Рекомбинантная плазмидная днк pst20, кодирующая альфа- интерферон человека в растениях табака

 

Использование: при биотехнологическом производств интерферона. Сущность изобретения: клонирование гена рекомбинантного альфа-интерферона человека в экспрессионном векторе под контролем конститутивного промотора 35S и вируса мозаики цветной капусты, передача рекомбинантной плазмиды в клетки Agrobacterium tumefaciens, несущие разоруженную Ti-плазмиду, интеграция обеих плазмид, трансформация методом листовых дисков растений табака и регенерация полноценных трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантный альфа-интерферон человека

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4817194/13 (22) 20.04.90 (46) 30.07.92. Бюл. ¹ 28 (71) Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова (72) С. П. Смирнов, Э. Х. Теверовская, Л. В. Крашенникова и В. А, Пухальский (53) 575.224.2; 577.2/048(088,8) (56) "Virology", 1989, v. 172, р. 213 — 222, (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК pST20, КОДИРУ(ОЩАЯ АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОН ЧЕЛОВЕКА В РАСТЕНИЯХТАБАКА

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано при биотехнологическом производстве интерферона, Известны методы получения продуцирующих интерферон клеток человека, бактерИй, дрожжей.

Описан способ введения и временной экспрессии гена интерферона человека s растениях турнепса в составе вируса мозаики цветной капусты. Однако этот способ не обеспечивает встраивания и стабильного поддержания гена интерферона в геноме растения, что обусловлено использованием в качестве векТора вируса, Стабильное встраивание и экспрессию гена интерферона можно осуществить лишь путем генетической трансформации растений, как было показано для ряда других генов.

Целью изобретения является создание плазмиды, кодирующей альфа-интерферон человека в трансгенных растениях.

Преимущества трансгенных растений перед другими организмами — продуцента„„94J „.„1751 207 А1 (si)s С 12 N l5/21, 15/84 (57) Использование: при биотехнологическом производсте интерферона, Сущность изобретения; клонирование гена рекомбинантного альфа-интерферона человека в экспрессионном векторе под контролем конститутивного промотора 35S и вируса мозаики цветной капусты, передача рекомбинантной плазмиды в клетки

Agrobacterium tumefaciens, несущие разоруженную Ti-плазмиду, интеграция обеих плаэмид, трансформация методом листовых дисков растений табака и регенерация полноценных трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантный альфа-интерферон человека, М ми интерферона — заключаются в отсутст- ( вии необходимости использования для получения больших количеств биомассы растения продуцента дорогостоящих специального оборудования и помещений и ростовых сред, стерильных условий выра- а щивания, высококвалифицированного персонала, (Я

Изобретение включает клонирование гена рекомбинантного альфа-интерферона человека в зкспрессионный вектор pST6 под контроль сильного конститутивного промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, передачу полученной рекомбинантной плазмиды pST20 в штамм Agrobacterium

tumefaciens С158, несущий "разоруженную"

Ti-плазмиду pGV2260, с последующей интеграцией плазмид pST20 и р61/2260, генетическую трансформацию методом листовых дисков растений Nicotiana

tabacum сорта Самсун полу генным штаммом агробактерий и регенерацию на селективной среде полноценных трансгенных

1751207

25

30 растений, продуцирующих рекомбинант. ный альфа-интерферон человека.

Пример. Клетки штаммов Е. coll K12, содержащие плазмиды plNF, pUC19 и pllnk (pBR322 со встроенным между сайтами 5

Есор! и Hind lll полилинкером из р1.!С19) выращивают на полноценной питательной . среде c àéòèáèoòèêàìè 12 ч йри 37 С. и выделяют иэ них плазмидную-ДНК щелочным способом, которую затем очищают гель- 10 фильтрацией на:мини-колонке с сефарозой

2В. 5 мкг ДНК плазь1йды plNF расщепляют рестриктазами EcoR I (25 ед.) и Pstl.(25 ед.) 1 ч при 37ОС. 2 мкг ДНК плазмиды р0С19 расщепляют рестриктазами pst 1 (10 ед.) и 15

HIndlll (10 ед,) 1, ч при 37 С. 5 мк г ДНК. плазмиды plink расщепляют рестрйктазами

EcoRI (25 ед,), Hlndlll (25 ед,) и Pvull (25 ед,):

1 ч при 37 С, затем гель-фильтрацией на миниколонке с сефарозои 2В отделяют малый EcoRI-Н1пбП1фрагмент(пблйлйййер иэ

p U C19) от остал ьн ых фрагментов плазм иди.

