Штамм вируса гриппа а/япония/1/57(h2n1) для моделирования инфекции у мышей

 

Использование: медицинская вирусология для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции. Сущность изобретения: штамм вируса гриппа А /Япония/ 1 /57 (H2N1). Штамм способен размножаться в легких мышей, вызывать у них летальную пневмонию и относится к антигенному подтипу гемагглютинина (Н2). 3 табл. инфекции, но оно должно быть нетоксичным на всех уровнях его изучения и использования . До момента внедрения научных результатов в клиническую практику необходимо проведение опытов по отбору кандидатов в вакцинные штаммы и скрининг химиопрепаратов . Для этих целей необходимы чувствительные к гриппозной инфекции экспериментальные лабораторные модели и вирусы гриппа, способные размножаться в организме восприимчивого хозяина. Широкое практическое использование мышей, их низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более редких и дорогих животных, например хорьков , обезьян. Поражения легких, вызываемые вирусом гриппа у мышей, представляют собой вирусную пневмонию, похожую во многих отношениях на вирусную пневмонию у человека. Необходимо отмесл С ч| со сл со о со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)я С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4847535/13 (22) 09,07,90 (46) 23,05,92. Бюл, ¹ 19 (71) Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского (72) Ю.А.Смирнов, Е,А.Говоркова, А.А.Кизина, С.С.Ямникова и Д.К,Львов (53) 576.8,094.29(088.8) (56) Правдина Н,Ф.. Подчерняева Р,Я,. Сковородка В.В. и др. Активность вирионной

PHK-полимеразы у вариантов вируса гриппа А и В, различающихся по признаку патогенности для мышей. — Вопросы вирусологии, 1986, № 12, с. 29-33.

Verilizier J.Ë ., Allison А.С., Schild G.Ñ.

Immune responses to influenza in the mouse

and their control of the infection, British.

Medical Bulletin, 1979, v. 35, р. 65-68, Изобретение относится к медицинской вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А человека, адаптированный к размножению в легких мышей.

Предлагаемый штамм пригоден для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции, что позволит определить протективные свойства вирусов с разной антигенной формулой и проводить скрининг химиопрепаратов.

Эпидемическое распространение гриппа во всем мире и экономические потери, связанные с временной нетрудоспособностью, выдвигают проблему гриппа в число важнейших. Трудность ее практического решения — отсутствие достаточно эффективных средств специфической вакцино- и химиопрофилактики, что в значительной мере обусловлено высокой вариабельностью вирусов гриппа. Действие антивирусного химиопрепарата должно быть направлено не только на определенный этап вирусной Ы 1735363 А1 (54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А /Япония/

1/57 (H2N1) ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИИ У МЫШЕЙ (57) Использование; медицинская вирусология для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции. Сущность изобретения: штамм вируса гриппа А /Япония/ 1/57 (H2N1). Штамм способен размножаться в легких мышей, вызывать у них летальную пневмонию и относится к антигенному подтипу гемагглютинина (Н2). 3 табл. инфекции, но онодол>кно быть нетоксичным на всех уровнях его изучения и использования.

До момента внедрения научных результатов в клиническую практику необходимо проведение опытов по отбору кандидатов в вакцинные LUTaMMtl и скрининг химиопрепаратов. Для.этих целей необходимы чувствительные к гриппозной инфекции экспериментальные лабораторные модели и вирусы гриппа, способные размножаться в организме восприимчивого хозяина. Широкое практическое использование мышей, их низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более редких и дорогих животных, например хорьков, обезьян. Поражения легких, вызываемые вирусом гриппа у мышей, представляют собой вирусную пневмонию, похожую во многих отношениях на вирусную пневмонию у человека. Необходимо отме1735363 тить, что в естественных условиях мыши резистентны к инфицированию вирусами гриппа.

