Способ выделения вирусных антигенов

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к химическим методам получения белковых фракций вирусов, и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов. Цель - повышение выхода целевого продукта. Для осуществления способа в клеточно-культуральную среду вносят преципитационную смесь следующего состава, об.%: твин 20 7-13; 10%-ный раствор хлорида кальция 10- 20; 32-40%-ный раствор ПЭГ (м.в. 4000- 6000) на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 остальное. Полученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании при 4... 10°С в течение 4-5 ч, а затем центрифугируют . К выделенному осадку добавляют экстракционную смесь, содержащую додецилсульфат натрия и хлорид калия на 0,02%-ном растворе Версена, и инкубируют в течение 1,5-2 ч. Затем экстракционную смесь центрифугируют и отделяют супернатант. 11 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4825888/13 (22) 15.05.90 (46) 1.5.03.92. Бюл. № 10 (71) Институт иммунологии (72) З.А.Макарян (53) 576.8.097.2(088.8) (56) Mucrobioiogica, Nat. Inst. Anlm. 1982, v, 5, р, 131 — 135.

Hith Quart (Tokyo), Nat. inst. Anlm„1977. ч. 17. р. 33 — 38.

Молекулярная генетика, 1987, ¹ 11, с.

39-46.

Вопросы вирусологии, 1976, № 6, с.739—

745. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ

АНТИГЕНОВ (57} Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к химическим методам получения белковых фракций вирусов, Изобретение относится в области медицины и ветеринарии, а именно к химическим . методам получения белковых фракций вирусов, и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов.

Известен способ получения вирусных антигенов путем осаждения вариантов по-. лиэтиленгликолем (MM 6000) или высаливания сульфатом аммония.

Однако эти методы характериэуютея . низким выходом и недостаточной степенью очистки вирионов, что не позволяет получать воспроизводимые результаты, Известен также фильтрационно-хроматографический метод, обьединяющий в себе преимущества микрофильтрации и молекулярно-ситовой хроматографии.

„,>5U „„1719432 А1 и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов. Цель— повышение выхода целевого продукта. Для осуществления способа в клеточно-культуральную среду вносят преципитационную смесь следующего состава, об.7: твин 20

7-13; 10 (,-ный раствор хлорида кальция 1020; 32 — 40Д-ный раствор ПЭГ (м.в. 40006000) на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 остальное. Полученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании при 4...

10 С в течение 4 — 5 ч, а затем центрифугируО ют. К выделенному осадку добавляют экстракционную смесь, содержащую додецилсульфат натрия и хлорид калия на

0,02 fo-ном растворе Версена, и инкубируют в течение 1,5 — 2 ч, Затем экстракционную смесь центрифугируют и отделяют супернатант. 11 табл.

° гЪ

Известен способ выделения вирусных 4 антигенов, включающий следующие операции: после появления полного цитопатиче- сО ского действия вируса культуральную ф„ жидкость вместе с клетками собирают и (р центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В дальнейшем из осадка клеток антиген экстрагируют в 4 раза 2%-ннм раствором три- ) и тона Х-100 в 1 М КС1 (рН 7.0}, После 30 мин: д перемешивания при комнатной температуре материал центрифугируют 5 мин при t0000 об/мин. Затем надосадочную жидкость из 4 проб смешивают. Полученный экстракт является концентратом антигена из клеток.

Недостатками прототипа являются частичная потеря на начальном этапе культуральной, вирусосодержа щей среды, 719432 представляющей собой запас вирусного белка; неполная экстракция клеток, содержащих вирусные белки; структурные нарушения вирусных антигенов; низкая активность выделенных белков. 5

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе выделения вирусных антигенов путем осаждения клеточно-культуральной 10 среды, экстрагирования антигенов раствором, содержащим хлорид калия, и последующего центрифугирования, осаждение клеточно-культуральной среды проводят смесью следующего состава, об%; 15

Твин 20 7 — 13

1070-ный раствор хлорида кальция 10—

32-4070-ный раствор ПЭГ (м,в, 40006000) на 20 растворе Хен кса р Н 7,2 — 7,4 Остал ьное при постоянном перемешивании в течение

4-5 ч при 4... 10 С, затем смесь центрифугируют при 4300 — 5200 g в течение 35-40 мин, 25 э экстрагирование антигенов из образовавшегося осадка проводят 0,02 -ным раствором Версена, содержащим додецилсульфат натрия и хлорид калия при следующем соотношении компонентов, г/л: додецилсуль- 30 фат натрия 8-12; хлорид калия 74-75, в течение 1,5-2 ч с последующим центрифугированием зкстракционной смеси при 860010400 g в течение 10 — 15 мин с отделением супернатанта. 35

Обоснование количества ингредиентов состава для преципитации (ПС) и экстрагирования антигенов (ЭС), используемых при осуществлении предлагаемого способа.

