Способ получения очищенной биомассы вируса гриппа

 

Изобретение относится к биологии, вирусологии, микробиологической технологии, а именно к очистке вирусов и может найти применение при изготовлении вакцин. Цель изобретения - повышение чистоты и выхода биомассы целевого продукта. Указанная цель достигается за счет использования в качестве сорбента никельсодержащего поливинилспиртового волокна и проведения отделения вируса сорбцией только балластных белков вируссодержащей жидкости погружением в вируссодержащую жидкость 4 - 6 порций никельсодержащего ПВС-волокна при времени контакта каждой порции волокна с вируссодержащей жидкостью 2 - 5 мин. При этом ПВС-волокно содержит 2 - 3 мас.% никеля, а соотношение объем вируссодержащей жидкости: сорбент равно 50 - 60 : 1. 2 табл.

Изобретение относится к микробиологической технологии, а именно к очистке вирусов, и может найти применение при изготовлении вакцин и вирусных антигенов, что особенно важно в период массовых эпидемий, когда необходимо обрабатывать большие количества вирусного материала. Целью изобретения является повышение чистоты и выхода биомассы целевого продукта. Указанная цель достигается использованием в качестве сорбента никельсодержащего поливинилспиртового волокна (ПВС) и проведение отделения вируса гриппа сорбцией только балластных белков вируссодержащей жидкости погружением в вируссодержащую жидкость 4-6 порций никельсодержащего ПВС-волокна при времени контакта каждой порции волокна с вируссодержащей жидкостью 2-5 мин. При этом ПВС-волокно содержит 2-3 мас.% никеля, а соотношение объем вируссодержащей жидкости : сорбент равно 50-60. П р и м е р 1. Никельсодержащее ПВС-волокно с содержанием никеля 2,5 мас. % погружают в вируссодержащую жидкость при соотношении объема вируссодержащей жидкости: сорбент, равном 55:1, выдерживают в вируссодержащей жидкости в течение 4 мин. Волокно вынимают из жидкости. В эту же вируссодержащую жидкость погружают новую порцию никельсодержащего ПВС-волокна с содержанием никеля 2,5 мас.% при нижнем соотношении объем вируссодержащей жидкости: сорбент равном 55:1 и выдерживают в течение 4 мин. Волокно вынимают из жидкости. Повторяют описанный процесс еще 3 раза (всего число погруженный волокна в вируссодержащую жидкость 5). Определяют содержание белка и вируса в нативной вируссодержащей жидкости (до погружения первой порции волокна в вируссодержащую жидкость) и в очищенной вируссодержащей жидкости (после контакта со всеми пятью порциями волокна). Степень очистки по белку определяют по следующей формуле: K = , где С₁ - концентрация белка в исходной (нативной) вируссодержащей жидкости, мг/мл: С₂ - концентрация белка в очищенной вируссодержащей жидкости (после контакта с порциями сорбента), мг/мл. Определение белка проводят по двум методикам по методу Лоури. Определение вируса гриппа проводят по стандартной методике измерения гемагглютинирующей активности (ГА). Определение биологической активности вируса гриппа проводят по методике ИА. Примеры, характеризующие способ получения очищенной биомассы вируса гриппа при различных параметрах процесса приводятся в табл.1. Из данных таблицы следует, что оптимальным количеством порций волокна является 4-6 (опыты 1, 2, 4). Уменьшение количества порций волокна при сохранении времени контакта приводит к снижению степени очистки вируса по белку (опыт 13), а увеличение количества порций волокна при сохранении времени контакта нецелесообразно, так как делает процесс экономически не выгодным из-за дополнительного расхода волокна, кроме того, не приводит к изменению степени очистки по белку. Оптимальным временем контакта каждой порции волокна является 2-5 мин (опыты 6, 8). Сокращение времени контакта (опыт 7) приводит к ухудшению характеристик получаемой очищенной биомассы вирусов. Увеличение времени контакта больше 5 мин (опыт 9) не приводит к дальнейшему измению степени очистки по белку. Содержание никеля в волокне оказывает существенное влияние на сорбционные свойства волокна, а следовательно, и на характеристики получаемой очищенной биомассы вируса. Оптимальным содержанием никеля является 2-3 мас. % (опыты 1, 10, 12). Снижение содержания никеля (опыт 11) ведет к ухудшению выбираемости белков из вируссодержащей жидкости. Увеличение содержания никеля (опыты 13, 