Соединяют вместе пробы, содержащие малый EcoRI--Hindi!1 фрагмент ДНК плазмиды р!!п1с и расщеплейую EcoRI é Pstl ДНК плазмиды plNF, и добавлявт к ним 0,1 мкг ДНК плазмиды. р0С19; расщепленную Psti u

-Н1пс!!11, депротейнизируют смесь хлорофор.мом"и осаждают этанолом 12 ч при -20 С.

Осадок растворяют в 10 мкл TE-буфера (10 мМ трис-HCI pH 7,5, 1 MM ЭДТА), отбйрают . .

1/5 часть. и проводят лигирование с 2,5 ед.

ДНК-лигазы Т4 в 50 мкл лигазного буфера

12 ч при 4 С.

Яигйраванной ДНК трансформируют 35 компетентные клетки Е, со!1TGI и высевают на-селективную среду ЭНДО, позволяющую . no окраске колонйй определить наличие вставки ДЙК в плазмиду рОС19; а также . . содержащую ампициллин (100 мг/n). Вырос- 40 . шие через .48 ч при 37 С белЫе колонии, . доля которых составляет приблизительно

307 от общего числа ампициллинустойчивых трансформантов, очищают на той же . среде. до отдельных колоний и из несколь- 45 ких к л ойов. вь1л,ел яют плазмидную ДНК, ко торуа пере6арйвают затем рестриктазами

EcoRI, ВатН1, Pstl u Hindlll. После анализа . рестрицирован ной ДНК в агарозном геле отбирают варианты, у которых ген inf ока- 50 зался встроенным между двумя, сайтами

BarnHI.

На следующем этапе из выделенного . клона бактерий, а также из клеток Е. coli TG I, содержащих экспрессионный вектор pST6, 55 препаративно выделяют плазмидную ДНК, как указано. 5 мкг ДНК плазмиды pUC19 со встроенным геном интерферона и 2 мкг

ДНК плаэмиды pST6 расщепляют рестриктаэой BamHi (50 ед.), смешивают,всю ДНК

4 плазмиды р!.1Г19:inf с 0,2 мкг ДНК плазмиды pST6, хлороформируют и осаждают этанолом и растворяют осадок в 10 мкл

TE-буфера, 1./5 часть полученной, смеси

ДНК лигируют в 10 мкл лигазного буфера с

2,5 ед. ДНК-лигазы Т4 18 ч при 4 С. Лигированной ДНК трансформируют компетентные клетки Е, coll TGI и проводят селекцию трансформантов на питательной среде с 100 мкг/мл ампициллина. Выросшие при 37 С в течение 16 ч клоны очищают на той же среде и выделяют из них плазмидную ДНК, которую переваривают рестриктазами EcoRI, PvuIl; В9!1Ги BamHI и отбирают клоны, в которых ген интерферона встроился в век- .. то р р3Т6 в нужной о риентации, На следующем этапе осуществляют передачу полученной рекомбинантной плазмиды pST20 из клеток Е, со!1 в клетки агробактерий. С этой целью в питательном бульойе с а эр аци ей выра щив ают бактерии

А, tumefaciens С158 rifR (pGV2260), F. соИ

TG1 (pRK2013) и L., coll (pST20) до достижения плотности клеточной суспензии

10 кл/мл, Смешивают по 0,1 мл суспензии

8 клетОк всех. трех штаммов и наносят на нитроцеллюлозный фильтр, который помещают на полн оце нн ую пи тательную среду на 18 ч при ЗООС, Ба ктер ии сйывают с фильтра и, высевают на селектйвную среду. содержащую ампициллин (100 мкг/мл), рифампицин (100 мкг/мл),.спектиномицин (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), Выросшие через 3 сут колоний на селективной среде при