Отклонения; допущенные при приго- 40 товлении состава ПС и ЭС в сторону увеличения или уменьшения количеств влияют на качество получаемой субстанции вирусных белков. 45

Качественно-количественный состав

ПС и.ЭС обоснован оптимальными результатами выделения максимального количества обогащенной фракции вирусных. белков (табл.1).

Обоснование указанных режимов пред- 50 ставленно в табл. 2.

Такие ингредиенты, как Твин-20 (40 или

80), 10 -ный раствор хлорида кальция и додецилсульфат натрия, а также и композиционный ЭС и ПС предложены для выделе- 55 ния вирусных белков впервые. . Длительность хранения ПС и ЭС составляет 12+2 мес при 5+2 С, ПС получают следующим образом.

Предварительно готовят 32-40 -ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.в. 4000—

6000 на растворе Хенкса. Затем берут 7-13 мл Твина 20, 40 или 80, добавляют 10-20 мл

10%-ного хлорида кальция (коммерческий раствор в ампулах) и доводят смесь до 100 мл ранее приготовленным 32 — 40 -ным раствором ПЭГ.

Таким образом получают ПС следующих составов, мл:

l Твин-20 7

10%-ный раствор хлорида кальция 10

320 -ный раствор ПЭГ (м,в.4000) на растворе Хенкса рН 7,2 до 100

1! Твин-40 13

10 -ный раствор хлорида кальция

40 -ный раствор ПЭГ(м.в,6000) на растворе Хенкса рН 7,4 до 100 !

1l Твин-80 10

1070-ный раствор хлорида кальция

36 -ный раствор ПЭГ (м.в,5000) на растворе Хенкса рН 7,3 до 100

ЭС получают следующим образом. 0,81,2 г додецилсульфата натрия и 7,4-75 г хлорида калия растворяют в 10 мл 0,02%-ного раствора Версена (коммерческий).

Таким образом были получены следующие составы 3C:

И Додецилсульфат натрия 0,8 г

Хлорид калия 7,4 г

0;02 -ный раствор Версена (коммерческий) до 100 мл

V Додецилсульфат натрия 1,2 г

Хлорид калия 7,5 r

0,02%,-ный раствор Версена (коммерческий) до 100 мл

Vl Додецилсульфат натрия 1,0 г

Хлорид калия 7,45 r

0,02%-ный раствор Версена (коммерческий) до 100 мл

Пример 1. Выделение вирусного антигена из ККС, содержащей РСВ. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) штамм

" опя" культивируют по разработанному способу, однако возможно культивирование PCB любым другим известным способом.

ККС разделяют на 2 равные части, одну из которых — контрольную, обрабатывают известным способом. Опытную часть обрабатывают следующим образом.

В ККС, взятую в объеме 1 л с исходным титром 1:2095, вносят преципитационную смесь состава, мл, Твин-20 7

10 -ный раствор хлорида кальция 10

32%-ный раствор ПЭГ м,в. 4000 на растворе

1719432

Хенкса рН, 7,2 в количестве 200 мл до

100 мл

Полученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 ч при 4 С, затем центрифугируют при 4300 g, в течение 40 мин. Супернатант сливают, а к осадку добавляют экстракционную смесь (ЭС) состава;

Додецилсульфат натрия 0,8 г

Хлорид калия 7,4 г

0,02 (раствор Версена (коммерческий)

До 100 мл из расчета 7 мл ЭС на осадок, полученный из 1 л преципитированной ККС. Полученную взвесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке при 37 С в течение 1,5 ч и затем центрифугируют при 8600 g в течение 15 мин. Суперна ант в количестве 12 мл, содержащий белки в количестве 20,68 мг/мл, отделяют и используют в качестве сенситина для приготовления диагностикумов.

