Способ получения лейкоцитарного интерферона

 

Использование: генетическая инженерия , получение лейкоцитарного интерферона . Сущность изобретения: способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической и биологической активностью ЧеИФН-а. Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ДНК последовательности Z-pBR 322 (Pst) HCIF-4c, Z-pBR 322 (Pst), HIF-2h, Z- pBR 322 (Pst) HclF-SN-35, Z-pBR 322 (Pst) HclF-SN-42, Z-pKT 287 (Pst) HclF-2h-AH6, a также последовательности, которые гибридизуются с изложенными вставками.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ („ (Л

Ж, > Сл) (21) 3233703/13 (22) 08.01,81 (31) 80300079 (32) 08.01.80 (33) ЕР (46) 23.09.92, Бюл, К 35 (71) Биоген Инк (US) (72) Чарльз Вайссманн (СН) (56) Proc. Natl, Acad. Sci., USA 76, р. 640—

644, 1979, (54) СПОСОБ ПОПУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО,ИНТЕРФЕРОНА (57) Использование: генетическая инженеИзобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению человеческого лейкоцитарного интерферона.

Известен способ получения лейкоцитарнэго интерферона, предусматривающий культивирование штаммов культивируемых клеток животных, выделение и очистку целевого продукта.

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта.

В данном способе осуществлено обнаружение последовательностей ДНК, кодирующих ЧеИФН-а в клетках Е.coll.

С помощью данного способа получают полипептид(ы), проявляющие иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН-а.

Настоящий способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, облада„„!Ж„„1764515 АЗ рия, получение лейкоцитарного йнтерферона, Сущность изобретения: способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической и биологической активностью ЧеИФН- и, Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ДНК последовательности Z-pBR

322 (Pst) НСП=-4с, Z-pBR 322 (Pst), HIF-2h, ZpBR 322 (Pst) HclF-SN-35, Z-pBR 322 (Pst)

HciF-SN-42, Z-pKT 287 (Pst) HclF-2h-АН6, а также последовательности, которые гибридизуются с изложенными вставками, ющий иммунологической или биологической активностью ЧеИ Ф Н-а.

Получены рекомбинантные ДНЕ, содержащие ДНК последовательн: сти ZpBR322/Pst) (HClF4c, Z-pBR332(Pst)/

HclF-2h, Z-pBR322/Pst/HclF-SN 35, Z-pBR

322/Pst/HclF-SN42, Z-рКТ287/Pst/HctF2h-АН6, а также ДНК последовательности, которые гибридизуются с упомянутыми вставками, Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Человеческие лейкоциты стимулируют в течение 5 часов при 37 С вирусом Сендай и экстрагируют с иесь поли(А)РНК, содержащей MPHK человеческого лейкоцитарного интерферона (Ч1ЗИФН-а мРНК). Стимулированные лейкоци, ы собирают и 10 клеток суспендируют в 1 л рас11 твора, содержащего 8 г NaCI, 0,2 г l:CI, 1,15 г NazHP04 2HzO и 0,2 г KHzP04, раггворен1764515

45

55 ных в 1 л воды ("PBS"), и добавляют при интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ

Трис-H CI (p H 7,5), 1 MM Эдтук ("ТЕ"-буфер"), 2% додецилсульфата натрия (ДСН) в делительную воронку емкостью 50 л. Прибавляют проназу к 200,и г/мл и перемешивают раствор в течение 1 ч пои комнатной температуре. Прибавляют 10 отсч./мин,125 I-глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2М

Трис-НС! (рН 9) в количестве, равном 1/20 от общего объема ("1/20 объемн"), и смесь экстрагируют при энергичном перемешивании 15 л повторно перегнанного фенола в течение 10 мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин, После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу, всего 19,1 л объединяют с

60 r ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водной фазы 1/10 объемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5,5) и 2 объемами этанола, После хранения в течение ночи при20 С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито.

Этот материал затем перемешивают с 200 мл THE (50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 100

MMNaCI, 5 мМ ЭДТУК), содержащего 0,5%

ДСН. Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора. Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуге Сорволл RC-3 в течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл THE содержащего 0,5% ДСН, Оба раствора THE объединяют, экстрагируют 3 раза 1 обьемом фенола, 3 раза 1/2 объема эфира и 3 раза 1 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК.

Поли(А) PHK смеси выделяют адсорбцией на олиго(бТ)целлюлозе. Прибавляют

2,7 r олиго(бТ)целлюлозы к 500 мл, После перемешивания в течение часа при комнатной температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(бТ)целлюлозе, центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК, связанных с ней, промывают один раз 50 мл

THE и второй раз 15 мл THE. Затем связанную поли(А)РНК элюируют пятью последовательными промывками 2 мл Н О.

Получают 860,и г поли(А)РНК. Надосадочный раствор PHK из первой адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции, При второй и третьей адсорбциях получают 600,и г и 170,и г PH К.

PHK испытывают на ЧеИФН-а активность путем инъекции в ооциты Xenopus

laevis,РНК растворяют в 15 мл Трис-HCI (рН

7,5), 88 мМ NaCI (ТН К буфер), чтобы получить концентрацию около 1 мг/мл. Инъецируют

50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов.

Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкубированные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастера в трубке для центрифуги Эппендорфа емкостью 1,5 мл в 0 5 мл 52 мМ трис-глицеринового буфера (рН 8,9). Смесь центрифугируют в течение

2 мин в центрифуге Эппендорфа, надосадочный слой сливают и замораживают при

-20 С для испытаний. Одна единица ИФНа снижает количество вируса на пластине на 50%. Активность препарата ИФН-а выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН-а 69/19, Экстракт ооцитов имеет активность 300 IU ИФН-а на ,и r PHK, при этом ооциты инкубируют в течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(А)РНК добавляют 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) к поли(А)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 м М ЭДТУК. Полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом THE-насыщенного фенолом и 5 раз

- равным объемом эфира. Затем его пропускают через колонку с 0,1 мл, нагре гую за 90 с до 100 С, и слоем в 13 мл с градиентом сахарозы 5 — 23%, содержащей 50 мМ TpucHCI (рН 7 5), 1 мМ ЭДТУК, 02 М NaCI. В качестве маркера добавляют 10000 спм 5концевого 32 р-меченых фрагментов ДНК, произведенных при одновременном усвоении pBR 322 и эндонуклеаз Hind III u Pst 1, Центрифугирование проводят в SW 40 роторе при 10 С и 35000 об/мин в течение 16 ч.

