Способ идентификации патогенных энтеробактерий

 

Использованиемедицинская микробиология , бактериологическая диагностика энтеробактерий в реакции агглютинации Для повышения точности способа за счет устранения инагглютинабельности культур энтеробактерий и с целью упрощения способа идентификацию патогенных энтеробактерий проводят путем посева и культивирования энтеробактерий на питательной среде с последующим проведением реакции агглютинации . При этом культивированиеэнтеробактерий осуществляют в микроаэро ьых условиях с атмосферой, содержащей о. 5 до 10% углекислого газа 2 табл (Л С

. СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 Q 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ. ГКНТ СССР .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4885250/13 (22) 26.11.90 (46) 30.08.92. Бюл. ¹ 32 (71) Оренбургский государственный медицинский институт и Лаборатория персистейции микроорганизмов Института экологии и тенетики микроорганизмов Уральского отделения АН СССР (72) Н.В. Шеенков, Н.В, Усвяцов и В.А. Гриценко: . (56) Инструкция по микробиологической диагностике кишечных заболеваний вызванных шигеллами, сальмонеллами, ЭПКП, МЗ

СССР— М.: Медицина, 1967, с. 32, Энтеробактерии. Руководство для врачей/Под ред. В,И. Покровского, М.; Медицина, 1985, с. 321;

Некоторые рекомендации по устранению полиагглютинабельности патогенных . энтеробактерий, М3 СССР, респ. СЭС. 1986;

- . с, 7 — 8.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам иден:тификации патогенных энтеробактерий в реакции агглютинации с поливалентными и моноспецифическими иммунными сыворот- ками, и может быть использовано в бактериологической диагностике кишечных заболеваний и при эпидемиологических исследованиях.

Способ серологической идентификации .патогенных энтеробактерий в реакции агглютинации с иммунными сыворотками является одним из наиболее специфичных и позволяет дать серологическую характеристику выделенных штаммов, что особейно важно при дифференцировке культур со сходными биохимическими и иными свойст- . ЫЛ „, 1758075А1

2 (54) СПОСОБ ИДЕЙТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (57) Использование: медицинская микробиология, бактериологическая диагностика энтеробактерий в реакции агглютинацйи. Для повышения точности способа за счет устраненйя инагглютинабельности культур энтеробактерий и с целью упрощения способа идентификацию патогенных энтеробактерий проводят путем посева и культивирования энтеробактерий на питательной среде с последующим проведением реакции аггпютинации. При этом культивирование знтеробактерий осуществляют в микроаэробных условиях с атмосферой, содержащей от 5 до

10% углекислого газа. 2 табл. вами. Эти обстоятельства определяют его эпидемиологическую значимость. Вместе с тем, йри серодиагностике бактериальных культур воэникают трудности, связанные с наличием инагглютинабельных штаммов энтеробактерий, число которых увеличивается в период, предшествующий эпидемическим подъема м заболеваемости кишечными инфекциями.

В этой связи несомненную актуальность приобретает совершенствование существующих способов устранения иннаглютинабельности культур энтеробактеPNA.

Известные пути в данном напрввленйи включают в себя ряд предложенных методических приемов, суть которых состоит: в се1758075. лекционировании отдельных колоний, обла- сыворотками на стекле и (или) в пробирках дающих полным антигенным комйлексом в с живой и гретой бактериальной культурой. прогревании культур (для разрушения по- Отличие предлагаемого способа от иэ.верхностного антигена): в проведении мно- . вестных заключается в том, что культуры, гократных пассажей через желчный бульон; 5 предназначенные для реакции агглютинав примененйи кератоконъюнктивальной ции, выращивают на обычных питательных пробы на морских свинках. средах, но в микроаэробных условиях (наИх использование связано са значи- пример; в эксикаторе со свечой или в анаэтельными матерйальными затратами, а в ростате с искусственно компонуемым отдельных случаях нежелательно, так как 10 газовым составом: азот 78-79%, кислород ведет к увеличеййю продолжительности 11-16%, углекислый газ 5 — 10%), в результабактериологического обследования и удли- те чего значительно повышаются агглюти-. нению сроков"выдачи окончательного диаг- набельные характеристики микроорганизностического заключения.. ::. ;, ..: мов.