Пример 2. Способ проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве

П С используют состав, мл:

Твин-80 10

10%-ный раствор хлорида кальция

367,-ный раствор ПЭГ м.в. 5000 на растворе

Хенкса рН 7,3 До 100

Полученную смесь.инкубируют в течение 4 ч при 10 С, затем центрифугируют при

5200 g в течение 35 мин.

В качестве ЭС используют состав:

Додецилсульфат натрия 1,0 r

Хлорид калия 7,45 r

0,02%-ный раствор Версена До 100 мл инкубацию полученной взвеси проводят при 30 С в течение 2 ч и затем центрифугируют при 10400 g в течение 10 мин. Отделяют супернатант в количестве 9- мл, содержащий 18,32 мг/мл белка.

Полученные концентраты вирусных белков (PCB) анализировали на выявление титров антител в референс-сыворотках; определение структуры нуклеокапсида и наличие вирионов с помощью электронной микроскопии JЕМ-100B известным способом; содержание белка по методу Лоури.

Выделенные концентраты вирусных белков оценивают в реакции связывания комплемента (РСК) по цитопатическому действию (цПД) и в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ). Результаты титрований представлены в табл,З, где на примере серологических исследований изучена результативность получения РС-вирусных белков, 20

40 с данными электрофореза вирионов PC-виру45 са, клеток для культивирования РС-вируса и сыворотки крупного рогатого скота (КРС), Это

5

Представленные в табл. результаты по : титрованию вирусных белков, полученных по известному и предлагаемому способам, показывают преимущество предложенного способа. При анализе указанных цифровых данных можно отметить, что вирусные белки, полученные по предлагаемому способу, в 3-128 раз превышали по своей активности результаты прототипа.

В таблице.4 представлены усредненные данные по выходу белков, полученные в 19 опытах, а также результаты электронной микроскопии.

Как показывают результаты, приведенные в табл:4, содержание белков в концентрате,.полученном предложенным способом в 4 раза больше, чем известным.

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) на установке

"Мультифор 2117" (LKB, Швеция) с применением имидазольного буфера в 10% ПААГ без системы концентрирующего геля. Для лизированных вирусных белков и примесей использовали тот же буфер с ДСН без мериаптоэтанола. Окраску электрофореграмм проводили с помощью красителя кумаси (G — 250, "Serva", ФРГ), Общий белок полученных вирусных концентратов представляет собой вирусные белки, белки клеток для культивирования вируса, включенные в состав вирионов и белков среды культивирования (сывороточные белки).

При изучении электрофореграмм вирусных концентратов, полученных rio прототипу и предлагаемому способу, отмечено, что в последнем случае происходит полное расщепление не только вирионов, но и инфицированных клеток.

Электрофоретические исследования ви. русных концентратов, полученных по прототипу и предлагаемому способу, сопоставлены позволило выявить вирусспецифические и балластные белковые фракции, полученные на электрофореграммах. Материалы проведенных исследований представлены в табл.5.

Полученные результаты электрофореза позволили заключить, что с помощью предлагаемого способа удается получить значительно большее количество белков, чем по прототипу. Так, на фореграммах выявлено

10 различного молекулярного веса белковых фракций, среди которых присутствуют как высоко -,средне-, так и низкомолекулярные белки. В случае электрофореза вирусно1719432 го концентрата по прототипу возможно получение 4 фракций белка.

Было показано, что специфическими

РС-вирусными белками являются фракции белка с MM 160, 80, 56, 44, 37 и 24 кД. В это перечисление входят как белки суперкапсида, так и нуклеокапсида (ядро вируса). Представлен ные в табл.5 результаты электрофореза показали преимущество предлагаемого способа в сравнении с прототипом. Более того, тканевые белки, содержащие также и вирусные, могут быть с успехом применены для дальнейшей работы по приготовлению диагностических препаратов, Пример 3. Выделение вирусного анхигена из ККС, содержащей вирус диареи (ВД)

Вирус диареи, штамм "Оригон", культивируют известным способом, После получения вирусного урожая ККС разделяют на две равные части. Одну из них — контрольную— обрабатывают по прототипу. К другой части

ККС в объеме 1 л и исходным титром 1:4584 добавляют 220 мл ПС состава, мл:

Твин-40 13

10%-ный раствор хлорида кальция 20

40 -ный раствор ПЭГ м.в. 6000 на растворе Хенкса До 100

Полученную смесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 4 ч при 4 С, затем центрифугируют при

4300 g в течение 40 мин. Супернатант сливают, а осадок детергируют в 3С состава:

Додецилсульфат натрия 1,2 r

Хлорид калия 7,5 г

0,02%-ный раствор Версена До 100 мл

ЭС добавляют к осадку в количестве 5 мл на осадок, полученный от 1 л ККС, Полученную взвесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке при

37 С в течение 2 ч, Полученный экстракт клеток центрифугируют при 10400 g в течение 15 мин. Получают 9,8 мл супернатанта, содержащего 49,83 мг!мл белка.

В табл.6 представлены данные по определению активности выделенных вирусных белков.

Анализируя представленные в табл, 6 данные по определению активности выделенных вирусных белков в концентрате. можно отметить преимущество предлагаемого метода. При этом титры вирусных белков превышали аналогичные показатели прототипа в 4 — 8 раз, B табл.7 представлены результаты электрофореза полученного концентрата.

Из представленных в табл.7 результатов электрофореза видно, что с помощью предлагаемого способа удается выделить 16 фракций белка вместо 6 в прототипе.

5 Из 16 фракций 9 принадлежат суперкапсидной и нуклеокапсидной фракциям ВД, 4 — клеточным белкам и 3 — белкам сыворотки

КРС.

По прототипу ЭФ полученного концен10 трата позволяет определить только 5 вирусспецифических фракций белка.

В табл,8 представлены усредненные данные по выходу белка и результаты электронной микроскопии, полученные в 23 опы15 тах, Из приведенных данных видно, что выход белка по предлагаемому способу в 5 раз выше, чем в прототипе, Пример 4. Выделение вирусных бел20 ков из ККС, содержащей вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ).

Урожай вируса ИРТ, штамм М 4016, получают известным образом, ККС инкубируют при 5 С в течение 5 ч при постоянном

25 перемешивании на магнитной мешалке в присутствии ПС состава I.

Преципитационную смесь вносят в ККС в количестве 200 мл на 1 л ККС. Через 5 ч преципитированную ККС центрифугируют

30 при 5200 g в течение 35 мин, Супернатант сливают, а осадок детергируют в ЭС состава

V п рpи сcо0оoтTнHоoLшUеeнH ии : 6 мл 3С на осадок, полученный при приципитации 1 л ККС.

Полученную взвесь инкубируют при пе35 ремешивании при 37 С в течение 1 ч 20 мин и затем экстракт клеток центрифугируют при 11000 об/мин в течение 15 мин. Отделяют супернатант в количестве 9,54 мл и анализируют.

40 В табл.9 представлены результаты титрования полученного экстракта.

Из представленных в табл.9 материалов по титрованию вирусных белков в концентратах видно, что выделение вирусных бел45 ков по предлагаемому методу значительно превосходит прототип. Об этом свидетельствуют результаты титрований концентратов в РСК, ЦПД и РАЦ, где данные по предлагаемому методу превосходят прото50 тип в 2 — 8 раз.

Таким образом, независимо от видовой принадлежности, структурных и геномных особенностей предлагаемый метод позволяет получить вирусный концентрат, значи55 тельно обогащенной по белку, В табл.10 представлены результаты электрофореза полученного концентрата.

Представленные в табл.10 результаты электрофореза позволили заключить, что электрофоретическая характеристика ви10

1719432 таким образом значительно повысить выход - белка при одновременном повышении их активности. Располагая широким диапазоном различных белковых фракций, становится возможным получение строго специфических антисывороток для диагностики целого ряда вирусных заболеваний, что необходимо для своевременной и точной постановки диагноза. русного концентрата, полученного по предлагаемому варианту, содержит значительно большее количество белковых фракций, чем при форезе концентрата, полученного по прототипу: 15 фракций по предлагаемому 5 методу и 6 — по прототипу.

Из 15 фракций белка все, кроме фракций с MM 190 кД, являются вирусспецифическими, а из 6 — все 6 фракций. Однако в концентрате, полученном по предлагаемо- 10 му методу, на 9 фракций белка больше, чем в прототийе.