Фракции (0,6 мл) собирают с градиентом ($СО коллектором при 1 мл/мин, Испытывают фракции на ЧеИФН-амРНК, их положение по отношению к P-ДНК маркеоам, При зг последующем центрифугировании. фракции, содержащие ЧеИФН-а мРНК, идентифицируют относительно маркеров. Фракции с активностью ЧеИФН-й MPHK содержат 80и г поли(А)РНК. Их смешивают с 2 объемами THE, содержащего 0,5% ДСН и

0,02% поливинилсульфата (в последних приготовлениях поливинилсульфат был исключен), при этом применяют колонку с 50 ,и л олиго(бТ)целлюлозы, После промывки колонки 40,и г смеси PHK элюирук>т 4 промывками 0,6 мл дистиллированной воды, После осаждения этанолом PHК растворяют в 1 мгlмл в 0,5 мМ ЭДТУК, Испытание на активность ЧеИФН-Q мРНК проводят, как описано выше, на порции осадка поли(А)РНК, Он имеет удельную активность 3600 IU интерферона/рг, Следовательно, градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно 10-кратно по отношению к ЧеИФН-и мРНК, Получают приготов1764515

55 ление с примерно 40-кратным обогащением,Синтез с ДНК смеси, содержащей ЧеИФН-а с ДНК.

Поли(А)РНК, обогащенную ИФН-а м Р Н К, испол ьзуют в качестве шаблона (модели) для получения однониточной комплементарной ДН К (сДН К). 800и л реакционной смеси содержит 40 мМ Трис-Н С! (рН 7,5), 30 мМ NaCI, 5 мМ М9С!г, 0,5 мМ ДТТ, 20 мг/мл олиго(с!Т)12 — 18, 5 мМ dGTP, dCTP и dTTP, 5 мМ 32 P-dATP (НЕН, удельная активность

10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(А)РНК и

280 ед. обратной транскриптазы. После инкубации в течение 1 ч при 37 С прибавляют

0,5 М ЭДТУК и 20 ДСН (перекристаллизованного) к 10 MM ЭДТУК и 0,1% ДСН, Смесь экстрагируют 1.объемом фенола (перегнанного). Фенольную фазу промывают 200,и л

200 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 1 MM ЭДТУК и

0,1% СДН, объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс

G-100 в THE. Собирают фракции по 0,1 мл при 0,3 млlмин, Фракции, показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова), объединяют и прибавляют

ЗМ. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С образцы центрифугируют, отбрасывают надосадочный слой.

Осадок растворяют B 180 и л дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа, Прибавляют 20 ,и л 5MNaOH и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин, Прибавляют

20 мл 5М ацетата натрия, 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола, После охлаждения в течение ночи при -20 С собирают полученный осадок центрифугированием при силе, эквивалентной 10000кратной силе тяжести (10000xg) в течение 20 мин при 0 С, Выход однониточной сДНК составляет 10,иг, Однониточный продукт сДНК находится в реальной сложной смеси большого числа различных сДНК, транскрибированных из соответствующих мРНК, имеющихся в смеси поли(А)РНК, Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН-а, например HilFN-асДНК, Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза малого на щелочном 2/,-ном геле агарозы с использованием 30 мМ NaOK, 2мМ ЭДТУК в качестве электролита, P-сДНК имеет зг длину 600 — 1000 нуклеотидов, относящихся к однониточному глобину СДНК, P-меченые фрагменты ДНК используют в качестве маркеров размера.

Пример 2, Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК

5 полимеразой 1. Осажденную однонитевую сДНК растворяют в 200и л НгО, нагретой до

100 С, в течение 2 мин и инкубируют в

500и л 0,1 М нагретого денатурированного калийфосфатного буфера (рН 6,9) 10 мМ

10 М9С!г, 10 мМ ДТТ, 1 мМ каждого из dATP, dGTP и dCTP, 1 мМ Н-бТТР (НЕН, удельная активность 100000 спм/нмоль) и 150 ед,/мл

E=coli ДНК полимеразы 1, После 6,5 ч при

15 С прибавляют 0,5 ЭДТУК и 20% ДСН к 10

15 мМ ЭДТУК и 0,1 ДСН. Затем смесь экстрагируют 500,ил фенола, фенольную фазу повторно экстрагируют 250,ил 20 мМ Трис-HCI (рН 7,5),5 мМ ЭДТУК(ТЕ буфер). Обе водные фазы объединяют и хроматографируют на

20 колонке с 5 мл Сефадекс 6-100 в тех же самых условиях, Прибавляют ЗМ ацетат натрия к 0,3 М и 2,5 объемам этанола, смешивают для осаждения ДНК. Всего собирают

13,иг ДНК, 25 ДНК обрабатывают нуклеазой 1. Осажденную ДНК растворяют в 250 мл буфера (0,2 M NaCI, 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5), 10 мМ сульфата цинка и нагревают при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют 1,5 ил S>

30 фермента (11 единиц/,ил), смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют

ДСН и ЭДТУК к 0,1% ДСН и 5 мМ ЭДТУК и экстрагируют смесь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 ulTE буфера, Объединяют водные фазы и хроматографируют на колонке с Сефадексом G-100 в THE, собирают фракции по 0,1 мл при скорости 0,3 млlмин и определяют радиацию Черенкова для каждой фракции, После осаждения из

4о этанола и ацетата натрия собирают 8 р г двойной спирали ДНК.

