Способ определения лецитиназной активности холерных вибрионов

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам определения способности холерных вибрионов к деструкции лецитина куриного желтка с использованием этого эффекта для идентификации возбудителя и для оценки его патогенных свойств. Цель изобретения - ускорение способа определения лецитиназной активности холерных вибрионов и повышение его чувствительности. Способ заключается в подготовке агаровой среды с добавлением лецитинового субстрата, внесении исследуемого материала в виде центрифугата, фильтрата или суточной культуры холерного вибриона в лунки диаметром 5- 10 мм в объеме 0,1 мл, инкубировании и .визуальном определении лецитиназной активности по зонам расщепления лецитина ферментом. Причем в качестве лецитинового субстрата используют предварительно очищенный фильтрацией и подвергнутый замораживанию - оттаиванию лецитовителлин в соотношении 1:25-1:30 к объему среды . Способ позволяет получить четкие результаты определения лецитиназной активности уже через 24 ч. 6 табл. (Л С

союз советских социАлистических

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 0 1/04, 1/70

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

/ б <

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4717286/13 (22) 05.06.89 (46) 30.06.92. Бюл. М 24 (71) Научно-исследовательский п ротивочумный институт Кавказа и Закавказья (72) С.Н,Дегтярева, Г.M,Грежебовский и Ф.С.Флуер . (53) 576.8 (088.8) (56) Мас Farlane М.G., Knight В.С., The

biochemistry of bacterial toxins. The

Lecitinase activity of Cl. Nlelchil toxins.

В!оспее,3..1941, ч.35, р.884 — 896, Домйрадский Н.В. и др. Микробиология и лабораторная диагностика холеры. Ростов н/Д, 1975, с,124. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЦИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам определения способности холерных вибрионов к деструкции лецитина куриного желтка

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам определения способности холерных вибрионов к деструкции лецитина куриного желтка с использованием этого эффекта для идентификации возбудителя и для оценки его патогенных свойств.

Цель изобретения — ускорение способа и повышение его чувствительности.

Способ заключается в подготовке агарной среды с добавлением лецитинового субстрата, исследуемого материала, в виде центрифугата, фильтрата или суточной культуры холерного вибриона в лунки диаметром 5-10 мм в объеме 0,1 мл,инкубировании.

;, ЫЛ„, 1744113 А1 с использованием этого эффекта для идентификации возбудителя и для оценки его патогенных свойств. Цель изобретения — ускорение способа определения лецитиназной активности холерных вибрионов и повышение его чувствительности. Способ заключается в подготовке агаровой среды с добавлением лецитинового субстрата, внесении исследуемого материала в виде центрифугата, фильтрата или суточной культуры холерного вибриона в лунки диаметром 510 мм в объеме 0,1. мл, инкубировании и визуальном определении лецитиназной активности по зонам расщепления лецитина ферментом. Причем в качестве лецитинового субстрата используют предварительно очищенный фильтрацией и подвергнутый замораживанию — оттаиванию.лецитовителлин в соотношении 1:25-1:30 к объему среды. Способ позволяет получить четкие результаты определения лецитиназной активности уже через 24 ч. 6 табл. и визуальном определении лецитиназной активности по зонам расщепления лецитина ферментом, Причем в качестве лецитинового субстрата используют предварительно очищенный фильтрацией и подвергнутый замораживанию-оттаиванию лецитовителлин в соотношении 1:25-1:30 к объему среДЫ.

Способ позволяет получить четкие результаты определения лецитиназной активности уже через 24 ч за счет использования в качестве субстрата лецитовителлина вместо эмульсии куриного желтка, Из табл. 1 видно, что использование в качестве субстрата лецитовителлина и пое

1744113 сев в лунки существенно повышают чувствительность метода определения лецитиназной активности у штаммов холерного вибриона.

Одновременно значительно сокращается время учета результата определения ферментной активности.

