Способ выявления чумного микроба

 

Использование: медицинская микробиология . Сущность изобретения: выявление чумного микроба проводят путем контакта чумного бактериофага с возбудителем чумы , смешивая каплю из суспензии исследуемой агаровой культуры с цельным диагностическим фагом перед нанесением на агаровую пластинку. После совместного инкубирования на агаровой пластинке при 28°С в течение 4 ч делают мазок-отпечаток , окрашивают его и чумной микроб выявляют по наличию в мазках клеточного детрита. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4866889/13 (22) 25.07.90 (46) 23.08.92. Бюл. ¹ 31 (71) Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего

Востока (72) Г.П, Апарин и Т.И. Вершинина (56) Руководство по профилактике чумы. /Под ред. Николаева Н.И. —.Саратов, 1972, 200 с.

Труды института "Микроб". — Саратов, 1960, вып.4, с, 358 — 368. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЧУМНОГО

МИКРОБА

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в частности для ускоренной идентификации возбудителя чумы в экспедиционных и стационарных условиях.

Известны способы изучения прямого действия бактериофэга на плотных и в жидких,питательных средах.

Наиболее близким по технической сущности является ускоренный способ, включающий использование приема смешивания исследуемого материала с чумным бактериофэгом, контакт чумного бактериофагэ с культурой микроба на пластинке питательного эгара при 28 С с последующей микроскопией, Появление негативных колоний бактериофага свидетельствует о наличии в исследуемом материале возбудителя чумы.

Однако известный способ имеет следующие недостатки: результат учитывается, начиная с 5 до 12 ч; действие чумного бэктериофага недостато1но специфично, он мо>К8Т лизировать и штэммы возбудителей псевдотуберкулеза, дизентерии, сельмонеллеза, а также кишечную палочку. Ж, 1756347 А1 (я)з С 12 И 1/00, C 12 Q 1/04

- — (57) Использование: медицинская микробиология, Сущность изобретения; выявление чумного микроба проводят путем контакта чумного бактериофага с возбудителем чумы, смешивая каплю из суспензии исследуемой агаровой культуры с цельным диагностическим фагом перед нанесением на агаровую пластинку. После совместного инкубирования на эгаровой пластинке при 280С в течение 4 ч делают мазок-отпечаток, окрашивают его и чумной микроб выявляют по. наличию в марках клеточного детрита. 1 табл.

Цель изобретения является ускорение и повышение специфичности способа, Указанная цель достигается тем, что согласно способу, включающему контакт чумного бактериофага с возбудителем чумы, каплю смеси из суспензии агаровой культуры с цельным диагностическим фэгом наносят на пластинку питательного агара, посев подращивают при 28 С в течение 4 ч. делают мазок-отпечаток с последующей микроскопией.

Существенность отличий предлагаемоо способа заключается в том, что осуществлен новый подход к учету феномена фаголиэабельности. Исследователь получает возможность наблюдать действие фага на микробную клетку непосредственно, а не судить о ней косвенно по отсутствию роста на питательном агаре.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят суспенэию изучаемого штамма иэ односуточной агаровой культуры концентрацией ",0 м,к./мл в объеме 3 мл. добавляют 0,1 мл коммерческого диагностического

1756347 чумного бактериофага и хорошо перемешивают. Каплю полученной смеси наносят в центр пластинки питательного агара, подсушивают, инкубируют посев при 28 С в течение 4 ч, Делают мазок-отпечаток, фиксируют, окрашивают одномоментно фуксином, кристаллвиолетом или метиленовой синью и просматривают под микроскопом.

С контролем проделывают те же манипуляции эа исключением добавления бактериофага.

При действии фага в мазках регистрируют клеточный детрит и единичные клетки фагоустойчивых мутантов чумного микроба, увеличенные в размерах вследствие феномена физиологического гигантизма, что свидетельствует об их жизнеспособности. При отсутствии лизиса в опыте и контроле наблюдают одинаковую картину— сотни клеток в поле зрения.

Пример 1. К 3 мл одномиллиардовой суспензии чумного вакцинного штамма EB добавляют 0,1 мл чумного диагностического фага, каплю смеси наносят на поверхность

arapa и после четырехчасовой инкубации при 28оС делают мазок-отпечаток с места посева. Контроль — то же самое. но без контакта с фагом, При просмотре окрашейных мазков-отпечатков с опытной взвеси обнаруживают клеточный детрит, от 1 до S крупных клеток не в каждом из 20 просмотренных полей зрения; в контрольной взвеси — в каждом поле зрения сотни крупных клеток, что свидетельствует о действии фага на изучаемую культуру.

Пример 2. Способ осуществлен с штаммом Y, pseudotuberculosis 21/250, который лизируется чумным диагностическим бактериофагом в прототипном варианте. В результате в опытном мазке-отпечатке, как и в контрольном, регистрируют множество увеличенных s размерах микробных клеток до сотен в поле зрения, что указывает на отсутствие действия фага на культуру псевдотуберкулезного микроба

Всего испытано 129 штаммов чумного микроба, выделенных от млекопитающих и эктопаразитов s различных очагах Советского Союза и MHP. Штаммы относились к различныМ подвидам, что свидетельствовало о разнообразии их биологических свойств, включая плаэмидный состав. Испытывались также субкультуры отдельеных штаммов, отличающиеся от исходных по кальцийэависимости и пигменетсорбции, Для проверки стабильности результатов 11 штаммов исследовали по 3-6 раз. Всего

40

Формула изобретения

Способ выявления чумного микроба. включающий совместное инкубирование исследуемой культуры и чумного бактериофага на агаровой пластинке с последующим учетом результатов микроскопированием, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности способа, перед нанесением на агаровую пластинку исследуемую культуру смешивают с чумным бактериофагом, после инкубации для микраскопирования готовят мазки-отпечатки, окрашивают их и чумной микроб выявляют по наличию в мазках клеточного детрита. проведено 160 испытаний штаммов возб дителя чумы и его субкультур с использова нием предлагаемого и известного способов

Во всех случаях получали однозначные ре эул ьтаты.

Для подтвереждения специфичность, предлагамого способа изучали 43 штамма возбудителя псевдотуберкулеза (включая 15 штаммов, которые в момент выделения лиО зировались чумным фагом по известному способу), 16 штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза, 10 - шигелл; 8- сальмонелл, 5- кишечной палочки, Результаты представлены в таблице.

5 Как видно иэ таблицы, специфичность предлагаемого способа высока. На штаммы возбудителей кишечного иерсиниоза, шигелл. сальмонелл и кишечной палочкй, чумной фаг по предлагаемому и известному способам не действовали. Преимущества предлагаемого способа выявлены для штаммов псевдотуберкулезного микроба. Если по известному способу некоторые культуры лизировались чумным фагам, то предлагаемый способ ни в одном случае не выявил это неспецифическое действие.

Особенностью способа является возможность судить о чувствительности к бактериофагу непосредственно по микроскопической картине в мазке-отпечатке: клеточный детрит и единичные жизнеспособные клетки чумного микроба после контакта с фагом, в контроле — сотни неповрежденных микробйых клеток в поле зрения, Способ можно использовать для ускорененой идентификации чумного микроба: он позволяет ускорить определение фаголиэабельности с 5-12 до 4 ч, выявляя строго специфическое действие чумного диагностического фага исключительно на культуры чумного микроба.

1756347

Составитель Г.Апарин

Техред M.Moðãåíòàë Корректор С.Патрушева

Редактор Н.Рогулич

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3062 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5