Пример 3, Обрабатывают плазмиду (в частности, pBR 322) эндонуклеазой Pst I u добавляют dGMP хвосты концевой трансфе45 разой. dGMP добавляют к 5 концу плазмиды для регенерации Pst I сайта и лигируют с сДНК фрагментом, несущим комплементарные хвосты, Двунитевую сДН К удлиняют при добавлении dCMP хвостов к 3 концевому. Затем плазмиду и сДНК обрабатывают лигазой, чем обеспечивается введение сДНК в подходящий сайт плазмиды и получение гибридной ДНК, Пример 4, Плазмиду рВР322 (20 r) гидролизуют 21 единицами Pst I эндонуклеазы в 150 мл 10 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 6 MM

М9С!г, 50 мМ NaCI, 6 мМ МцС!г, 50 мМ NaCI, 6 MM 2-меркаптоэтанола, 200 мг/,ил бычьего сывороточного альбумина (БСА), После 2 ч

1764515

55 при 37 С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (1:1) и 1 обьемом эфира и осаждают этанолом, Добавление гомополимерных хвостов

dGMP с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансферазы (TdT) осуществляют в

328 мл реакционного объема, содержащего

100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 10 мМ

КаХгРО, 5 мМ МцС!2, 1 мМ dGTP, 50 мгlмл

БСА и 3 — 6 ед. ТбТ(очищенного как указано выше) на 1 мг ДНК. Инкубируют при 37 С в течение 20 мин. Прибавляют ЭДТУК к 10 мМ, смесь экстрагируют как указано выше и диализуют два дня против буфера THE.

Двунитевую ДНК удлиняют остатками

dCMP по стандартной методике, Инкубируют 150 мл двунитевой сДНК, описанной выше, а 8 ил 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 2,5 мМ CoCiz, 50 pr/Mn БСА, 0,2 MM dCTR, содержащего 3 — 6 ед. очищенного TdT на мг

ДНК, в течение 8 мин при 27 С, а затем замораживают при -20 С, Инокулируют одну колонию Е,coli XI776 в 100 мл триптоновой среды с добавкой 100и г/мл диаминопимелиновой кислоты, 10 ,и г/мл налидиксовой кислоты и 10,иг/мл тетрациклина, Выращивают культуру при

37 С до кажущейся оптической плотности

0,6 при 650 нм (ОДем) и охлаждают на льду в течение 30 мин. Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе, клетки промывают 50 мл 10 мМ NaCI, отделяют на центрифуге и повторно суспендируют в 20 мл 100 MM CaClz. Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ

CaClz и хранят на льду в течение ночи для использования, Аликвоты (0,5 мл) хранят замороженными при -70 С.

Смешивают 3 нг dCMP-удлиненной

ДНК с 22 нг dCMP-удлиненной Рзт I, обработанной pBR322 в 50 мл THE-буфера. Инкубируют при четырех последовательных стадиях при 65, 46, 37 и 20 С, Прибавляют

20,ил 100 мМ Трис-НCI (рН 7,5), 100 мМ

СаС!, 100 мМ MgClz и 50,ил THE буфера, смесь охлаждают на льду 20 мин.

Рекомбинантные молекулы PHK добавляют к 100,ил обработанных Са клеток

Е,coli и смесь охлаждают на льду в течение

20 мин, нагревают до 20 С в течение 10 мин и прибавляют 0,6 мл триптоновой среды.

Смесь помещают на 2 пластины с триптоновой агаровой средой, подготовленные как описано ранее. Эффективность трансфекции составляет 3,3 10 колоний на,иг зака4 ленной pBR322 трансфецированной ДНК, нативная pBR322 дает 3 10 колоний на,иг, 5

Так как плазмида pBR322 включает ген устойчивости к тетрациклину, Е.coli реципиент, который был трансформирован плазмидой, будет расти в культуре, содержащей такой антибиотик, в отличие от нетрансформированных таким образом бактерий, Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию организмов-хозяев, трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или рециклизованным вектором.

После 48 ч при 37 С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл триптоновой среды (подготовленной, как описано выше) в углублениях микротитерных пластин, После инкубации при 37 С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40 -ного глицерина. Пластины выдерживают при -20 С и готовят набор из

100000 индивидуальных клонов трансформированной Е,coli Х1776, Пример 4. Рекомбинантные молекулы

ДНК расщепляют, денатурируют и гибридизируют с лейкоцитами поли(А)РНК, содержащими ИФН-амРНК . Гибриды рекомбинантных молекул ДН К-поли(А)Р Н К отделяют от негибридизированной поли(А)РНК (стадия C). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают(стадия Д). Выделенную P H К исп ытывают на активность ИФН-амРНК (стадия

E). Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов, способной гибридизироваться с поли(А)РНК в жестких условиях гибридизации, а также вызывает образование

ИФН-ав ооцитах, Если группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировывают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают, Этот процесс продолжают до тех пор, пока не будет идентифицирован единичный клон, Однако полученные рекомбинантные клоны не содержать полную последовательность с ДНК ИФН-а, Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой.

После инкубации при 37 С каждый клон разрастается в колонию несколько миллиметров в диаметре. Все колонии отмывают с пластин и собирают, получают инокулум, использованный для инокулирования 1 л триптоновой среды, заполнившей, как описано выше, 2 л колбу Эрленмейера. Культуру встряхивают при 37 С до появления ОДыо примерно 0,8 (оценено визуально). Один объем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170,иг/мл прибавляют к культуре, которую снова встряхивают при 37 С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформа

1764515

55 и культуру снова встряхивают 10 мин при

37 С, чтобы уда ить бактерии. Культуру декантируют с хлороформом, клетки собирают центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин при 4 С, Получают примерно 1 — 2 r клеток из каждого литра рецептуры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 MM

Трис-HCI (рН 7,5), центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин и 4 С, повторно суспендируют в 30 мл 50 мМ Трис-HCI (рН 7 5), Прибавляют 0,25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5)), после охлаждения в течение 10 мин при 0 С прибавляют 0,33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-HCl-культур), 0,5

M ЭДТУК (рН 8,0), осторожно перемешивают без встряхивания, Еще через 10 мин при

0 С прибавляют 1/16 объема (снова считая на первоначальный объем) 2 / Тритона Х100, Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0 С в роторе. Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и прибавляют 3 М NaOH при перемешивании до тех пор, пока не будет достигнут рН 12,5, измеряя при 20 С, используя стеклянный электрод и рН-метр, стандартизированный стандартным карбонатным буфером Бекманн рН 10 (N 3505), После перемешивания в течение 10 мин при 20 С устанавливают рН 8,5, После еще 3 мин перемешивания прибавляют 1/9 объема 5М NaCI и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного

9,5 M NaCI) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0 С в течение

10 мин. Надосадочный слой, содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК), осторожно удаляют из промежуточной фазы (которая содержит однониточную ДНК) и 3 раза экстрагируют хлороформом, (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии), Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантные молекулы ДНК (pBR 322-сДНК вставка), первоначально использованные для трансформации этих клеток организмареципиента, которые образуют часть 512 клонов, выбранных для испытания.