Способ осуществляют следующим образом, Для получения лецитовителлина два свежих куриных желтка растирают в небольшом количестве физиологического раствора (5 — 10 мл). К эмульсии прибавляют

315 мг уксуснокислого кальция и 20 r каолина при постоянном помешивании. Затем добавляют 500 мл физраствора и в течение 1 ч смесь эмульгируют с использованием магнитной мешалки. Эмульсию центрифугируют при 2 С в течение 30 — 40 мин при

6000 об/мин, Надосадочную жидкость стерилизуют через фильтры Зейтца, Владипор или Миллипор (с диаметром пор 0,45 p) и разливают порциями по 10-50 мл во флаконы или колбы, которые хранят при температуре (-4)-(-20) С, По мере необходимости субстрат. размораживают и используют для определения лецитиназной активности микроорганизмов, Для получения ферментсодержащего препарата в пробиоку с 5 мл 1 (, пептонной воды засевают10 м,к./мл приготовленной на физиологическом растворе взвеси испытуемого штамма и инкубируют в термостате при 37 С в течение 18-24 ч. Выросшую культуру центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при температуре 0-2 С или . же фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,45,и. В качестве ферментсодержащего препарата может использоваться как взвесь 24-часовой культуры холерного вибриона s 1 пептонной воде, так и фильтрат или центрифугат этой культуры.

Питательный агар для культивирования холерного вибриона, рН 7,8 (мясопептонный, Дифко, Мартена, Хоттингера) плавят в колбе на кипящей водяной бане, охлаждают до 45ОС и вносят на 100 мл агара 3 — 4 мл лецитовителлина. После этого агар тщательно перемешивают встряхиванием и разливают в стерильные чашки Петри по 25 мл.

Розлив необходимо проводить. на строго горизонтальной поверхности, чтобы толщина агарового слоя, содержащего субстрат, была равномерной по всей поверхности чашки. После полного застывания агаровых пластин металлическим пробойником делают лунки диаметром 0,5-1,0 см. на дно которых закапывают по 1-2 капли расплавленного агара. На одной чашке можно рас55

50 положить 6-8 лунок. В лунки агаровых пластин вносят по 0,1 мл ферментного препарата изучаемых штаммов в виде культуральной жидкости, центрифугата или фильтрата. Чашки помещают в термастат при 37 С на 24 ч, Просмотр чашек проводят в проходящем свете, Вокруг лунок в случае положительного результата появляются ореолы, имеющие в зависимости от использованного питательного агара вид двух-или трехконтурного кольца, На агаре Дифко, в частности, просматривается внутренняя прозрачная зона, которая образуется возможно за счет действия протеолитических ферментов, На других агарах такая зона, как правило, отсутствует, О специфической активности лецитиназы свидетельствует образование вокруг лунки матового кольца с металлическим блеском эа счет образования свободного фосфора. окруженное снаружи зоной просветления, образованной в результате растворения продуктов липолиза лецитина, входящего в состав лецитовителлина. Ширину зоны активности фермента можно измерять при помощи миллиметровой линейки от края лунки

Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Готовят с лецитовителлином две чашки питательного агара Дифко, мясопептонного, Хоттингера и Мартена. Соотношение лецитовителлина и агара 1;25, В одной из пластин каждого из агаров делают пробойником по 6 лунок диаметром 5 мм. в другой — диаметром 10 мм. Далее в каждую из лунок вносят по 0,1 мл суточной культуры в 1 g> пептонной воде одного из 6 испытуемых штаммов, Инкубирование проводят при

37 С в течение 1 сут, после чего учитывают результаты по наличию и размерам зон расщепления субстрата ферментом лецитиназой.

В табл. 2 представлены данные о ферментативной активности изученных штаммов при использовании различных питательных агаров.

Как видно из табл. 2, все шесть испытуемых штчммов обладали лецитиназной активностью. При этом ширина зон активности фермента имела значительные колебания в зависимости от использованной питательной среды и от диаметра лунок.

Пример 2. B 3 чашки Петри с агаром

Дифко и с лецитовителлином делают по шесть лунок диаметром 5 мм. В лунке одной из агаровых пластин вносят по 0,1 мл культуральной жидкости каждого из шести испытуемых штаммов, в лунки другой пластины — по 0,1 мл фильтрата тех же куль1744113 тур, в лунки третьей пластины — по 0,1 мл центрифугата.

