Способ определения бензилатов в растворе
Использование: способ может быть реализован в медицине, фармакологии и аналитической химии. Сущность изобретения заключается в определении скорости гидролиза 5- 2-Ю4 М раствора индофенилацетата быстрой карбоксилзстеразой из печени северного оленя при рН 8,0-8,5, взятой в концентрации 5 Е/мл в присутствии и ° в отсутствие исследуемого раствора, регистрируют скорость гидролиза в первой и второй пробах, рассчитывают отношение этих показателей и концентрацию бензилата в растворе находят по калибровочному графику . Предел обнаружения бензилатов моль/л. Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. 1 ил.
союз соВетских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (st)s 6 01 К 33/48
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4834274/14 (22) 01.06,90 (46) 07.08,92. Бюл. ¹ 29 (71) Научно-производственное объединение
"Биолар", Латвийский университет (72) Д.Ю,Балцере, Б,А.Гринберг, Е.Б,Никольская, З.А.Ефимцева и В,М,Кострова (56) Барт Т.Я, и др, Ионный обмен и ионометрия, Л.: Ленинградский университет 1986, вып, 5, с, 106-109.
Kramer D.N, et al, Analy 1958, V 30, № 2, р. 251-254, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕНЗИЛАТОВ В РАСТВОРЕ (57) Использование . способ может быть реализован в медицине, фармакологии и ана1 Изобретение относится к медицине, в частности к ферментным методам анализа и к фотоколориметрическому определению бензилатов в растворе. Специфичностью по отношению к бензилат-иону обладает бензилатный ионселективный электрод. Электрод имеет линейную электродную функцию в пределах концентрации бензилата 10 — 10 моль/л. -1 -4 Способ определения бензилата ионселективным электродом выбран в качестве прототипа (1). Метод достаточно простой, заключает- ся в измерении потенциала электрода в присутствии исследуемого бензилата при рН 6-10 с последующим нахождением концент- . рации по градуировочному графику. Известный метод имеет следующие недостатки: недостаточно высокая избирательность-электрод обладает чувствительностью к ионам других оксикислот „„ Ы„„1753416 А1 литической химии. Сущность изобретения заключается в определении скорости гидролиза 5.10 -2 10 4 M раствора индофенилацетата "быстрой" карбоксилэстеразой из печени северного оленя при рН 8,0-8,5, взятой в концентрации 5 Е/мл в присутствии и " в отсутствие исследуемого раствора, регистрируют скорость гидролиза в первой и второй пробах, рассчитывают отношение этих показателей и концентрацию бензилата в растворе находят по калибровочному графику. Предел обнаружения бензилатов 2 10 моль/л. Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. 1 ил. (. (салициловой, молочной); низкий предел об-1 -4 ,» наружения 10 -10 моль/л; определению мешают О, КОэ, S04, НР04, Н2РО4 и др. Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности способа. 4 Поста on е н н ая цел ь достигается тем, (Д что исследуемый образец растворяют в (Д воде и определяют скорость гидролиэа ф „ 5 10 — 2 10 M раствора индофенилацета- д та (ИФА) "быстрой" карбоксилэстеразой из печени северного оленя при рН 8,0-8,5 в присутствии и в отсутствие исследуемого раствора и концентрацию бензилата в растворе находят по градуировочному графику. Таким образом, предел обнаружения повышается до 2 10 моль/л. Методявляется специфичным по отношению к бензилатам, Определению не мешают присутствие других ионов: Cl, МОз, S04 НРО4, НРО4. а также эфиров бензиловой кислоты или других производных бензиловой кислоты. Оказалось, что бензилвт-ион явллетсл сильным, специфическим ингибитором по отношению к ферме}}ту карбоксилэстеразе. Даже присутствие микооколичеств бензилата в растворе заметно снижает активнОсть карбоксилэстеразы, следОвательно и скорость ферментативного гидролиза индофенилацетэта -- субстрата карбоксилэстеразы этим ферментом, Снижение скорости ферментативной реакции зависит от присутствующего количества бензи""àòà, Соотношение скоростей ферментатив}юго гидролиза ИФА карбоксилэстеразой в присутствии и отсутствии бензилага 1ло>кно использовать для определения сод р>канил бе}}зилятя В растВОре. НЯ ГРЯфХК, П р и M е р 1, Определяют скорость гидропиза ИФА "быстрои" каобоксилэстеразой в воде (зна}ение V); (1р}лготаВливают реакцио 11}у10 сме} ь В общем обьеме 5 мл из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 5 I0 loilb/ë, 1,9 Mfl фосфат, -го буфера с р,-l 8,0, 2 мл Н О. ДобавJ1$iIoT 0.,1 I }л раствора "быстрой" карбоксилэстеразы с Ko! I! ICIITpaLil ей, 113пример 5 Е/мл, Проводят ферментативну!o реакц I!0 гидролиза соглас. 