Прибавляют панкреатическую РН Казу А (5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85 С) к форме 1 ДНК до концентрации 20и г/мл и инкубируют смесь в течение 60 мин при 37 С. Прибавляют 1/5 объема 5 М NaCI и смесь обрабатывают 30/ полиэтиленгликолем 6000до окончательной концентрации 7,5 / ПЭГ, После 2 — I6 ч.при

-10 С собирают осадок в роторе в течение

20 мин при 8000 об/мин и 0 С, растворяют в 0,075 М NaCI, 0,0075 М цитрата натрия до поглощения 20 при 260 нм и доводят до

0,5 ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при

37 С с 0,5 мг/мл проназы (20 мг/мл, 2 ч при

37 С) и 3 раза экстрагируют 1 объемом перегнанного фенола и 2 раза 1 объемом хлороформа. Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте сахарозы от 5 до 23 в 50 MM Tpuc-HCI (р Н

7,5), 1 мМ ЭДТУК в течение 15 ч при 21000 об/мин и 15 С. Собирают фракции и контролируют ОДыс, Собирают фракции, содержащие ДНК, и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20 — 100,иг смеси ДНК.

20,иг ДНК обрабатывают в 150рл 10 MM

Трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ MgCIz, 50 MM NaCI, 6 MM 2-меркаптоэта нала, 200,иг/мл Б СА или желатина и 20 единиц Hind III. Эндонуклеазой Hind I I I расщепляют плазмиду p B R 322, После 2 часов при 37 С аликвоты (1,) подвергают электрофорезу на 1 агарозном геле в 50 MM трис-ацетате (рН 7 8), 2 мМ

ЭДТУК в течение 1 ч при 50 МА, чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработка не закончена прибавляют еще

Hind Ш и продолжают инкубацию еще 2 ч.

Когда ДНК полностью расщеплена, прибавляют проназу, ЭДТУК и ДСН в количестве

0,5 мг/мл, 10 мМ и 0,57; соответственно.

После 30 мин при 37 С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (1:1).

Промывают 50,ил р-ра 20 мМ Трис-HCI (рН

7,5), 1 мМ ЭДТУК, объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром, фильтруют через колонку 0,1 мл, обработанную ЭДТУК, и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С ДНК собирают центрифугированием, Готовят две гибридизирующие смеси.

Смесь I содержит 4,ил 10-кратно концентрирован ного буфе ра (4М Na CI, 0,1 П И П С (р Н

6,4, 1,4-пиперазиндиэтансульфокислота), 50

MM ЭДТУК,.0,5,ил (около 5 нг " J-глобин мРНК (5000 спм) и 6 мл индуцированной лейкоцитарной поли(А)РНК (2,иг/рл). Смесь

Il содержит 10 иг обработанной Hind III ÄÍ Ê и 0,1,иг Pst-Z-pBR322 (НЗ)Вс j3G 4,13 ДНК (производная pBR322, которая содержит последовательность Р-глобина в Hind ill сайте), Обе смеси сушат в парах газообразного азота, Прибавляют 40 мл 80 / формамида к остатку смеси II и денатурируют раствор в течение 10 мин при 100 С и быстро охлаждают на льду. Денатурированный раствор используют для растворения смеси, а полученный раствор инкубируют при 56 С в течение 4 ч, После разбавления до 1 мл холодным

0,9 M NaCI, 0,09 М цитратом натрия и 100//1764515

12 ным формамидом до 4О/, (Ro объему), раствор фильтруют при 0,5 мл/мин через фильтр Миллипор {размер пор 0,45 мм), сначала фильтр испытывают на его способность удерживать гибриды ДНК/РНК, потому что не все фильтры, полученные от производителя, в равной мере эффективны, Погружают указанный выше фильтр с гибридами поли(А)РНК в 1 мл 0,15 М NaCI, 0,015 М цитрат натрия, 0,5/о ДСН в течение

10 мин при 37 С, промывают 50 мМ TpucHCI (рН 7,5), 10 мМ М9С!2, 2 мМ CaClz u помещают в 0,6 мл свежего буфера. Добавляют 5и л ДНКазы, обработанной иодацетатом (5 мг/мл). Фильтр инкубируют при 37 С в течение 10 мин, Удаляют фильтр и экстрагируют раствор 1 объемом фенола и 1 объемом эфира и пропускают через колонку с 0,1 мл, Прибавляют к раствору 5,иг PH К-носителя (PHK очищенных дрожжей) и осаждают

PHK ацетатом натрия и этанолом, Осадок собирают центрифугированием и ри

10000xg, растворяют в 100 мл 1 MM ЭДТУК, нагревают 90 с и ри 100 С и прибавляют THE и ДСН до 2 THE и 0,5о/ ДСН, Адсорбируют

PHK на колонке с 100,иг олиго dT/öåëëþëoзы, элюируют четырьмя промывками 0,3 мл дистиллированной воды и осаждают ацетатом натрия и этанолом. После 16 ч при -20 С осажденную PHK отделяют центрифугированием и растворяют в 2 мл буфера ТНК.

Раствор поли(А)РНК, полученный ранее, инъецируют в 40 ооцитов (примерно 5 нл в ооцит). Ооциты инкубируют при 23 С в течение 24 — 48 ч, гомогенизируют и центрифугируют (или инкубируют собранную среду) и испытывают, как описано ранее для

И Ф Н-а.

Проводят большинство последующих опытов с рекомбинантной молекулой ДНК из одного клона с ДНК, связанной с бумагой

ДВМ или ДРТ, Бумага ДРТ дает меньший фон, Листы ватмановской бумаги 540 (20 г) перемешивают 16 ч при 20 С со смесью 70 мл 0,5 М NaOH, 2 мг/л ИаВН4 и 30 мл 1,4-бутадиендиглицидилового эфира. Затем бума"гу переносят в раствор 10 мл

2-аминотиофенола в 40 мл ацетона и перемешивают 10 ч. Отмывают ацетоном, 0,1 н.HCI, H20, 0,1 í.HCI, Н О, сушат, Бумагу

APT диазотируют до бумаги ДРТ.