В настоящее время известны штаммы вируса гриппа А, вызывающие летальную пневмонию у мышей — А/WSN /33/ (H1N1), А/PR/8/34 (H1N1), А/СССР/90/77 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2). Наиболее известным является штамм А/Aichi/2/68, прошедший более 100 пассажей через легкие мышей и обладающий высокой пневмовирулентностью, Вирулентные для мышей штаммы используются как для решения задач практического здравоохранения (определение протективных свойств при отборе кандидатов в вакцинные штаммы, изучение активности химиопрепаратов), так и в научных исследованиях.

Указанные аналоги представляют собой штаммы вируса гриппа А с гемагглютинином подтипа Н1 или НЗ. Заявляемый штамм А /Япония/ 1/57 (H2N1) сходен с вышеперечисленными аналогами по существу, но представляет собой новый в антигенном отношении вариант. Штамм относится к вирусам гриппа А с гемагглютинином подтипа

Н2, К преимуществам данного рекомбинантного штамма относится наличие в его составе нейраминидазы N1, что отличает его от других штаммов с гемагглютинином подтипа Н2 и позволяет устранить влияние антинейраминидазных антител на результаты опытов по выявлению протективных свойств этих штаммов.

Цель изобретения — получение вирулентного для мышей штамма вируса гриппа, пригодного для моделирования экспериментальной инфекции, История получения штамма.

Штамм получен в результате 22 последовательных пассажей через легкие белых мышей массой 6-8 r при интраназальном заражении. При первичном инфицировании в качестве исходного материала использовали неразведенную аллантоисную жидкость, s дальнейших пассажах — 10/-ную суспензию легких белых мышей, забитых через 48 ч после заражения.

Предлагаемый штамм обладает всеми признаками и характеристиками вируса гриппа А и хранится в коллекции лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР (кодовый номер ГКВ 2336), Штамм характеризуется следующими морфологическими, биологическими и антигенными свойствами, Морфологические признаки. При негативном контрастировании в популяции содержатся вирионы гриппа стандартной

15 сферической формы со средним диаметром

80-120 мм (75,07). Имеются также каплеобразные формы (24,0 ), большие сферы (1,0 ). Следует отметить, что при исследовании 200 частиц в популяции адаптированного к мышам штамма А /Япония/ 1/57 (H2N1) по сравнению с исходным отмечено увеличение каплеобразных и больших сферических форм с 1,5 до 25,0 (табл. 1), Биологические свойства. Исходный вариант не размножался в легких белых мышей, Однако в ходе пассирования происходит селекция мутантов, приобретших способность размножаться в организме другого хозяина (мыши), при этом наблюдается изменение инфекционной активности, гемагглютинирующих свойств.

Инфекционная активность адаптированного штамма — 7,7 Ig ЭИД 50/0,2 мл, Антигенные. свойства. По антигенной композиции гемаггл ютин ин à (on ределяемой в РТГА с поликлональными крысиными сыворотками) адаптированный штамм не

20 отличается от исходного (табл. 2). Отмечены

25 различия в способности связываться с моноклональными антителами N 1, N 185, N

342 к гемагглютинину Н2. Показана большая реактивность вирулентного для мышей

I . штамма А /Япония/ 1/57 взаимодействовать

30 с моноклональными антителами к М-белку, наибольшие различия установлены для 3 антигенного сайта (табл. 3), Иммуногенные свойства. Предлагаемый штамм обладает способностью более ак35 тивно вырабатывать антитела у мышей по сравнению с исходными авирулентными для мышей штаммами вируса гриппа.

Патогенность для мышей. Адаптированный вирус вызывает выраженные патологи40 ческие изменения в легких, а также гибель мышей в течение 10 ут наблюдения. 50/ гибели животных отмечено при интраназальном введении 50 мкл вируса в разведении 105,1, т.е. Ig ЛЦ 50 = 5,1, Вирулентность

45 адаптированного к мышам штамма равна

1,5.

Физико-химические свойства. При исследовании электрофоретической подвижности белков в ПАГе отмечены минорные

50 вариации для НА- и NP-белков у адаптированного штамма по сравнению с исходным.