Существуют способы-аналоги, предус- 15 Установлено, что бактерии, выращенматривающие обработку инагглютинабель- ные в микроаэробных условиях, приобретаных штаммовпатогенныхэнтеробактерий(в ют способность агглютинироваться частности Escherlchle call) 50%-ййм этило- - моноспецифическими сыворотками в более вым спиртом в течение 20 ч при 37 С, 1 N HCI высоких титрах, достигающих диагностиче(20 ч при 37+1 С) для устранения 0-инагг- 20 ских значений. Результаты серотипировалютинабельности. связанной с К аihvredoM нйя эшерихий при разных способах их (фракции Z). - : культивирования представлены в табл. 1.

Однако данные способы не уСтраняют Как видно из табл. 1, оптимальными для

О-инагглютинабельности Е, cali; обуслов- вйявления специфических антигенов киленную фракцией А К-антигена. " -"::;25 шечной палочки являются такие условия

Наиболее близким к изобретению явля- культивирования, при которых газовый соется сйособ, включающий культивйрование став атмосферы включает углекислый газ от инагглютинабельных штаммов энтеробак- 5 до 10%, что может быть достигнуто истерий на плотной питательной среде Хот- пользованйем эксйкатора со свечой или тингера (1,5% агар-агара, 0,5% НаС!, 30 анаэростата с искусственно компонуемой содержание аминного азота l70 мг %, рН атмосферой (азот в концентрацйи 78-79%, 7,3) с дальнейшим их исследованием в реак-: кйслород 11-16%; углекислый газ 5 — 10%). ции агглютинации на стекле или в пробир- При культивировании кишечных палочек к ках с живой и гретой культурами. - -: анаэростате с атмосферой, содержащей меОднако изложенный спосо6 требует 35 нее 5% углекислого газа; отмечался менее приготовления определенных питательных выраженный эффект, так как меньшее чис сред, что делает его громоздким и неприем- ло инагглютинабельности штаммов приоблимым для массового применения в сети ретало способность агглютинироваться санитарно-эпидемиологической службы, а, моноспецифическими сыворотками. Искроме того, не позволяет повысить число 40 пользование же микроаэробных условий с серотипированных штаммов выше 50-70% созданием в атмосфере более высоких кон-. особенно при наличии О-инагглютинабель- центраций углекислого газа (больше 10%) ности, вызванной наличием К-антигена . не приводило к увеличению количества се(фракции А; В, Z). -: -: .,, ротипированйых штаммов. Кроме того, соЦель изобретения - повышение точно- 45 здание. подобных условий требует сти и упрощение-существующего способа использования термоанаэростатов и приидентификаций патогенных энтеробакте- боров для дозирования газовых смесей, рий в реакции агглютйнации с иммунными что неприемлемо в работе бактериологиче-: сыворотками за " счет устранеййя иййагглю- ских лабораторий СЭ С районного уровня в тинабельности бактериальных культур. 50 силу их слабой материальной обеспеченноПоставлейная цель дос гигается, что сти. инагглютинабельная культура бактерий вы- Рекомендованоограничитьсодержание ращивается при 37+1 С в микроаэробных . jãëåêèñëaãî газа в рамках 5-10%, что может условиях, которые могут быть созданы в быть достигнуто использованием анаэроанаэростате (или эксикаторе со свечой), с 55 стата или эксикатора со свечой — приборов, атмосферой, содержащей от 5 до 10% угле- доступных бактериологическим лаборатокйслоro газа; а затем производится постанов- риям любого уровня. ка реакции агглютинации с поливалент- С целью проверки эффективности заявными и моноспецйфическими иммунными ляемого способа было проведено сравнительное исследование по идентификации 47