Таким образом, получение вирусного концентрата вируса ИРТ по сравнению с прототипом позволяет выделить обогащен-" 15 ный спектр белковых фракций суперкапсида и нуклеокапсидной фракции, В табл.11 представлены результаты по определению выхода белка и электронной микроскопии. Из данных табл.11 видно, что 20 выход белка по предлагаемому способу в 3 раза выше, чем в прототипе.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа состоит прежде всего в том, что для выделения белка на первом 25 этапе используется клеточно-культуральная среда, содержащая вирус и его антигены, обрабатываемая преципитационной смесью. Это позволяет в значительной степени преципитировать и осадить вирионы, 30 инфицированные вирусом, балластные (сывороточные) белки, свободные вирусные антигены. Затем; на втором этапе, применяя специально подобранный состав (экстракционная смесь), удается в максимальном 35 количестве экстрагировать из инфицированных клеток целый спектр вирусных белков, а также дезинтегрировать вирионы и

Формула изобретения

Способ выделения вирусных антигенов, включающий осаждение культуральной среды, зкстрагирование антигенов раствором, содержащим хлорид калия с последующим центрифугированием, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, осаждение культуральной среды проводят смесью следующего состава,. об 7:

Твин-20 7 — 13; 10 -ный раствор хлорида кальция 10-20; 32-40 -ный раствор полиэтиленгликоля (M,Ì, мол.М. 4000 †60) на растворе Хенкса рН 7,2 — 7,4 до 100, при постоянном перемешивании в течение

4 — 5 ч при 4-10 С, центрифугирование проводят 4300 — 5200 g в течение 35-40 мин, а экстрагирование антигенов — 0.02;(,-ным раствором Версена, содержащим додецилсульфат натрия и хлорид калия при следующем соотношении компонентов, г/л: додецилсульфат натрия 8-12; хлорид калия

74 — 75; 0,027;-ный раствор Версена остальное, в течение 1,5 — 2 ч, после чего экстракционную смесь центрифугируют при 8600-10400

g в течение 1.0-15 мин, а супернатант отделяютт.

Таблица1

Ингредиенты

Количество инг е иентов

Увеличение от казанного

Нарушение структуры вирусных белков

ПС 32-40 g,-ной водный раствор полиэтиленгликоля.(м.в

4000-6000) 10 -ной раствор CaCl г

Твин-20 (40 или 80 (коммерческий) 3C: Додецилсульфат натрия

KCL

0,020 -ный раствор Версена комме ческий

Уменьшение от казанного

Недостаточная преципитация вирусных белков

Неполное экстрагирование преципитата

1719432

Та бли ца2

Показатели Увеличение

Уменьшение

Инкубация ККС,содержащей

+ вирус более 5 при +10 С отрицательно сказывается на. структуре вьделяемого белка

Преципитания:

Инкуба ция

Инкубация ККС, содержащей вирус менее 4 ч при )4 С не позволяет добиться максимальной преципитации белков

Центрифугирование преципи" тированной КС, содержащей вирус, более 6000 об/мин в течение 35 мин отрицатель-. но влияет на структурные свойства выделяемой фракции белка

Центрифугирование преципитированной ККС .менее 5000 об/мин в течение 40 мин не позволяет получать плотный осадок преципитата, содержащего белки

Центрифугирование

Инкубация преципитата при выше 37 С в экстракционной смеси более 2 ч приводит к нарушению структурных образований выделяемой фракции белка

Экстра гирование:

Инкубация

Инкубация преципитата при

Е ниже 30 С в экстракционной смеси менее 1,5 ч приводит к значительному уменьшению вьделяемой фракции белка

Центрифугирование экстракта более чем при 12000 об/мин в течение 15 мин способствует уменьшению вьделяемой белковой фракции

5000 об/мин = 4300g

6000 об/мин = 5200g

Центрифугирование

Центрифугирование экстракта менее, чем при 10000 об/мий,. в течение 10 мин приводит к потере белка

