 сут проводят сбор сосунков с типичными признаками болезни, Отобранных мышей обескровливают разрезом грудной клетки, извлекают мозг и помещают в охлажденный стакан гомогенизатора тканей. К мозгу мышей добавляют охлажденный до +4"С 8,5%-ный раствор сахарозы из расчета 0,4 мл раствора на 1 мозг и измельчают до получения однородной массы. Ацетоновую экстракцию проводят трехкратно. используя предо варительно охлажденный до -15 С ацетон квалификации "ч". Для первой обработки берут 20-ть объемов ацетона на 1 объем вируссодержащей суспензии мозга. Суспензию осторожно, по каплям добавляют в центрифужный стакан с охлажденным ацетоном при непрерывном перемешивании, Затем взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость (ацетон), Для второй обработки берут свежую порцию ацетона в 20-кратном объеме и добавляют к осадку. Осадок тщательно разбивают фарфоровым или стеклянным пестиком до образования равномерной взвеси и выдерживают в течение 1 ч при температуре+4 С и периодическом перемешивании, Затем взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение

10 мин и ацетон осторожно отсасывают.

При третьей обработке к полученному осадку добавляют свежую порцию ацетона в небольшом произвольном количестве, смесь тщательно перемешивают, центрифугируют, удаляют ацетон, а осадок высушивают

5 под вакуумом до превращения его в сухой рассыпчатый порошок. К порошкообразному осадку добавляют 0,1 М трис-буферный раствор до объема первоначальной суспензии мозга. Для инактивации вируса к пол10 ученному антигену добавляют

Р-пропиолактон до конечной концентрации

0,1% и выдерживают в течение 24 ч при температуре+4 С. Антиген центрифугируют на холоде (+4 С) в течение 1 ч при

15 10000 об/мин. После центрифугирования инактивация продолжается еще в течение трех суток. Контроль инактивации осуществляют заражением 5-7-граммовых белых мышей в мозг по 0,02 мл неразведенным

20 антигеном и последовательными его разведениями 10 . 10 . Зараженных животных наблюдают в течение 15 суток, Стерильный

7%-ный раствор бычьего альбумина на боратном буферном растворе рН 9,0 соединя25 ют с антигеном до конечной концентрации

0,7%, Приготовленный сахарозо-ацетоновый антиген делят на две части и из одной его части готовят растворимый антиген. Для этого к сахароза-ацетоновому антигену до30 бавляют сухую мочевину до конечной концентрации 8М, инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего диализируют в течение 20-24 ч против 100 объемов боратного буфера рН 9,0 при 4 С для удаления

35 мочевины из препарата. У исходного саха-. разо-ацетонового антигена и полученного растворимого антигена определяют гемагглютинирующую активность (растворимый антиген не должен обладать способностью

40 агглютинировать эритроциты гуся), Затем сахарозо-ацетоновый и растворимый антигены известных и испытуемых штаммов титруют в реакции связывания комплемента с иммунными асцитными жидкостями (сы45 воротками), полученными к штаммам— представителям известных антигенных подтипов вируса клещевого энцефалита.

В результате перекрестного титрования в реакции связывания комплемента сахаро50 зо-ацетонового и растворимого антигенов штаммов вируса клещевого энцефалита и полученных против них иммунных асцитов устанавливают, что в гомологичной системе падение титра растворимого антигена по

55 сравнению с исходным титром сахарозоацетонового антигена ни в одном случае не превышает 4-кратного. В гетерологичной системе снижение титра растворимого антигена по отношению к исходному титру сахарозо-ацетонового антигена отмечено в

1735362

55 интервале 4-32 раза(25-3,1 ). Исходя из этих данных, устанавливают количественные критерии антигенной квалификации того или иного штамма (т.е. при значении 257; и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при значении 6,25 и менее — как антигенно отличный от прототипного).

Пример, Для исследования выбирают штаммы Софьин, -53 — клон штамма

Айна/1448, Тенис, Бузуучук, Нугуш, 4072.

Преголя-8 и Скалица. Приготовляют сахароза-ацетоновый и растворимый антигены по вышеописанной методике. Против указанных штаммов получают иммунные асцитные жидкости (ИАЖ), которые используют для перекрестного титрования сахарозо-ацетонового и растворимого антигенов в реакции связывания комплемента (РСК).