1758075 микроорганизмы не типировались дизентерийным бактериофагом, а также не агглютинировались поливалентными и ным при идентификации патогенных моноспецифическими дизентерийными и энтеробактерий, поскольку позволило по10 эшерихиозными сыворотками. При пассаже через газовую среду эксикатора со свечой культура микроорганизмов приобрела сповысить число серотипированных штаммов в среднем на 25,6% (р < 0,01) в сравнении с использованием способа-прототипа. Так, известным способом было идентифицирособность типироваться поливалентными и моноспецифическими дизентерийными сы15 воротками и по серологическим свойствам была идентифицирована как шигелла Ныюкастл, Больная была госпитализирована в инфекционное отделение.Таким образом, применение данного

9225) 15 лет, была госпитализирована в ин25 лагаемого способа увеличилось как за счет фекционное отделение Александровской

ЦРБ Оренбургской области с диагнозом: острая дизентерия. При бактериологическом исследований кала была выделена дизентеровались с сомнительными результатами рийнэя палочка Штуцера-Шмитца (Sh

Применение предлагаемого способа позволило дать полную серологическую характе- бузеп1егЫе Il) с характерными биохимичеристику штаммов энтеробактерий.: скими и серологическими свойствами. При

Предлагаемый способ диагностики атиконтрольном посеве после проведенного лечения был выделен микроорганизм, по пичных культур патогенных энтеробактерий

35 биохимическим свойствам прийэдлежаосуществляется следующим образом щий бактериям рода Шигелла. СерологичеНа официальный простой питательный агар засевэется культура микроорганизмов, ски же выделенный микроорганизм атйпичная по своим серологическим свойст- типировался как кишечная палочка 0144:К .

С дизентерийными диагностическими вам. Культура помещается в эксикаторе с (поливалентной и моноспецифической) сы40 хорошо притертой крышкой. Для хорошей воротками микроорганизм не давал реакгерметизации края эксикатора и крышки ции агглютинации; Пассаж через питательную среду, описанную в способесмазываются вазелиновым маслом. 8 эксикатор помещается зажженная свеча.

Крышка эксикатора сдвигается так, чтобы прототипе, а также трехкратный пересев через желчный бульон оказались безревыходить нагреваемый воздух. 8 момент зультатными. При использовании способа инкубирования в эксикаторе быстро (через

24 ч инкубации) удалось устранить иннаггюугасания свечи крышка сдвигается для полной герметизации эксикатора. Через тинабельность шигелл. Больной был назна18-24 ч инкубации в термостате при

37+1 С, эксикатор открывается, выросшие чен повторный курс антибактериальной

50 терапии с учетом чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам. культуры микроорганизмов изучаются в ре- . акции агглютинации с иммунными сыворотПри двухкратном контрольном бактериологическом исследовании кала после провеками на стекле или в пробирках с живой и гретой культурами. штэммов энтеробактерий в реакции агглютинации с иммунными сыворотками при по-: становке реакции как на стекле, так и в пробирках с живой и гретой культурами, Результаты серотипирования исследованных штаммов микроорганизмов предлагаемым способом и способом-прототипом суммирования в табл. 2.

Как видно из табл. 2, применение предлагаемого способа было более эффективвано 63;8+7,0% (30 штаммов) культур исследованных энтеробактерий, из них; 10 штаммов шигелл (83,3%); 7 — сальмонелл (46,6%); 13 — эшерихий(65,0%), а предлагаемым способом — 89.4+4,5% (42 штамма) бактериальных культур, из них: l2 штаммов шигелл (100,0%); 12 — сальмонелл (80,0%);

18 — кишечной палочки (90,0%).

Число серотипированных штаммов энетробактерий при использовании предкультур, при известном способе проявляю. щих О-инагглютинабельность, так и культур, которые по способу-прототипу агглютиниоставалось пространство, в которое может 45

Пример 1. Больная П. (история болезни 8129), сотрудница столовой ¹ 1, село Александровка проходила амбулаторное лечение в поликлинике ЦРБ. Диагноз: кишечная инфекция невыясненной этиологии. При прямом бактериологическом обследовании были выделены микроорганизмы по биохимическим свойствам, и роходя щие как лактозоотрицательные. неподвижные кишечные палочки..К тому же способа позволяет восстановить агглютинэбельные свойства выделенного микроорганизма, что позволило прервать эпидемиологическую цепочку.