30 С очищают на той же среде до отдельных колоний и выделяют из клеточной биомассы тотальную ДНК, 10 мкг ДНК переваривают с 20 ед. рестриктазы BamHI 1 ч при 37 С, . фракциоййруют путем электрофореза в

0,7 Я, агарозном геле и переносят на нитроцелл|олозный.фйльтр по методу Саузерна.

Проводят гйбридизацию- иммобилизованной на фильтре ДНК с P-меченной ДНК .

32 плазмиды pST20, отмывают фильтр от несвязавшейся метки и экспонируют фильтр сутки с рентгеновской пленкой. На радиоавтографе ДНК из исходного штамма агробактерий дает одну зону гибридизации с pST20, соответствующую области гена ампициллинустойчивости на плазмиде pGVC2260, а

ДНК из клонов трансконьюгантов дает 3 зоны гибридизации, что доказывает интеграцию плазмид рЯТ20 и pGV2260 в клетках агробактерий;

Полученные штаммы агробактерий, не сущие интегрированные плазмиды pST20 и

pGV2260, используют для инфицирования листовых дисков табака, Бактерии выращивают на минимальной среда А при 30 С и суспандируют в среде RMNO до плотности мин раствором В (10 мМ1чаН Р04 NazHPOn:

1751207

10 кл/мл. Кусочки листьев стерильных растений табака N. tabacum сорта Самсун в возрасте 3 — 4 нед. погружают в суспензию

0,15 M NaCI; 0,37 Твин-20; рН 7.2), На поверхность фильтра наносят 5 мкл раствора, бактерий на 2 — 3 мин, промокают стерильсодержащего моноклональные антитела расигии Скуга+1,5мкг/мл БАП+1мкг/мл антител itðîòèð IgG мыши;"Инкубируют 30

10 мин при-20 С и промывают антитела на витамина Bt + 0,8 мкг/мл витамина Вв +

250 мкг/мл клафорана+ 50 мкгlмл канами- фильтре 4 раза йо 5 ми@ раствор6м В. Свяцина)иинкубируютвсветокамересфотопе- . заевшиеся антйгела визуалиэируют, освериодом 16/8 ч 3 нед, Образовавшиеся =: щая фильтр длиннбаблновым УФ-светом. В побеги пересаживают на средудля ук6рене- качестве стандарта используют 500 ед, лейния, которая отличается от среды для орга- 15 кацитарного интерферона человека. О проногенеэа заменой БАП на 1 мкг/мл ИУК, и дукции трансгенными растениями белка инкубируют еще 3 нед для ускорения побегов. интерферона свидетельствует появление яркого флюоресцентного свечения препаОбразовавшиеся на селективной среде ратов на фильтрах

Среда RMNO: 1x макросоли,.1х микросоли, 1 мг/л Fe-хелат, 440 мг/л CaCIz, 100 мг/л-мезоинозит, 1 мг/л витамин В1, 20 с канамицином растения проверяют на наличие ДНК гена интерферона и его экспрессию, Присутствие ДНК гена интерферона в растениях определяется методом дот-гиб- 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,04 мг/л кинетин, 3 мг/л ридиэации,.30,мкг тотальной ДНК, выделен- ИУК, 3% сахароза, 8 г/л агар, Среда А: 10,5 г/л К2НР04, 4,5 г/л

25 ной иэ растений-регенерантов, денатируют

КНгРОл, 1 г/л (NH4)zSOn, 0,5 г/л цитрат натрия — 2Н20. Питательная среда для бактерий: 10 г/л триптон, 5 г/л дрож. экстракт, 10 r/ë NaCI. и наносят на нитроцеллюлозный фильтр, после чего проводят гибридизацию иммобилизованной на фильтре ДНК с P-меченной

ДНК гена интерферона (малый BamHI ôpàãмент плаэмиды pST20), Растения, дающие 30 гибридиэационный сигнал, содержат ДНК

Агариэованная питательная среда: мясопептонный агар (MILA) производства ИЗМ им. Н. Ф. Гамалеи, Ф.о р м у л а и э о б р е т е н и я

Рекомбйнантная плазмидная ДНК

pST20, кодирующая альфа-интерферон че-, гена интерферана человека.