В табл. 3 представлены сравнительные данные о ферментативной активности изу- ченных штаммов в зависимости от характе- 5 ра используемого ферментного препарата.

Как следует из табл. 3, величина. зоны ферментативной активности не обнаружила значительных колебаний в зависимости от того, использовалась ли s качестве фермен- 10 тного препарата суточная культура микро. организма в жидкой питательной среде или же центрифугат, или же фильтрат этой культуры, Пример 3. Готовят 10 чашек Петри с разными соотношениями лецитовителлина 15 и агара Дифко. В каждой из чашек в агаровой пластине делают пробойником по 2 лунки диаметром 10 мм и в каждую из лунок вносят по 0,1 мл суточной культуры в 1ф> пептонной воде послеинкубирования испы- 20 туемых штаммов холерного вибриона.

В табл. 4 представлены данные о ферментативной активности изученных штаммов при различных соотношениях лецитовителлина и агара Дифко. 25

Представленные в табл. 4 данные свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением лецитовителлина и .агара является 1;25 или 1:30, Пример 4.Два свежих куриных . 30 желтка растирают в небольшом количестве физиологического раствора (5-10 мл). К эмульсии прибавляют 315 мг уксуснокислого кальция и 20 r каолина при постоянном помешивании, Затем добавляют 500 мл 35 физраствора и в течение 1 ч смесь змульгируют с использованием магнитной мешалки. Полученный препарат центрифугируют при 2 С в течение 30-40 мин при.

6000 об/мин. Часть надосадочной жидко- 40 сти фильтруют через фильтр Владипор (диаметр пор 0,45,и). Лецитовителлин в. виде центрифугата и фильтрата разливают по 1050 мл во флаконы и колбы и помещают в холодильную камеру при температуре 2; -4; 45

-10 -15. -20 С. Качество субстрата контролируют ежедневно в течение первых 10 дн, хранения при разных температурах, а в по.следующем ежемесячно в течение 6 мес.

В качестве ферментного препарата ис- 50 пользуют центрифугат холерного вибриона биовара эльтор 2099.

При использовании лецитовителлина. хранящегося в холодильной камере при

2ОС, ореолы, свидетельствующие о наличии 55 лецитиназной активности, появляются в течение 3 дк при использовании в качестве субстрата центрифугата и 8 дн.— фильтрата.

По истечении этих сроков центрифугат и фильтрат лецитовителлина становятся мутными. При высеве из них появляется по стоянная микрофлора, а зоны вокруг лунок не появляются,.что свидетельствует о разру-. шении субстрата. Хранение полученного субстрата при комнатной температуре приводит к резкому изменению его свойств уже в первые сутки {1-4 дн).

Хранение лецитовителлина как в виде центрифугата, так и фильтрата в замороженном состоянии позволяет получить четкие ореолы в виде 2- и 3- контурного кольца в течение 2-6 мес, Результаты определения лецитиназной активности штамма холерного вибриона N.

2099 в зависимости от температуры и срока хранения лецитовителлина приведены в таблице 5.

Пример 5. Готовят две группы чашек

Петри по 9 чашек в каждой с агаром Дифко, В качестве субстрата используют лецитовителлин разного срока хранения при температуре -4 {-20) С. В качестве ферментного препарата используют культуральную жидкость двух штаммов холерного вибриона, вносимую в количестве 0.1 мл в лунки диаметром 10 мм.

В табл. 6 представлена зависимость величины ферментативной активности изучаемых., штаммов от срока хранения лецитовителлина.

Как следует из табл. 6, максимальные показатели ферментативной активности регистрируют при использовании в качестве субстрата лецитовителлина, который хранят в замороженном состоянии не более 6 мес:

Таким образом, способ позволяет сократить время определения лецитиназной активности холерных вибрионов и повысить чувствительность метода..

Формула изобретения

Способ определения лецитиназной активности холерных вибрионов, предусматривающий внесение исследуемого материала в плотную питательную среду. содержащую лецитиновый субстрат, инкубирование,и определение лецитиназной активности по образованию зон просветления, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения его чувствительности. в качестве лецитинового субстрата используют предварительно очищенный фильтрацией и подвергнутый замораживанию-оттаиванию лецитовителлин, взятый в соотношении 1:25-1:30 к обьему среды, а исследуемый материал вносят в лунки в агаровой среде диаметром 5-10 мм в виде центрифугата, или фильтрата, или суточной культуры холерного вибриона в объеме 0,1 мл.