Пример-2. Больная P (ист, îëåçíè денного лечения шигеллы выявлены не были.

Пример 3. При бактериологическом исследовании мочи больной Е„5 лет (исто1758075

Формула изобретения

Таблица 1

Агглютинационные свойства кишечных йалочек, выращенных в различных условиях

Из них агглютинируются в разведениях моноспецифичесКМх сыво оток":

Условия выращивания

Число исследованных микроорганизмов

400

800 1600

200

100

3200

800

Общепринятые методы

Способ-прототип

Мйкроазробные условия, содержащйе углекислый газ {анаэростат) 5

11

18

18

18

18 t2

13

18

18

18

18

12

13

18

18

18

18

11

13

18

18

18

18

8

11

13

18

18

18

18

СО2 — 2% 20

СΠ— 5% 20

СОр-8% 20

COz-10% 20

COz--12% 20

C0z — 20% 20

3

18

18

18

13

13

13

Инкубирование в эксикато е

18 18

20 рия болезни 31149), находящейся на стационарном лечении в Оренбургской детской клинической больнице с диатнозом: острый йиелонефрит, после проведенного антибактериального лечения из мочи была вы- 5 делена кишечная палочка. Массивность обсеменейия мочи, определенная методом секторных посевов; была 10000 КОЕ/мл.

При серотипировании микрооргайизмы хорошо агглютинировались- моноспецифи- 10 ческой сывороткой 0143:К, При развернутой пробирочйой реакции агглютинации культура, предварительно прогретая в течение 1 ч при 100 С, агглютинировалась до 1/8 тйтра. Негретая живая культура (идентифика- 15 ция К-антигена) хорошо типировалась до

"диагностического титра. Обычно такие культуры, полученные в ходе бактериоло- гического обследования, считаются нети . пичными и по результатам данного анализа 20 дается отрицательный ответ. Испол ьзование сйособа-прототипа не дало какйх-либо результатов. При обследований с использованием предлагаемого способа через 24 ч инкубации в зксикаторе гретая культура 25 агглют и ниро вала сь сывороткой в дйа гно- стических титрах, нагретая (живая) культура также агглютинировалась в диагностическом . титре моноспецифической сывороткой, т, е. удалось восстановить агглютинабельные 30

: свойства вйделенной культуры энтеропатогенной кишечной палочки. Это позволило своевременно изолировать больную и предотвратить вспышку внутрибольйичной инфекции,......... - 35

Таким образом, использование предла гаемого способа в сравнении с существующими методами обеспечивает увеличение числа серотипированных патогенных знтеробактерий, позволяет избежать дополнительных расходов питательных сред, применения вспомогательных способов устраненйя инагглютинабельности бактериальных культур (выращивание на среде

Хоттин гера или в желчном бульоне, селекционирование клонов и др,) и дает возможность сократить время выдачи окончательного диагностического" заключейия по исследуемым микроорганизмам, укорачивая время обследования бактериальных культур, которые плохо агглютинируются поливалентными и, моноспецифическими сыворотками, что делает его особо ценным в эпидемиологическом плане.

Заявляемый способ прост, не требует специального оборудования и доступен для работы в любой бактериологической лаборатории. Способ идентификации патогенных знтеробактерий, включающий посев и культивирование энтеробактерий на питательной среде с последующим проведением реакции агглютинации и идентификацией их rio. результатам реакции, отличающийся тем, что. с целью повышения точности способа за счет устранения инагглютинабельности и его уйрощения, культивирование знтеробактерий "осуществляют в микро- . азробных условйях с атмосферой, содержа щей от 5 до 10 углекислого газа.

Таблица 2

Сравнение эффективности различных способов идентификации атипичных культур энтеробактерий в реакции агглютинации

П р и м е ч а н и е: р — достоверность различий между способом-прототипом и предложенным способом.

Составитель А. Шеенков

Редактор M. Келемеш Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л. Лукач

Заказ 2972 Тираж . .. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

133035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 103