10000 об/мин = 8600g

12000 o6/мин = 10400g

ККС - клеточно-культуральная среда

Габлица3

РСК

А

** В

В

*.A

I:121, +12,35

1:24576,6+8,35

* А- прототип

** В- предлагаемый способ

1:44,8+11,75 1:163,2+21,52 1,192,0+20,41

1 819,2+17,80

1:12S

1: l28

1:128

1:128

1;64

1:64

1:64

1:128

1:128

1;128

1:256

1:256

1:512

1:512

3:64 l:512

1:1024

1:1024

1:1024

1:1024

1:64

1:32

I:64

1:64

1:64

1:32

1:32

1:32

1:64

1:64

1: l28

1:128

1:128

1:128

1."256

1:256

1;256

1:64

1:64

1:128

1:128

1:256

1:256

1:128

1: l2S

1:256

1:256

1:1024

1:1024

1:2048

1:2048

1:2048

1:1024

1:1024

1:4096

1:2048

1:4096

1719432

1 t 1

1

1

1 !

I

1

I !

Ai с м

Ю

Э

It И ус0

Lt 1- CI

C и

8йй

РЗУ тФс о ал ах с о 8I8

3

О ф у

3 ж

9 и

Р о хо а а

IC *

lO Q

LA

« ф1 с

ОЪ

IFL

«

В

Й

Cl

AI

ОЪ

CO О

В зВВ

LA

LA ъО

Ct

В с

ВО

О

Cl

Cl ф.1

LA м

-О о

Ю

+I

LA м

l$t !

1

1

1

1 ! В

1 с

1 ВВЪ

1 4Н

В ВВЪ

I О1

1 О

i ВВ

1 е»!

vj

ОЪ

Cl

ВЧ! с

1 СВ

ОВ!

i У"!! i32

I O

1 °

° Э

I Z . 1

I Z

1 lO

1 и

1 Ф

I

1 Д

1

1 . 1 C 1

1

1

1 ! о !.+3

i o ! o

1 Ю

СВ .ф! с!

СВ о!

1

IlP ! о

IИ ! о

ВС

1 !! lO

1 I

1 lO с

I $LZ а2

В С» »Э. с

z о

1 !!

1 1

I 1

1 ! Ф I

1 1

lO 1 I

1 1

1 1

I 1 з! 1

1 1

lO е !

I!! I! I

1 1

1 1

1 I

I 1! I

1 1

I L! I

1 !

В i

t б

В I! I

1 1

I 1

1 I

1 1

1 I

I I

I 1

1 !! 1

1 1! !

1 1

I 1! I

I I- 1

IЭ I

1! а

1 I

I 1! I

I 1!

1 !

1 !

1 1 б I

I I

I I

1 1! I

1 1

I 1

1 1

1 1

1 I

1 1

1 1

1 1.1 I.1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

I 1

1 1

1 1

1 IC 1

1 t!CO 1 хиа! а

Л,Cti

1 LC CL Y (1 1

1 1

I ° Z 1 ! 6

1 Я 1

I g 1

1 1

1 IC 1

I ф

1 Х 1

1 Я I

Э

lO 1 Э аi с ! l Ct 1.

Э 1 ° 1 В

I Y I

1 1 1

R!

О i 1 1 у 1 и э 1 ! оу 1 а В.В

1- хо.

1 Z Л I

1 1- Х Э 1

1 — — "

I i

1 I

1 1

1 ф 1

Ы

« В

1

1

1

1 !

I 1

1 Ъ» а

I Z

1 Ф

Э I з а

1- У

ФВВ

Я 1 В IC. и! «е

Х I Ф

1 1-1 LO

О И и В - .1

1-Ф Вo

Z С I О.

ВВ Я I

Ф i LI

Ct X >э о у а

1 Э ! I

1

1 х

lk

Эа

1 IC

1 В

I Я, 1 .

1 О.

1 \В

I lO

Л ! Э ! Йй

I I О.

ag ! Й! ! О

1719432

Таблица5

Тэблицаб

1:42,0+8,51 1:5,6+1,35 1:38,4+3,95 1:15,2+4,72 1;62,4+7,10

Таблица7

1719432

I (1 !

I

1

1

1

I .

I !

1 ! !

1 !

3 Э

t l ! l0 а

1 I

1. Х

1 Э б х о х

I

I ilI

1 З (х. т

1 Э (z о

I 0C

1 ! !

1

I

1 !

1

t ! 0

1 с 1 с t

1 1 Х

1 I 3 б (О ю о

X 1

С I

0l 1

l- 1

Ф 1 (0 1 (О 1

Х о.!