1744113

Таблица l

»»

Количество изученных штаммов холерного вибриона

Количество штаммов, у которых выявлена лецитиназная активность в зависимости от. аида субстрата

« » » ««»«««»»«»«

Эмульсия куриного желтка

»

Посев в лунки Посев штрихом Посев в лунки

Посев штрихом

«« ° «

Учет через 24:ч инкубации

140 l57 180

193

200

Учет через 48. ч инкубации

1.47 159

180

193

200

Учет через 72 ч инкубации

152 !61

200

l93

180

Учет через 96 ч инкубации

193

160

180

154

200

Учет через 120 ч инкубации

154 160

180, 193

200

«ь Ф

»

Таблица2

Ширина зон расщепления субстрата ферментом на питательных

arapax, мм

Испытуемые штаммы микроорга низмов

» «»««

»» «

Дифко Мясопептонный Хоттиигера

Мартена

» !

«

5 мм 10 мм 5 мм т 10 мм . 5 мм 10 мм

5 мм 10 мм

5 6 7 7 8

12 10 11 9 10

20 19 . 22 18 22

4 4 5 6 4

6 4 6 5 5

14 14 16 13 15 не обладающий лецитиназной.активностью

7 9 8

9 11 11

20 19 18

4 4 5

6 5 5

15 !5 12

Контрольный штамм, »» «««»»

«» «

Таблииа 3

««3«

««««««»«««»»»»

Испытуемые штаммы микроорга« ниэмов

Ширина зоны ферментной ак" тиености, мм

Фильтрат (Цен фуг

Культураль" триная жидкость ат

»

V.cholerae el. 174

V.cholerae eltor 2099

Ч.chvl "е лов OI 1196

Аегошопяв вр. 470

Plesiomonas врр 622D

Pseudomonas 2783АТСС

Иезидomones 19482.

V.cholerae cl. 174

V.cholerae eltor 2099.

V.cholerae non OI 1!96

Aегоmonas spp ° 470

Plesiomonas врр 622Д

Pseudmuonas 2783ATCC

Plesiomonas 19482

6

7

12

18

5

7

12

5

1744113

Таблица4 Характеристика зоны, активности фермента.

1

«

2,4

3,2

3

3,3

4,0

8,0

Таблица5 с

Температура хранения, С

Срок хранения субстрата

-20

-15

- l0

"1 I

J ц ф ц ф

+

+/+/+

+/.

+

+/+/+

+

+ .+

I»

П р и м е ч а н и е. ц - центрифугат; ф - фильтрат; (+) - четкий результат в виде 2-х, 3"х контурного кольца; (+/") " сомнительный результат. (ореолы расплывчатые); (-) — отрицательный результат (полное отсутствие ореолов) .

Количество Ширина зоны активности субстрата фермента, в мм в мл на 100мл агара V.cholerae « Ч.cholerae ,cl. 174 elisor 2099

1 сут

2 сут

3 сут

4сут .

5 сут

6 сут .7 сут

8 сут

9 сут

10 сут

11 сут

12 сут

1 мес

2 мес

3 мес

4 мес

5 мес

6 мес

Зона активности фермента просматривается четко,. контуры колец не четкие

То же

Очень четко просматрива" ется зона активности фермента в виде трехконтурного кольца

Очень четко просматривается зона активности фермента в виде трехконтурного кольца"

То же

Контуры зоны активности фермента размыты, мутны

1744113

Таблицаб

Срок хранения ле" цитови» теллина

У

8

У

Составитель И.Чаплина

Редактор M.Íåäîëóæåíêî Техред М.Моргентал Корректор М.Пожо

Заказ 2169 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Использованный экс темпоре

2 нед

1 мес

2 мес.

3 мес, 4 мес.

6 мес., 8 мес, Величина зоны активности фермента для штаммов микроорганизмов

° Ф ВВ

Ч.cholerae cl. 174 Ч.cholerae eltor 2099

11

12

11

1.0