ДНК (до 15,иг) связывают на 50 мм диазотированной АВМ (ДВМ) или диазотированной APT (ДРТ) бумаги, Гибридную плазмиду ДНК гидролизуют

Pstl, обрабатывают 500,иг проназы на мл

0,5/ ДСН и 10 мМ ЭДТУК в течение 30 мин при 37 С, экстрагируют фенолом и эфиром, пропускают через колонку 0,1 мл и осажда55

R р и м е р 6. Так как первичные клоны из трансформированных клеток иногда содержат более одного вида рекомбинантных молекул ДНК, Hif-4c выделяют из Е.coll

XI776 (Hif-4C) клонов и очищают. Образцы

kif-4C и pBR322 гидролизуют Pstl и аналиют этанолом. Инкубируют денатурированную нагреванием ДНК (до 5,иг с малыми количествами добавленной P-ДНК в каче- 32 стве метки) при 0 С в течение ночи с 1 см

5 бумаги ДВМ или ДРТ в 200,ил 25 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5), фильтры промывают 3 раза по 5 мин при комнатной температуре 50 мМ калийфосфатным буфером (рН 6,5), 1/ глицина и 3 раза 99,— ным

10 перекристаллизованным формамидом. Далее инкубируют в 99О/ формамиде в течение

2 мин при 68 С, потом 3 раза промывают в

50 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,5) при

20 С и два раза промывают в 0,4М NaOH

15 при 37 С в течение 10 мин. На фильтрах остается около 40 — 60 радиоактивности, Фильтры инкубируют 3 ч при 38 С в предварительно гибридизованной среде А, заполненной 1 / глицина, используя 330 ил на

20 фильтр. Среда А содержит 50 /, формамида, 5хССК, 0,4 поливинилпирролидона, 0,04 / фикола, 0,1/ ДСН, 25,иг поли(А)(Р и 2) и 100 ,иг дрожжевой P H К/ВДН, экстра ги рован на я

6 раз фенолом и осажденная этанолом, 25 Фильтры дважды промывают в среде А, а затем гибридизуют в течение 16 ч при 38 С (поли(А)РНК, как указано, обычно 5 — 8 мг) в среде А в парафиновом масле. Прибавляют

PHK следующим образом; один влажный

30 фильтр ДНК промокают и кладут в стерильную чашку Петри, 20 — 40,ил раствора РНК наносят пипеткой на этот фильтр, а второй фильтр ДНК (или дубликат или контроль) кладут на верх и сэндвич покрывают сте35 рильным парафиновым маслом, После гибридизации фильтры последовательно промывают в среде А (2 раза) в растворе, содержащем 1хССК, 0,2 /о ДСН, 1 мМ ЭДТУК (3 раза, 10 мин при 20 С каждый, среде А (2

40 ч и ри 38 С) и в 50 формамиде, 5хССК, 0,1 /

ДСН (3 раза, 10 мин при 20 С). Гибридизованную PHK элюируют при нагревании в течение 1 мин при 100 С в 200 ил 10 мМ

Трис-НС! (рН 7,4), 1 мМ ЭДТУК и 0,1 / ДСН.

45 Отбирают клон Ш-4-С, который содержит рекомбинантную молекулу ДНК, способную гибридизовать ИФН-аи PHK.

Рекомбинантная молекула ДНК в этом клоне обозначена: 2-pBR322(PstllHcIF50 4c/Hif-4c), а бактериальный штамм, содержащий ее: Е,coli XI776 (Z-pBR322)Pst

Н с! Е04С(Е.coli Hif-4c), 1764515

13

1 мкг этой PHK дает 4600 IU /мл

** Надосадочный ооцит после 4В ч инкубации, анализ по снижению цитопатического эффекта

Пример 7, Вставка сДНК в рекомбинантной молекуле Hif-4c составляет только 40 около 320 вр или треть от оценочного размера ИФН-амРНК. Описанный выше очищенный фрагмент Hif-4c используют в качестве зонда для отбора бактериальных клонов, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, 45 зируют электрофорезом на 1% агарозном геле.

Е.coli НВ101 трансформируют Hif-4C

ДНК. Отбирают 6 клонов трансформированных бактерий, стойких к тетрациклину, выделяют из них ДНК, очищаюти анализируют с помощью Pstl гидролиза, электрофорезом на агарозном геле, Одну ДНК обозначают

2-pBR322/Pst (HciF-4c (Hif-4C) и используют.

Хif-4С и вставку гибридизуют с ИcDH-а и РНК, подвергают гидролизу 125 единицами Pstl, эктрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом, Аликвоту (10,иг растворяют в 100,ил 50 мМ Трис-HCI (рН

7,5), пропускают его через 0,1 мл колонку и обрабатывают его 0,6 единицами бактериальной щелочной фосфатозы в течение часа при 65 С, Добавляют 10 кратно концентрированный буфер THE (40 мл) и раствор экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола и 3 раа

1 объемом хлороформа, ДНК осаждают 2 объемами этанола при -20 С в течение ночи и собирают центрифугированием. Для дальнейшей очистки образец в 0,5 мл ТНА адсорбируют на 0,25 мл ДЕАЕ целлюлозы, которую предварительно промывают 2 мл

150 мМ NaCI, 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 2 мМ

ЭДТУК (Н ЕТ-буфер), промывают 2 мл Н ЕТ буфера, элюируют 0,4 мл 1,5 М NaCI, 20 мМ

Трис-HCI (рН 7,5), 2 мМ ЭДТУК и осаждают этанолом, ДН К инкубируют с у P-АТФ (удельная активность около 5000 кюри/ммоль) и полинуклеотидкиназой, и очищают хроматографически на 3 мл колонке Сефадекс

G-50 в ТНЕ. Элюированные фракции собирают и осаждают P-ДНКэтанолом.