I

3 ! (Э

3 Z

1 Ct о х

v б

1 б.

I

I !

I

1

I

1 б

1 с б

СюЪ ъо с ъ с(б

1 (I L0 3

1 X I

I. C

i Я

v !

I Е

I Y I ! ф (1

z 1 ,а

1 (- с х

1 Э I

3 I

I Oc I

1 3

3 1

Y 3

I 8

1 m 1

1 (О ю >хл I

z 1

g X о

31

1 1

Х I

1 ZhC I

Х 0Э ю иа б л l

1 CL 0I

1 X I

I 0l Ф о а х

OO с!

*!

ОЪ

С

О\ !

0О

О Ъ

Ln

00 с 3

*!

ОЪ

Ф

Ln

33\ л

Ln

ОЪ

LlL

ОЪ

0!.

Са3

33Ъ

МЪ

ЪО л с 3 .н

LA

+1

00 — с ——

1 Х t

1 g 1

1 Э t

3 LO y х . с

I S L

l,ß Х 1

i о 1

ОЪ

0Ъ

4!

М\ х

ОЪ

Сю

LO

+3

an

С!.

1 ! Ф ! ((0

1 V

C3 Y хо

1 03CL

t а

1 l

1 X

IиЪ с"Ъ л

+! л

Ф

ОЪ

ЪО

Ln

° С! — — —

I 00 (0 00

I М

I х7

I Э б P

lO ю о с 4

0.!

С!

Сю

Сб

IH

Ci

LD

I

0l

l (О

C х

I о

f >х

1

1

1

CO . 1

i0 I

I

X I

1

1

0l 1

3» 1

1

1

1 !

3

3 ю б

1

I ю ю (1

1

1

I !

I (I (I

1 с

t

I .!

1 с

I

1

1

1

I !

I

I !

3 (1

I

1

1

1

1

1

1

1

1 !

I

I

I б

1

1

1 . с б

1 х б З

Э Ф X

z аи

ZI-Л

Эхаа

xmxo .ЛОФ х с х о о э,з

1 Х . 1 х * ,х Ф

L0 Ч О о лх. х аС00 зхэ

1 LO ЮЪО

1 о

Y m

m03x8

g z

ZZZ3Эао а х Ф э

zэ(YmCv

Лаg Э

3- О

ourn C

I (lm

Z I- Z

„u

mvvYуИ

mzuz

ДЭC д х х ф

mz52 и

m э гСх

Ссаа о о л

Х03 ХС.

1 . 1

1

1

1 б

t !

1

1

1

1

1 (0 I

Х(3( л(I

3

1

1

1

1

I

1

I !

1

1

1

I

I !

1 б бх (Ci

1 .1

1 .1 ), l2 () (х ! о

3 а

3 X

I Ф

1 С (i0

1 Я а

1 Э б Ct

1 (°

1 l5

1 0f а о

1 CC

i 30 х

Ф а

C ! CL8 л

Il 4l

С

1 Л Y

1 Y

Яч г о >х

3 I" X

I Э Я

il Ф

1 1

3 33

1

30! !

1719432

Таблица9

Ф,

Табл и ца10

- первичная культура почек телят.

Таблица 11

Показатели

Конечные, в концентрате

Исходные

Электронная микроскопия

Структура нуклеокапснда 822,7 сохранена, количество его увеличено. Отмечено болыюе количество зирионов ИРТ

llp94ËÂÃ36 иый метод

Отмечено значительно 260,4 меньюее количество нуклеокапсида с частично и полностью изиененной структурой

ККС - клеточно-культуральная среда, содерхзцая вирус инфекционного ринотрахеита

Общий белок по Лэури (ИРТ).

Составитель 3.A.Ìàêàðèí

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Малец

Редактор О.Осиповых

Заказ 741 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул.Гагарина, 101

Получвние концентрата вирусных белков

Объем ККС ОД, Титр вируса в Общий белок, Объен, нп Титр вирусных Обций белок, нл PCK нг/мп белков в РСК иг/нл

1000+8,5 1:2549,7+5ь17 5,4920,85 1021,2 1 88477,2+15,49 45,17З4 ° 05

100010,8 t:2549,725,17 5,492О,85 10М,09 10258,92Е,17 14,ЗжЗ,17 онмзд вирусных белков1а