Предлагаемый штамм предлагается использовать для изучения проективных свойств штаммов вируса гриппа А с гемагг55 лютинином подтипа Н2 как человеческого, так и животного происхождения, После иммунизации мышей инактивированными препаратами вируса интраназально вводят адаптированный штамм А /Япония/ 1/57 и определяют уровень защиты.

1735363

Таблица 1

Вирулентность для мышей

Ig ЛД50

Название материала

Инфекци онная ак тивность, Ig Э ИД50 каплеоб- гигантразные ские филаментозные сферические

Исходный штамм А/Япония/57

Адаптированный штамм

А/Япония/57

98.5

2.0

Нет

0,5

7,7

5,1

45

Таким образом, предлагаемый штамм А

/Япония/ 1/57 сходен по способу получения с другими вирулентными для мышей штаммами, однако обладает важной особенностью — он относится к другому анти- 5 генному подтипу гемагглютинина (Н2), Эта особенность, наряду с достаточно высоким показателем ЛДьо, является основным преимуществом заявляемого штамма. Использование предлагаемого штамма позволит 10 изучать перекрестные протективные свойства вирусов, относящихся к Н2-подтипу гемагглютинина. Адаптированный к мышам штамм А /Япония/ 1/57 наряду с вирусами гриппа А с гемагглютинином Н1 и НЗ может 15 быть использован для изучения действия различных химиопрепаратов в опытах с экспериментальной гриппозной инфекцией.

Пример, Моделирование экспериметальной гриппозной инфекции у мышей. 20

Для оценки протективных свойств различных штаммов вирусов гриппа А с гемагглютинином подтипа Н2. изолированных от человека и птиц, был использован предлагаеимый адаптированный к мышам штамм ви- 25 руса гриппа А /Япония/ 1/57 (H2N1).

Мышей F(DWR) массой 6-8 г (в каждой группе по 25 шт.) иммунизировали инактивированными Р-пропиолактоном (0,015 М конечная концентрация) препаратами виру- 30 сов гриппа А (Н2), В работе использовали следующие llJTGMMbl; А /Япония/ 1/57 (H2N1), А /Ленинград/ 1468/65 (H2N2), А

/Токио/ 3/67 (H2N2), А /утка/ /Германия/

1215/73 (H2N3), А /утка/ Нью-Йорк / 35

6686/78 (Н2МЗ), А /шилохвость/ Альберта/

211/80 (H2N3), А /чайка-хохотун/ НьюДжерси/ 75/85 (H2N9). Для каждого п репарата определяли дозу =20 мкг белка/мышь, гемагглютинирующую и инфекционную активности (до обработки Р-пропиолактоном).

Через 21 день после предварительного определения титра антител в сыворотках животных каждой группы под легким эфирным наркозом мышам интраназально вводили по 50 мкл патогенного для них штамма вируса гриппа А /Япония/ 1/57 в дозе 3 ЛДщ.

Гибель мышей регистрировали в течение 10 дн. после заражения, затем высчитывали % выживаемости животных. B контрольной группе животных (получавших плацебо-р-р

БСА на физиологическом растворе) гибель животных составляла 100%, В остальных группах эти показатели колебались от 0% до

58,0%, Сравнительный анализ полученных данных о степени защиты экспериментальных животных, получавших препараты различных вирусов гриппа А (Н2), позволяет судить о перекрестных протективных свойствах вирусов. Суммарный анализ этих результатов, а также данных об антигенной специфичности поверхностных белков, позволяет судить о возможности внедрения в человеческую популяцию вирусов гриппа А (Н2) птиц, продолжающих изолироваться и в современных условиях, Формула изобретения штамм вируса гриппа А /Япония/ 1/57 (H2N1) ГКВ 2336 для моделирования вирусной инфекции у мышей.

Мо ология ви ионов, 1735363

Таблица 2

Таблиц.а 3

Составитель Ю. Смирнов

Редактор Н. Гунько Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Заказ 1793 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101