Смешивают 90,иг немечен ной расщепленной Pstl Hif-4c ДНК с 6 10 дпм P-ме5 32 ченной расщепленной Pstl Hif-4c ДНК и роводят электрофорез через 10х20х0,7 см, 2% горизонтальный агарозный гель в 50 мМ трис-ацетатно го буфера (р Н / 7,8), испол ьзуя гель 2,5 см. Пленку на геле экспонируют

Х-лучами и определяют положение фрагмента 320-вр. Полосу геля, содержащую радиоактивную полосу (1,3 10 дпм), вырезают, измельчают, продавливая через

2 мл пластиковый шприц, и экстрагируют в течение ночи при 4 С при перемешивании

10 кратным по отношению к объему геля объемом буфера НЕТ. ДНК адсорбируют на

0,1 мл колонке гидроксиапатита, предварительно промытой 1 мл НЕТ буфера. Колонку промывают 1 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 7,5) и элюируют ДНК 0,2 мл 1 М калийфосфатного буфера(рН 7,5). Элюат разбавляют 10-кратным объемом стерильной дистиллированной воды и адсорбируют

ДНК, и элюируют из ДЕАЕ, осаждают этанолом. Такая ДНК называется "Hif-4c фрагмент".

Фрагмент Hif-4c (120 нг) связывают с бумагой ДРТ (0,5х0,5 см). Для контроля 120 нг фрагмента Р-глобина сДНК обрабатывают с Hind lil из гибридной плазмиды RcP

G-4,13 2-pBR322 и обрабатывают аналогично, Гибридизацию двойных фильтров к поли(А) PHK (В 20 мкл), промывку фильтров и выделение PHK с фильтров проводят как описано выше. После введения s ооциты определяют следующие значения активности ИФН-а: имеющие родственные вставки гисридной

ДН К.

Описанные выше 64 бактериальных клона, составляющих подгруппу il-ill, дробят на миллипористой мембране (диаметр 8 см), помещают на пластинку агара (с добавкой диаминопимеллиновой кислоты, налидиксовой кислоты и тетрациклина, как

1764515

40

50 указано выше) и инкубируют в течение 24 ч при 37 С. Фильтр помещают на 0,75 мл каплю 0,5 M раствора NaOH и через 2 — 3 мин переносят на бумажное полотенце, чтобы удалить избыток жидкости, эту стадиют повторяют. Фильтр нейтрализуют, используя буфер 1,5 M Tpuc-HCI (рН 7,5) и промывают смесью 1,5М NaCI-0,5 М Трис-HCI (рН 7,4) и высушивают на воздухе. Фильтр окунают в

0,3 М раствор NaCI, высушивают на воздухе и нагревают в вакууме 2 ч при 80 С.

Фрагмент Hif-4c Pst(30 нг) метят изотопом - P посредством трансляции метки, используя / P МАТФ и а Р бЦТФ (удельная активность, 40 Кюри/ммоль для каждого), Фильтр, несущий Л-Ill колонии, предварительно гибридизуют в 4 х СЕТ (СЕТ-это 0,15

М NaCI, 30 мМ Трис-HCI (рН вЂ” 8), 1 мМ

ЭДТУК). 0,1% (вес/объем) фиколла, 0,1% поливинилпирролидина, 0,1% (вес/объем) альбумина бытьей сыворотки (АБС) 0,5%

ДСН и 200 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося в течение 7 час при 68 С и гибридизуют с 2 10 срм меченого P фрагмента Hif-4c в 4 х

СЕТ, 0,02% (вес/объем) фиколла, 0,02% поливинилпирролидина, 0,02% (АБС, 0,5%

ДСН и 2300 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосоля при 68 С в течение 16 час), Фильтр промывают смесью СЕТ-0,5% ДСН при комнатной температуре, промывают 2 х

СЕТ-0,5% ДСН в течение 5 ч при 68 С, заменяя один раз раствор, и 3 MM основания

Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч, заменяя один раз раствор, После высушивания фильтра рентгеновскую пленку экспонируют этим фильтром в течение 80 ч, применяя экран. Три колоннии дают сильный положительный сигнал, а именно Л-III70 Л-III-2H и iL-III-4с, и две колонии — слабый сигнал, а именно Л-ШНЕ и Л-ill-3D. z

Малые культуры готовят из родственных Hif-4с клонов, форму 1 ДНК очищают, расщепляют с Pstl и анализируют посредством электрофореза на геле агарозы, Все формы 1 ДНК создают большой фрагмент (плазмидная pBR 322 функциональная группа) и малый фрагмент (гибридная вставка), Молекулы рекомбинантной ДНК Л-III-2H содержат наиболее крупную вставку, а именно приблизительно 990 млрд.ч, Эту молекулу рекомбинантной ДН К обозначают

Z-pBR 322 (Pst)/HCIF-2Í/(Hif-2H), а ее вставку "Hif-2H фрагмент", Определяют спсообность Hif-2Н связывать ИФН-амРНК посредством гибридизации по отношению к поли(А) PHK (0,3 мкг/мкл).

В последующем эксперименте готовят дополнительнь и набор клонов Е,соИ, содержащих молекулы рекомбинантной ДНК, и определяют гибридизацию колоний к меченому фрагменту Hif-4с, Для того, чтобы обеспечить высокий выход плазмид с длинными вставками сДНК, часть меченной Р лейкоцитной сДНК, полученной энзиматически из лейкоцитной поли(А) РНК, фракционируют по размеру посредством центрифугиования через градиент плотности сахарозы, ипользуя методику, аналогичную описанной для центрифугирования поли(А) РНК. Фракции, содержащие сДНК, со скоростью седиментации, соответствующей 600 млрд.ч. фрагмента ДНК или более, объекдиняют и после осаждения этиловым спиртом выделяют сДНК. Эту сДНК удлиняют остатками dCMP. pBR322, удлиненную

dGMP, расщепляют Pstl и гибридную ДНК используют для трансформации штамма

Е.coli НВ101. Бактерии наносят на миллипористые фильтры диаметром 8 см, помещают на пластинки агара триптоновой среды (содержащие 10 мкг/мл тетрациклина) и выращивают, пока не появляются малые колонии. Фильтр реплики готовят прессованием свежего, влажного миллипористого фильтра на фильтр, содержащий колонию, помещают его лицевой стороной наверх агаровой пластины, содержащей 4,4% глицерина, и инкубируют его, пока не появились малые колонии, Этот содержащий колонии фильтр покрывают дополнительным миллипористым фильтром, замораживают при55 С и хранят. Готовят 18 фильтров, содержащих в общем около 5000 колоний.