14) приводит к тому, что начинается сорбция вируса, следовательно, уменьшается его содержание в получаемой очищенной биомассе вирусов. Уменьшение соотношения объем вируссодержащей жидкости: сорбент приводит к непроизводительному использованию волокна и, кроме того, в небольшой объем жидкости невозможно загрузить достаточно большое количество волокна (опыт 15). Увеличение соотношения объем вируссодержащей жидкости: сорбент приводит к снижению выбираемости белка (опыт 16). Введение в состав ПВС-волокна другого металла (опыты 18, 19, 20) или использование ПВС-волокна, не содержащего металл, (опыты 21, 22) не обеспечивает достижение цели. По поводу выхода биомассы вируса (опыт 7, табл.1), который характеризуется сохранением активности вируса по способности вируса давать реакцию агглютинации с куриными эритроцитами 100%-ное сохранение ГА говорит о том, что биомасса вируса полностью сохраняется в исходном растворе (не сорбируется волокном), а извлекаются только балластные белки. 100%-ное сохранение биомассы наблюдают независимо от исходного содержания вируса в вируссодержащей жидкости (по реакции агглютинации с куриными эритроцитами). Статистическую достоверность результатов рассчитывают по критерию Кохрана. Расчетное значение сравнивают с табличным, если величина σ_тр не превышает критическую, заключают, что дисперсии однородны и результаты следует считать воспроизводимыми. σ_тр - 0,41 меньше табличного ( σ_тр - 0,87), то с 95% доверительной вероятностью можно считать, что опыты в оптимальных условиях воспроизводимы. Доверительный интервал, соответствующий Р = 0,95, равен 0+2 σ для степени очистки по белку 2 σ = 0,075. Степень очистки по белку лежит в интервале 8 ± 0,075. Для показателя сохранения активности по ГА σ_тр = 0,8, что меньше табличного значения ( σ_тр 0,87), 2 σ = 0,46 . Таким образом, сохранение активности по ГА лежит в интервале 8 ± 0,46, а для степени сохранения активности, т.е. процента 100 ± 5,6%. Для показателя степень сохранения активности вируса по ИА σ_тр=0,83, что меньше табличного значения ( σ_тр 0,87) 2 σ_тр =0,084. В табл.2 даны технологические параметры процесса и биологические характеристики очищенной биомассы вируса гриппа. П р и м е р 2. Приводят сравнительные данные по степени очистки и выхода биомассы продукта по известному способу (2) и по предложенному способу (табл.2) Известный способ. 1 стадия сорбция вируса. Для получения очищенной биомассы вируса через колонку, заполненную сорбентом (Амберлит ХЕ-67) пропускают вируссодержащую жидкость со скоростью 100 мл/ч, т.е. за 1 ч можно очистить 100 мл вируссодержащей жидкости II стадия: десорбция вируса сорбента со скоростью 100 мл/ч, т.е. общая продолжительность процесса получения очищенной биомассы вируса 100 мл за 2 ч. Выход вируса по ИА - 100 % . Степень очистки по белку 3 - 4 раза. Предложенный способ. Исключаются стадии сорбции и десорбции вируса сорбентом, т.е. сокращение общего времени процесса. Время процесса для очистки 110 мл вируссодержащей жидкости за счет сорбции белков равно 4 мин х 5 = 20 мин. При этом процесс проводится следующим образом: никельсодержащее ПВС-волокно массой 2 г погружают в вируссодержащую жидкость объемом 110 мл и выдерживают в ней 4 мин. Волокно вынимают и в эту же вируссодержащую жидкость объемом 110 мл погружают новую порцию волокна. Волокно вынимают и повторяют процесс еще 3 раза. Следует отметить, что на всех стадиях получения очищенной биомассы вирусов соотношение вируссодержащая жидкость: сорбент равно 55. Общее время процесса: 4 мин х 5 = 20 мин. При этом объем очищенной жидкости 110 мл. Выход вируса по ИА = =100%. Степень очистки по белку 8 раз. Таким образом, сохранение активности по ИА лежит в интервале 7,26 ± 0,084, а для степени сохранения активности, т.е. процента 100 ± 1,1%.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОЙ БИОМАССЫ ВИРУСА ГРИППА, заключающийся в сорбции белков аллантоисной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода биомассы целевого продукта, сорбцию осуществляют путем погружения в вируссодержащую жидкость 4 - 6 порций поливинилспиртового волокна, содержащего 2 - 3 мас.% никеля при соотношении объем жидкости: сорбент 50 - 60 : 1 и времени контакта каждой порции в течение 2 - 5 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2