Штамм вируса гриппа а(h10n1) для приготовления диагностических препаратов

 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусологических диагностических препаратов. Цель изобретения - используя метод рекомбинации , получить новый вариант штамма-рекомбинанта вируса гриппа H10N1, обладающего специфической иммуногенной активностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа. Штамм (Ш) вируса гриппа A(C10N1) представляет собой селекционированный рекомбинант вирусов гриппа человека и птиц с новой антигенной формулой. LL агглютинирует эритроциты кур в титрах 1:640, активно репродуцируется при оптимальной

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

p0 Ii

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4842334/13 (22) 11.05.90 (46) 30.03.92. Бюл. № 12 (71) Институт микробиологии и вирусологии

АН КазССР (72) Р.Я.Подчерняева, М.Х,Саятов, К,Д,Даулбаева и Г.А.Данлыбаева (53) 576.8.94.29 (088.8) (56) Эпидемиология — В кн. Вирусы гриппа и грипп /Под ред, Э.Д.Кильбурна. М„1978.—

1,526-580.

Мигрпу В,R., Вuñkiег — В/hite А,J

London W.Т. et al, Avian-human reassortant in

fluenza А viruses derived by mating avian and

kuman influenza А viruses.— J, Infect. Dis.—

1984.— vol. 150, N 6.— р. 841 — 850. (54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А(Н10 N1)

ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусологических диагностических препаратов. Цель изобретения — используя метод рекомбинации; получить новый вариант штамма-рекомбинанта вируса гриппа H10N1, обладающего специфической иммуногенной активностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа.

Штамм (Ш) вируса гриппа A(C10N1) предИзобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусологических диагностических препаратов, „„5U„„1723120 А1 ставляет собой селекционированный рекомбинант вирусов гриппа человека и птиц с новой антигенной формулой. Ш агглютинирует эритроциты кур в титрах 1:640, активно репродуцируется при оптимальной (37 С), повышенной (40 С) температурах в течение 48 ч до инфекционного титра 8,5—

8,75 lq ЭИ05о/0,2 мл. Полученный рекомбинант репродуцируется в клетках МДСК до Ig

4,0 ТЦД50, в клетках Чего 4647 до Ig 3,0

ТЦД5о, в клетках ВНК-21 до Ig2,0 ТЦД5о и первичных клетках ФЭЧ до Ig 2,0 ТЦД5о.

Проявляет слабо выраженную патогенность (2,0 ig LDso) в сравнении со штаммом

A/PR/8/34 (H1N1), вызывающим гибель мышей в дозе 4,0 ig LDgo. НА рекомбинантного

LIl R-1 более устойчив к прогреванию, чем

НА реципиентного родительского штамма.

Ш по сравнению с родительскими вирусами и роя вляет высокую интерферонп родуцирующую активность в органных культурах легких человека. Имеет следующий генный состав: гены NP, NAM, NS — от штамма

А/PR/8/34; гены РВ1, РВ2, РА, НА — от штамма А (травник) Алма-Ата /760/79, Штамм депонирован под номером ГКВ ¹ 4

2235. Рекомбинант может быть использован, Я для производства диагностических препа- () ратов, предназначенных для индикации а вновь изолированных вирусов гриппа и обнаружения антител в сыворотках различного видового происхождения. 2 табл. !

Возможность зкспериментального получения антигенных рекомбинантов, обладающих гемагглютинином одного вируса и нейраминидазой другого, продемонстриро1723120 вана рядом исследователей, Большое количество подобных штаммов в последние годы изолировано от диких и домашних птиц и в естественных условиях в результате широко развернутого экологического изучения диких птиц в различных странах. Однако отсутствуют сведения о получении штаммарекомбинанта вируса гриппа человека и птиц с сочетанием поверхностных антигенов H10NI.

Цель изобретения — используя метод рекомбинации, — получить новый вариант штамма-рекомбинанта вируса гриппа

H10N1, обладающего специфической иммуногенной активностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа.

Штамм получен в опытах рекомбинации между вирусом гриппа человека А/PR/8/34 (H1N1) и вирусом гриппа птиц А/Травник/Алма-Ата/760/79 (H10N5). Направленная селекция проводилась в системе куриных эмбрионов в присутствии гипериммунной сыворотки к рекомбинантному штамму H1N5, После 5 последовательных пассажей в присутствии сыворотки выделен рекомбинант, обозначенный R-1 с антигенной формулой H10N1, Полученный рекомбинант трижды клонирован методом предельных разведений и был генетически стабилен. Антигенная характеристика и результаты изучения генетических признаков у родительских вирусов и рекомбинантов представлены в табл. 1 и 2.

Из таблицы следует, что рекомбинант обладал гемагглютинином птичьего вируса—

Н10 и нейраминидазой N1 человеческого штамма.