Одну реплику каждого фильтра используют для гибридизации к меченому P Pst Hit-4c фрагменту ДНК. На авторадиограмме идентифицируют около 185 положительных колоний, которые субклонируют на миллипористых фильтрах и идентифицируют повторно посредством гибридизации, 95 клонов, дающих наиболее сильный отклик гибридизации, обозначают от Z-pBR 322 (Pst)/HclF-SNl до SN95 и используют для дальнейших исследований.

Очевидно, при наличии способности

Hif-2 продуцировать полипептид, проявляющий иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН, Hif-2h и другие родственные последовательности оснований ДНК, могут применяться в этом пособе отбора клонов, содержащих последовательности основания ДНК, кодирующих интерферон а2.

Пример 8. Расщепленный фрагмент

Z р В 8322(НЗ)Рсфср 4,13 динатурируют в сме17

1764515

18 си 10 мкл 80/ (об.) деионизированного формамида-20 мМ буфера Пайпес (рН 6,4) в течение 10 мин при 80 С, Раствор добавляют в трубку Эппендорфа, в которой высушивают смесь лейкоцитной поли(А) РНК (5 мкг), NaCI (4 мкмоль) и ЭДТУК (10 нмоль), Смесь нагревают в течение 7 ч при 48 С под слоем парафинового масла, охлаждают и разбавляют 20 мкл воды. Два ообразца разделяют на равные части и каждую из них нагревают

30 с при 100 С, Нуклеиновые кислоты осаждают этанолом, растворяют в 3 мкл воды и анализируют на активность ИФН-а мРНК в ооцитах.

При гибридизации Н!1-2h поли(А) PHK ингибируется трансляция ИФН-а мРНК в поли(А) РНК; после денатурирования гибрида, ИФН а мРНК снова может транслироваться, Этот эксперимент подтверждает, что Hif-2h содержит последовательность, комплементарную к ИФН-ймРНК.

Получают плазмидную ДНК и обрабатывают различными рестриктазами за исключением того, что альбумин бычьей сыворотки в ферментном буфере заменяют на 200 мкг-мл желатина, Леаниризованную ДНК (20 мкг) экстрагируют фенолом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 0,05 М растворе буфера

Трис-KCI (рН 8) и пропускают через неболь-! шую колонку. Челекс-100. Фрагменты с 5липкими концами дефосфолируют путем обработки с0,,2 единицами телячьей кишечной щелочной фосфатозы на пмоль концов

5 ДНК в 200 мкл 0,02 M раствора Трис-НС2 (рН 8) в течение 60 мин при 37 С, Фермент дезактивируют нагреванием при 65 С в течение 60 мин. Для фрагментов ДНК с 3-липкими концами используют бактериальную щелочную фосфатазу, с тем исключением, что инкубируют при 65 С в течение 30 мин, фосфорилированную ДНК очищают путем адсорбции и элюирования с ДЕАЕ-целлюлозы или подвергают полиакриламидному гельэлектрофорезу, Фрагменты, выделеные из геля полиакриламида (или агарозы) в

0,15М растворе NaCI, 0,05 М-Трис-HCI (рН

8), адсорбируют на 0,1-миллилитровой оксиапатитовой колонке, промывают 4 раза 1 мл

0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7) и элюируют 0,3 мл 1М калий-фосфатного буфера (рН 7). Раствор разбавляют десятикратно, и адсорбированную на ДЕАЕ-целлюлозе ДНК выделяют, После осаждения этиловым спиртом ,ЦНК метят 5 -терминально с помощью

lY Р)АТР(12 — 34 мкКюри на пмоль 5-концов

ДНК), а полинуклеотидную киназу ДНК не денатурируютдо реакции киназы, Получают

55 удельные активности 1 — 1,5 мкКюри Р фосфата на пмоль концов-5-ДНК, Для определения последовательности аминокислот меченые. фрагменты расщепляют вторым ограничивающим ферментом, и продукты выделяют электрофорезом через 5 -ный полиакриламидный гель в буфер трис-борат-ЭДТУК, Целевые фрагменты экстрагируют из геля и очищают. Различные фрагменты для определения последовательности аминокислотных остатков готовят следующим образом:

1) расщепление Hif-2h с помощью BSpl, выделение BSpl-BSpl-232 и BSpl-BSpl-949 посредством гель-электрофореза через 5 полиакрламида в буфере Доенинга;

2) расщеплеие Hif-2h с помощью BSpl, введение метки, расщепление с помощью

PstI, выделение Bspl*-Pst1-83 и BSpl*-Pst

1-227;

3) Расщепление Hif-2h с помощью Bg ill, введение метки, расщепление с Pstl, выделение Bglllx-Pst 1-336 и Bglll*-Pst1-570;

4) расщепление Hif-2h с помощью

Mb011, введение метки, гидролиз с помощью Pst1 и Hindll, расщепление фрагмента pBR322, 350 млрд.ч., выделение

Mbo11*-Pst 1-519 и МЬо11*-Pst 1-351;

5) Расщепление Hif-2h с помощью

EcoR1, введение метки, расщепление с

Рзс1, выделение EcoR1*-Pst 1-707 и

Есо R l*P stl-198;

6) расщепление Hif-2h с помощью Pst1, введение метки, расщепление с Bglfl. выделение Pst1*-Bglo-570 и Pst1*-Вц)П-336;

7) расщепление Hif 2h с Avail, введение метки, расщепление с Pst1 и Во(И, выделение Avail*-Pst 1-186 и Avail"-Bgll-147, 8) Расщепление Hif-2h с Pvull, введение метки, расщепление с Рзт1 и BglQ, выделение Pvuil-Pstp-486, Продукты фракционируют на 0,1х25х36 см 12/ полиакриламидных гелей (акриламид/бисакриламид = 18/1) в 50 мМ трис-бората, 1 MM ЭДТУК (рН 8,3) с длительностью операций 2, 8, 18 и 26 ч при 90 в с предварительной выдержкой 6 ч при 700 в. Наилучшие результаты получают, когда гели до использования выдерживают при комнатной температуре 2 — 3 суток, Определяют нуклеотидную последовательность к ДНК вставки.

Причем гетерополимерную часть встав( ки заслоняю сбоку остатками 236 на 5-конце и остатками 7А (вероятно, относящимися к концевой группе поли(А) мРН К), за которыми следуют остатки 15С на концах-3 . Вставку пронумеровывают от первого нуклеотида после dG-хвоста к последнему нуклеотиду до остатков поли(А).