Для установления транскрипции гена интерферона в трансгенных растениях выделяют тотальную РНК из листьев, фракци- 35 онируют ее путем злектрофореза в 1,2% ловека в растениях табака, размером 7,7 агарозном геле при денатурирующих услот.п.о„содержащая виях с формальдегидом. переносят на нитооцеллюлозный фильтр и гибридизуют с — BamHI — BamHI фрагмент ДНК плаззг

Р-меченной ДНК гена интерферона. В ка- 40. миды PINF размером 0,9 т;п,о, геном альфачестве стандарта используют 0,1 нг ДНК интерферона человека; малого BamHI фрагмента плазмиды pST20, — BamHI — BamHI фрагмент ДНК вектоа также 18S и 25S рибосомальную РНК, Вы- .ра pST6 размером 6,8 т.п,о.; вод о транскрипции гена интерферона в — сайты рестрикции; трансгенных растениях делают-на основа- 45 два сайта ЕСОВ1„один из которых раснии появления зоны гибридизации, соответ- . положен на расстоянии 2,6 т.п,о. от первого ствующей молекулам РНК с размером 0,95 ECORI сайта; т.о. — три Pvull сайта, расположенных на

Белковый продукт гена интерферона в . расстоянии 0,05, 1,45 и 2,95 т,п,о. от первого

ECORl сайта; — два Hindlll сайта, расположенных на трансгенных растениях определяют имму- 50 нологически, используя моноклональные расстоянии 2,15 и 3,75 т.п,о, от первого

ECORI сайта; — два BamHI сайта, расположенных на расстоянии 2,6 и 3,5 т,п.о. 6т первого ECORI антитела против лейкоцитарного интерферона человека, Кусочки листьев массой

100 мг растирают в ступке и экстрагируют буфером (25 м М трис-H CI, рН 8,35; 195 MM 55 глицин), Обломки клеток осаждают центрисайта фугированием, супернатанту добавляют — один 8mal сайт, расположенный на зтанол до конечной концентрации 207 и расстоянии 3,75т.п,о, от первого ЕСОЙ1сайфильтруют раствор через нитроцеллюлозный фильтр, Фильтр промывают 4 раза по 5 та, — регуляторные участки: ной фильтровальной бумагой и помещают .5 против лейкоцитарного интерферона челона среду RMNO, где инкубируют 2 сут в века и инкубируют 12 ч при 4 С. Фильтр темноте при 25 С, после чего переносят на промывают 4 pàçà по 5 мйн в растворе В и среду для органогенеза (солевая среда Му- наносят на него 5 мкл раствора меченных

1751207

Составитель С,Смирнов

Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь

Редактор Н.Швыдкая — J ..

Заказ 2665 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 — промотор P35S - промотор вируса мозаики цветной капусты;, — промотор PNOS — промотор гена нопалинсинтазы из Tl"ïëàçìèäû;, — область 3 NOS — терминатор транс1 крипции и сигнал полиаденилирования и

РНК из 3 области гена нопалинсинтазы TiI плазмиды; — область 3 OCS — терминатор транскрипции и сигнал полиаденилирования и

РНК из 3 области гена октопинсинтазы Tiплазмиды; — области RR u LR — правый и левый сигнальные повторы размером 25 п.о.. фланкирующие Т-ДНК; — генетические маркеры:

5 — ген пр t П вЂ” ген устойчивости к канамицину в растениях; — ген СЬя — ген устойчивости к ампициллину в бактеоиях; — ген Se — ген устойчивости к стрепто10 мицину в бактериях; — ген Sp — ген устойчивости к спектиномицину в бактериях.