10 извест}}ой методике, Определ<1}от активно ть карбо}<силэстеразы по -13ряст31}ию опти -!Оской Г}лотности раство-а при 625 IIM за счет обрязовя}ил про. дук}а гидролиэа ИФА, ! 13ЙДЯН НУю:IKTI!BHDCTь IIBPGcчиты ВЯ ют на ед}1ницу Вр<э ло}}и (мин.) и ОтнОсят к 1 мГ белка, что являетсл cкорость}о ферментатиВНОЙ пезкЦии, 10лу 13}от зн<}ление ч = 1,1, Опредеплют скорость гидролиза ИФА быс} роА карбокс <пэcTepaaoÉ в 31}ЯЛ}лзируемом растворе, содержащем бензйлат } знaчоние v", ",, РИГОТЯВЛИВЯIОТ РЕЯКЦИОННУ!0 CMQCЬ и" . 1 мл pa TBopa Yi - - -< с кон ЦентрЯЦИОЙ 5.16. vcfiaf 1,9 мл фосфатного буфера с pI-I 8,0 и 2 :ил анализируемого расТВОра Оенэилата калия с концентрацией 1 10 мольу л ° Дооавллют 0,1 мл р3стВОра быстрой карбоксиля".,теразы с такой же Kol!ц3}-}тра цией как В рея кц!ëи Определения зн 3чения V, -.е, 5 F/мл, Определяатскорость гидролиза согласно методика, Находят значение vl ==. 0Я8. Получают соотношенис v/vl равное 1,25. По градуировочному графику находят содержание бг- нэи лата равно„ 1 10 MQльу л Пример 2. Определя}от скорость гидролиза ИФР "быстрой" карбоксилэстаразой Вво,д.е (значение u). Приготявлива}от реакционну}о смесь в 5 общем обьеме 5 1лл, состоящу}о из 1 мл расТоор<а ИФА с концентрацией 2 10 моль/л, -у} 1 9 мп фосфатного буфера с рН 8,5; 2 мл Н О и 0,1 мл раствора карбоксилзстеразы. Определя}от скорость гидролиза v равну}о 2,00, 10 О п редел гпот скорость гидролиза И ФА карбокс}ллэстеоазоЙ В анапизируемолл растворе, содержащем бензилат. Приготавливают реакционную смесь из 1 лл раствора ИФА с концентрацией l5 2 10 4 моль/л, l,9 мл фосфатного буфера с рН 8,5; 2 ил анализируемогÎ расТВор3 бензилата калия с ко}}центрацией 3,5 10 моль/л. ДООявля!От 0,1 мл раствОр3 карбоксипэсте разы, О пределя ют скорость 20 гидропиза ИФА, согласно методике. Няходлт значение ч} равное 0,47, Получают соотношение u/vi равное 4,25. По градуировочному графику находят содержание бензилята, рявнОе 25 35 10 мо - л l I р и м е р 3, Определлют скорость гидролиза ИФА ."быстрой" карбоксилзстеРЯЗО}Л В ВОДЕ. Приготавливают реaKционну}о с}лесь, 30 состолщу}о из 1 мл раствора ИФА с концентрациеlл 8 10 моль/л, 1,9 мл фос<1)ат}}ОГО буфcpa.ñ рН 8,312 мл Н>О и 0,1 мл расТпора . каp601<силэстеразы, Н<)ходят скОООсть ГидI10JiI I3a И ФА, ОЯ В1-}у}0 1,95. 351 О продел }}от cKopOcTb Гидроп из;1 И ФА карбоксилэстеразой в анализируемом раствор".„содержа}цем бензилат. Приготавлива}от реакционную смесь из 1 мл расТпора ИФА с концентрацией 40 8 10" моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,3, 2 мл Яь}ялизируамого раствора бензилата с конце}}трацпей 2,5 10 моль/л, Добаввяют 0,1 мл раствора карбоксиг}эстерязы, Определлют с}<орость гидролиза ИФА согласно методике, Находлт скорость гидролиза ч} =-0,62, Получа:от соотношение v/vi равное 3,15 и находят содер>ка}}ие бензила та, равное 2,5 10 моль, л, Пример 4, ПриГОтавливаlот реакци0}II}!JIO СМЕСЬ ДЛЛ ОП РЕДЕЛЕНИ»1 СКОРОСТИ ГИДролиза ИФА в воде: 1 мл раствора ИФА с концентрацией 4 10 моль/л, 1,9 мл фос-5 фатного буфера с рН 7,5; 2 мл Н О и 0.,1 мл раствора каобоксилэстеразы, Находят cKÎрость V гидролиза ИФА, равную 1,01, Определяют скорость гидролиза ИФА карбоксилэстеразы в 31}ализируемам растворе, содержащем бензилат. 1753416 Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 4 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 7,5; 2 мл анализируемого раствора бензилата с концентрацией 2,5 10 моль/л. Добавляют 5 -в 0,1 мл раствора каобоксилэстеразы. Опрецеляют скорость гидролиза ИФА согласно методике. Нахо,цят скорость гидролиза vi = 0,981. Получают соотношение ч/ч, равное 1,25, . 