Результаты исследования представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, при использовании сахарозо-ацетонового антигена (CAR) разница в титрах с гомологичной и гетерологичными ИАЖ, как правило, не превышает двукратной, и в случае растворимого антигена (PA) — достигла 32 раз. B то же время отмечают, что в гомологичной системе титр РА постоянно снижается не более, чем в 4 раза, по сравнению с титром исходного

САА, из которого данный PA получают, 8 реакции с ИАЖ к другим антигенным подтипам разница в титрах САА и PA одного и того же штамма стабильно составляет 16 и более раз. PA штаммов вируса КЭ не реагирует с

ИАЖ к вирусам ОГЛ и Повассан. Эти наблюдения позволяют установить количественные критерии дифференциации штаммов вируса КЭ, Уровень антигенного родства штаммов таким образом может быть выраТит РА жен фор Улои " Ти САА

Из данныхтаблицы следует,что при Нд,й 25 /, штаммы, использованные для получения антигенов и антител, антигенно родственны, а при Ндг — 6,25 (— относятся к разным антигенным подтипам, Анализ полученных данных в отношении 8-ми штаммов вируса КЭ показывает. что помимо представителей трех антигенных подтипов вируса КЭ (Софьин — дальневосточный подтип, А-53 — сибирский или

Айна/1448 — подтип и Преголя-8 — западный подтип), выявляются еще две антигенные группы. Одна из них представлена штамма5 ми Нугуш и 4072, другая штаммом Бузуучук.

Кроме того, имеются штаммы, обладающие антигенным родством с представителями двух разных вариантов. Таковы штаммы Тенис и Скалица. Полученные данные иллюст10 рируют более высокую точность предлагаемого способа, а также его широкие воэможности для антигенной дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита.

15 В целом вопрос об антигенной вариабельности вируса КЭ до настоящего времени не является достаточно ясным и требует скорейшего разрешения, С ним, в частности, связано адекватное решение проблем

20 лабораторной диагностики, специфической профилактики и терапии КЭ. Изучение этого вопроса также важно для познания и прогнозирования процессов изменчивости вируса, особенно в связи с возрастающими

25 масштабами и темпами антропогенного воздействия на природные очаги КЭ.

Формула изобретения

Способ антигенной дифференциации

30 штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий постановку иммунологической реакции специфической сыворотки к прототипному штамму с антигеном, приготовленным из испытуемого штамма, учет

35 результатов реакции и заключение о штаммовой принадлежности испытуемого штамма, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве серологической реакции исполь40 зуют реакцию связывания комплемента, в качестве специфической сыворотки — иммунную асцитную жидкость, а в качестве антигена — сахарозо-ацетоновый и растворимый антиген, при этом постановку реак45 ции связывания комплемента проводят раздельно с сахарозо-ацетоновым и растворимым антигеном и при разнице титров 25 / и более штамм оценивают как гомологичный прототипному, а при разнице титров

50 6,25 и менее — как гетерологичный прототипному.