Представленный штамм депонирован под номером ГКВ N. 2235 и имеет следующие молекулярно-биологические свойства, Адаптационные свойства. Полученный рекомбинант активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (36 С), повышенной (40 С) температурах до инфекционного титра 8,25 — 8,75 ig

ЭИДво/0,2 мл и менее активно при пониженной (28 С) температуре инкубации, Рекомбинант обладает высокой гемагглютинирующей (титр 1/512 — 1/1024) и иммуногенной активностью, Полученный рекомбинант репродуцируется в клетках МДСК до 4,0 Ig ТЦДю, в клетках Чего — 4647 до 3,01g ТЦД о, в клетках ВНК-21 до 2,01g ТЦДьо и в первичных клетках ФЭЧ до 2,01g ТЦД о.

У рекомбинанта R-1 степень репродукции в органных культурах почек эмбриона человека на 1 — 21g была выше способности к реп родукции обоих родителей (А/PR/8/34, А/Травник/Алма-Ата/760/79).

Терморезистентность (Ты — признак), Селекционированный рекомбинант обладает так же, как и один из родительских штаммов А/PR/8/34 (H1N1), терморезистентным гемагглютинином (Ты — 2 ч). Однако гемагглютинин вируса-рекомбинанта был более устойчив к прогреванию, чем гемагглюти10 нин другого родительского штамма А/травник/Алма-Ата/760/79.

Патогенные свойства. Исследуемый штамм-рекомбинант проявляет слабо выраженную патогенность (2,01g LDso) для

15 белых мышей по сравнению со штаммом

А/PR/8/34 (H1N1), вызывающим гибель животных в дозе 4,01g LDso.

Молекулярно-биологический анализ.

Анализ генов предлагаемого штамма пока20 зал, что рекомбинант R-1 приобрел от родительского штамма А/РВ/8/34 4 гена (NP, NA, M и NS), остальные 4 гена (РВ1, РВ2, РА, HA) — от другого родителя А/травник/АлмаАта/760/79, 25 Пример, Диагностическую иммунную сыворотку получают на кроликах породы шиншилла или на белых крысах. В качестве антигена для иммунизации используют элюат вируса из формалинизированных

30 эритроцитов кур, Титр гемагглютининов составляют 1/1024., Схема иммунизации. Кролику непосредственно в оба подколенных лимфатических узла вводят 0,1 мл антигена с

35 адьювантом. Через месяц повторно инъецируют.антиген в том же количестве, но без адьюванта. Антиген разводят в большом количестве физиологического раствора и вводят кроликам внутривенно (0,2 мл), 40 внутримышеч: о (передняя лапа; 0,4 мл) и в область одного из подколенных лимфатических узлов (0,4 мл). Кровь у кроликов берут из краевой вены уха через 10 — 14 дней после иммунизации.

Специфичность и активность антисывороток определяют в РТГА, Полученные сыворотки имеют титр антигемагглютинирующих антител 1:5120 и выше.

Иммунную сыворотку освобождают от неспецифических ингибиторов обработкой отечественным препаратом нейраминидазы из нехолерного вибриона (RDE).

Предлагаемый штамм-рекомбинант вируса гриппа A(H10N1)-R-1 и изготовленный на его основе диагностический препарат может найти применение в вирусологической практике для идентификации вновь

1723120 выделенных штаммов и изучения иммунологической структуры населения, домашних и диких животных.

Таблица!

Изучение антигенного состава родительских штаммов и рекомбинанта

РПНА

Штаммы и рекбмбинант

А/PR/8/34 (Н1К1) А/PR/8/34 A/öûïëåíîK/I ep(H1N1) мания/49 (Н10Н7) А/травник/ААта/760-79 (Н10N5) /травник/Ата/760/79

Н11Л ) 1/80

1/1280

1/80

1/1280

1/1280

1/80

1/160

1/640

Т а б л и ц а 2

Антигенные и биологические свойства родительских штаммов и рекомбинантов т„p rcI - (ЕИД а 10) (ч)

28 37 40

Антиген- НА ные свойства

Штаммы и рекомбинант

640 2 4,0 5,0 8,0 5,0

H1N1

H10N5 160 1 - с1,0 7,25 8,75

H10N1 640 2 2,0 4,5 8,5 8>75

40

50

Составитель P.Ïoä÷åðíÿåâàÿ

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор О,Кундрик

Редактор Н.Горват

Заказ 1042 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

A/PR/8/34

А/травник/Алма-Ата/

760/79

R-1

A/PR/8/34

А/травник/А-Ата/

/760/79

R-1

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа A(H10N1), ГКВ N.

2235, для приготовления диагностических препаратов.