10 Соответствующее содержание бензилата равное 1.10 моль/л. Видимо, концентрация субстрата в данных условиях реакции не достаточная. Ферментативная реакция проходит медленно, что вносит ошибку в 15 определении содержания бензилата. Пример 5. Приготавливают реакционную cMBcb для определения cKopocTN Гидролиза ИФА в воде, 1 мл раствора ИФА с концентрацией 20 3 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8;7; 2 мл HzO и 0,1 мл раствора карбоксилэстеразьi, Находят скорость v гидролиза ИФА, равную 2,1. Определяют скорость гидролиза ИФА 25 карбоксилэстеразой в анализируемом растворе, содержащем бензилат, Приготавливают реакционную смесь из 1. мл раствора ИФА с концентрацией 3 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с 30 рН 8,7; 2 мл анализируемого раствора бен-, зилата.с концентрацией 2,5 10 8 моль/л. Добавляют 0,1 мл раствора карбоксилэстеразы. Определяют скорость vi гидролиза ИФА равную 0,6. Получают соотношение v/vt равное 3,5. Находят содержание бензилата в растворе равное 2,8 10 в моль/л. При данной концентрации субстрата и рНу8,5 ферментативная реакция проходит 40 спонтанно, что вносит ошибку в определении содержания бензилата. Для подтверждения специфичности метода по отношению к бензилатам, приводим дополнительный пример; П р и м. е р 6. Определяют скорость гицролиза ИФА "быстрой" карбоксилэстеразой в воде (значение v); Приготавливают реакционную смесь в общем обьеме 5 мл из 1 мл раствора ИФА с 50 концентрацией 5 10 моль/л, 1,9 мл фос- я фатного буфера с рН 8,0; 2 мл НгО. Добавляют 0,1 мл раствора "быстрой" карбоксилзстеразы с концентрацией, например, 5 Е!мл. Проводят ферментативную реакцию гидролизB.. Определяют активность карбоксилэстеразы по нарастанию оптической плотности раствора при 625 нм за счет образования продукта гидролиза ИФА, Найденную активность пересчитывают на единицу времени (мин.) и относят к 1 мг белка, что является скоростью ферментативной реакции, Получают значение ч =- 1,1, Опоеделяют скорость гидролиза ИФА быстрой карбоксилэстеразой в анализируемом растворе, содержащем бензилат {значение vl): Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 5 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,0 и 2 мл анализируемого раствора метилового эфира бензиловой кислоты с концентрацйей 1 ".0 моль/л, Добавля8 ют 0,1 мл раствора "быстрой" карбоксилэстеразы с такой же концентрацией как в реакции определения значения v, т.е. 5 Е/мл. Определяют скорость гидролиза согласно методике, Находят значение ч = 1,1. Получение одинаковых значений v u vt равных 1,1, означает что ингибирование фермента данным эфиром не произошло, Следовательно, существует высокая специфичность быстрой КЗС только к бензилату, хотя по химической структуре данное соединение аналогично бензилату. Пример 7, Определение неизвестного количества остаточного бензилата в промышленно выпускаемом препарате мета ци не. Анализ проводят аналогично примеру 2, Найденное значение v = 2,0, Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 2 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН43,5 и:2 мл водного раствора метацина, содержащего 0,1 мл препарата. Далее добавляют ИФА согласно методике. Найденное значение v = 0,47. Получают соотношение ч./чь равное 4,25. Найденное по калибровочной кривой содержание бензилата в растворе метацина равно 3,5 10 моль/л, Предлагаемый способ обеспечивает обнаружение 2 10 моль/л бензилатов, не вы вляемых классическими методами. Использование предложенного способа обеспечивает более точный контроль и оценку содержания бензилатов, в том числе в биологически активных соединениях. Формула изобретения Способ определения бензилатов в растворе путем их исследования с последую(4 . -.ь,/„ Составитель Д,Балцере . Техред M.Mîðãåíòàë Корректор G.Кравцова Редактор Н,Химчук Заказ 2766 TWp3>K Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 щим нахождением концентрации бензилата по калибровочному графику, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, проводят ферментативную реакцию гидролиза 5 10 . — 2 10 . M раствора индолфенилацетма карбоксилэстеразай из печени северного оленя, взятой в концентрации 5 Е/мл, рН 8,0-8,3, гидролиз ведут в присутствии и в отсутствие исследуемого раствора бензилата, регистрируют его скорость в первой и второй пробах, рассчи5 тывают соотношение полученных показателей с последующим нахождением концентрации бензилата по калибровочному графику.