1735362

I 1 I х х <о

С4 а х z (o о о

S X

z x

1 I

z z x а (Ч

ЪО а (4 бо

ОЪ

С4

Ъо

М\ Ln

П4 СЧ ъо ЪО

Ln

СЧ ъо а сЧ со .а ъо (Ч OO

\4 а °

СЧ о -а (О ч> а о сч

О Ъ

< 3

«О и ъ

С 4 (О

О \

<4

ЪО

ОЪ 4

ЪО а

СЧ ъо ((3

ОЪ О

СЧ

Ln (4

О\ (Ч

Ln сч а

О а а (Ч.а

<О СЧ О

Ln (ч (o а

СЧ M <4 (Ч с 3

О \ М

Ln

CV иЪ

<Ч

1<Ъ (4

ОЪ (Ч

О \ . 4

-т ъо (Ч LO а (ч сб а (ч M <Ч (3 LO (o а (Ч

<Ч

-Й а о (Ч (Ч

34Ъ М

СЧ м

О\

СЧ

М\

СЧ

<О

О \

Сч

Ln

<Ч (О

О\

<Ч

ОЪ (Ч

C4 CO

Сб СЧ

О а -а

<Ч LO

СЧ СС (Ч а сЧ

С 4

Ln м

Ln

СЧ

ЪО

Ln

СЧ

14 Ъ

С 4

МЪ (Ч

Ln

< 4

Л сЧ <О о (Ч

-а (! «О о <ч (Ч

СЧ

Ln м (О

In (ч м

СЧ СО

С4 а

ОЪ

<Ч О

Ln

СЧ

° О

О \

СЧ (О

Ln

С ° бо

Ln

СЧ бо м

<Ч сб. а (Ч (О

Ln

<Ч Со

С4 сЧ а м

СЧ

СЧ а м

Чб а О сч

an

Са4

<О

Ln

<Ч

ЪО

Ln

СЧ

МЪ

СЧ бО

Ln

<Ч (О

an

СЧ

-а

С о .а (О а (О (Ч <О а <Ч.О СЧ

<Ч M

<Ч CO

СЧ а

<Ч

СЧ а сЪ (х

«С о а

О О. <б О

4l а

S (О

S (3

I с

tU

lO Ф

X а s

С 3а

43 сС а

lO

X (З (Щ а л

CL (1

» х л л л (О

I о

L (О

O. l

IU а с с э л

I л х

X

IU

I(Ч

ГЧ

«3

--а м

ln

«С

1 I ЗР 1

I I I

I 1 I (1

1 1 Z Ct 1

«б б О.й и

1 1 (З вЂ” — 3

41 а

I 1 Ф 1 I" 1 о z ба

1 1 C 3 1 О

I 1 4 — — 1

1 1 1 I

1 1 3 дд I

I I I " I

1 I I (Z 1

1 I 1 <Х I а. <4

1 I 1

1 I 1 а

I (I

I 1 I l X 1

<О 3- I Î

I .— 4 — I

I I !

I I I дд I

1 1 1

I 1. (Z I

1 1 1 CZ CC I

Ф(ай

I 1 I

X r с о.

1 I IU-(3 1 СО

1 1 Y 1 X 1 СЧ

u 31 I 3 1

1 1 б 1

I I I дд 1

1 I 1 1

I 1 1 I МЪ

1 1 <О I б (Ч

I 1 1 1 «Z «C I б 1 (C б О LI 1 с з

1 I О 1 1

3. а а! 1- Ico э!z!<ч

1 l 1

I I I дд I

1 I 1 " I

1 1 I «Х I (1 1 «Z3 1

О. и

1 1 1 1

1 1 б 1 бсч!а

I ъО

3- (Ч

1 1 1 1

I 1 I ""дд I

1 1 I б

I 1 I «C I

1 1 CZ Ct 1

1 (бб I 1 О (l 1 х (Х(Э!

» а

3- О

Ф!»I z!а

VI X l I- 1<Ч

Л I I а I----1 — — +

1 X 1 1 Зд 1 ! C3 1 1 1

1 1 1 1

1 I Y I O: (1 I 1 Л I О и 1

I Ф 1 У 33 л 1 л а

1U I «31 3. О

3-1 л! s 1иъ

Э!(О(1-бсч

1, 1 б 1

I Х .С вЂ” — Ъ

I I 1 Зсб I

1 М I I 1

I CZ I I С I

I z ! cL c3: 1

О. и

1 X 1 1

Х(ZI O

L3 l Х б 1- О а!э!а!Оъ

I- I l I (Ч

3 3

1 I 1 1

I 1 I Зд I

I I I 1

1 1 1

1 1 1 (Z 1

О. О

1 1 1 I г

I 1 (Ъ б а 1

1 I а I 1 CO

z б сч ! 1 С 1 I- I

-г- — 4

I I 1 дд 1

1 I I 1

1 1 1 CL 1

I 1 1 (I cz I

О (З х 1

S 1 о а

В! 1- О о! х Ian

1 1

1 б I Ф

1

1 I

1 I

X I Y

1 X о

1 1 Iх и о с о

3S O I IO

I lU C4 3

1 а s I «I

I 1

I 1

1 ID I Z

I V z х л 1 О с3 а в

1 1- Х О

1 =3 Ф о

cO «O (Ч С 3

<о аб о

CO О:3

С 4 С4

«3 О (Ч .О

c4 Ln \О а м <ч бо ъО

an o an o

\Ч (4

° О

an -а

О ЪО О

<Ч С3 OO

СЧ <Ч иъ м an а

СЧ (O (Ч

МЪ

С4

11

МЪ

fU

X с

IQ

1!

S !

° I х

1

1 !!

° 1 х

1

ОЪ I (Ч 1

Ъо 1 а б

<Ч I

1

) и ъ 1 сч!

1 ъо I

МЪ I

<Ч I

1

Ln 1

СЧ 1

«О 1

СЧ I

Ln 1

1

МЪ

СЧ 1

CO I

<Ч !

1

О\ 1

СЧ 1

I

С4 I

-а I

О Ъ О б

I Ф

1 О

Ln I 4l

1 l

<ч (z

3z б Ф

I C4 о

ЪО CL

I l

I X

I 3а сч

1 X (О I Z

1 Э

1 У

1 (U сч I X

C4 I C3 а м !

1 43

I Б

ОЪ IЩ

<ч а

1 IO

1 О

1 э

1 Z а 1 43 ъо 1 Ct

1 Э

1 Ф

I S б иб а

I Э

1 X

1 J

1 IU

< 3 1

L3 т

О 1

1 IU

I S

1 а

I с