1764515

1/20 количества способной гибридизации в

Hif-2h м-РНК, содержащегося в поли(А) РНК из индуцированных клеток, Находящийся в pBR322 Pst1-сайт находится в Р-лактамазном (пенициллиназном) геле. Следовательно, если кодирующий

ДНК-сегмент (например с-ДНК, включающая весь ген или часть гена) расположен в позиции с соответствующей ориентацией, то в результатс получают "липкий" (fused) 50

Определено, что АТС, расположенная в нуклеотидах 57 — 59, является фактически первой АТС, аутеничной мРНК.

Кодон a Hif-2h фрагменте, соответствующий первой аминокислоте из лимфобла- 5 стоидного интерферона, представляет собой 22 кодна из первого AuG (и 14 кодонов из второго), что указывает на то, что последовательности, кодирующей интерферон, может предшествовать последователь- 10 ность, определяющая сигнальный пептид, состоящий из 23 (или, что менее вероятно, из 15) аминокислот, Более длинные из предполагаемых сигнальных последовательностей содержат непрерывне серии из 11 15 гидрофобных аминокислот (а более короткие из 6 гидрофобных аминокислот).

По-видимому, нуклеотидная последовательность, соответствующая "созревшему"

ИФН-а полипептиду, включает в себя 498 20 нуклеотидов, кодирующих 166 аминокислот, Основной состав кодирующей последовательности соответствует 50% GC.

Цепь ДНК, имеющую ту же последовательность, что и м-РНК, обозначают как 25 плюс-цепь, а ее комплемент как минус-цепь, . Hif-2h ДНК расщепляют рестиктазой Bglli, концевую группу метят P-фосфатом и ДНК

Зг переваривают Pst1, в результате получают более длинный фрагмент 545 bp,/570 bp. и 30 более короткий 340 bp радиоактивный фрагмент, Эти фрагменты денатурируют и превращают в поли(А) PHK из индуцированных лейкоцитов в 80% формамиде, 0,4 М NaCI, т,е, в условиях, в которых не происходит 35 вторичной ассоциации ДНК вЂ” ДНК (см. выше). Нуклеиновые кислоты расщепляют нуклеазой Sl, которая разрушает все одноцепочечные нуклеиновые кислоты, особенно негибридизованную P-ДНК, и про- 40 дукты разделяют на полиариламидном геле, Проводят такой же эксперимент, как описано в предыдущем разделе, но используют поли(А) PHK из неиндуцированных лейкоцитов человека, получаемых по той же 45 методике, что и индуцированые вирусом лейкоциты Sendai, По сравнению с результатами предыдущего раздела поли(А) PHK из неиндуцированных клеток содержит белок. Белок состоит из амино-концевой части Р-лактамазы и последующей аминокислотной последовательности, которая кодирует целевой белок. Для гарантии того, что Hif-4c вставлена в нужную рамку считывания для экспрессии/3-лактамазонового гена, используют набор производных pBR322, а именно рКТ279, рКТ280 и рКТ287. Каждое из этих производных имеет Рзт1, локализованный таким образом, что гетерогенная

ДНК, встроенная в этом сайте, будет находиться в правильной рамке считывания.

Pst1-изъятую вставку из Hif-2h получают также, как описано для фрагмента Hif-4c, Hif-2hPst фрагмент (10 нг) смешивают с

Pst1-расщепленным pBR322, рКТ279, рКТ280 или рКТ287 в каждом случае 10 нг в

20 микролитрах 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ MgClz, 100 MM NaCI, 6 мМP-меркаптоэтанола, 200 микрограммlмл желатины и 0,1

MM АТФ и инкубируют с 0 1 единицей Т4

ДНКлигазывтечение16чпри10 С, Результирующие молекулы рекомбинантной ДНК обозначают как Z-pBR322(Pst) (HciF-2h ZpKT279(Pst) (HclF-2h 2-pKT280(Pst) HclF-2h и

Z-pKT287 (Pst) (HclF-2h), Е.coli H 8101 трансформируют каждой из этих рекомбинантных молекул ДНК и трансформированные колонии отбирают на содержащих тетрациклин агаровых пластинах, Такие устойчивые к тетрациклину клоны трансформированных бактерий содержат рециклизованный вектор, бактериальные колонии каждого набора выращивают на миллипоровских фильтрах и колонии, гибридизованные P-меченым Hif-4c гз фрагментом идентифицируют и отбираюттак, как описано выше. Штаммы описываются следующим образом:

Е.coli НВ101 (Z-pBR322/Pst(HclF-2hAH1) до (-АНЗ);

Е,соИ HB101 (Z-pBR322(Pst)/HclF-2hAH1) до (-АНЗ);

Е.coli НВ101 (Z-pKT279(Pst)/HclF-2hAH1) до (-АН8);

Е,coli Н В101 (Z-pKT280(Pst)/HclF-2hAH1) до (-АН8);

Е,coli НВ101 (Z-pKT287) (Pst)/HclF-2hAH1) до (-AH8), Экстракты некоторых вышеприведенных штаммов, а также некоторые из штаммов 2-P BR 322/Pst/(HclF-SN1 к 95) испытывают на активность ИФН-а. Бактерии выращивают на триптоновой сзеде до стационарной фазы, собирают, промывают

1/20 объема (по отношению к объему культуры) 50 мМ трис-HCI (рН 8), 30 MMNaCI u замораживают. После оттаивания клетки снова суспендируют в укаэанном ниже объеме вышеуказанного буфера и добавляют

21

1764515

Получение

Активность ИФ Н-а (IU/ìë) (двойное onе еление

100; 300

1000; 1000

200; 200

1000; 1000

300; 100

0; 0

$30, S 100

$30, $100

S30, S 100

$30, S 100

$30, S 100

S30, S 100 лизоцим до 1 мг/мл. Через 60 мин и при 0 С суспензии замораживают (в бане этанол-сухой лед) и оттаивают (при 37 С) 5 раз и центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин на центрифуге. В некоторых случаях часть 5 надосадочного слоя далее центрифугируют при 100000g на центрифуге и выделяют надосадочные слои, Такие надосадочные слои и сп ыты вают на активность И Ф Н-а с и омощью определения снижения цитопатиче- 10 ского эффекта. Колонии, дающие положительную реакцию в примере 1, подвергают новому определению вместе с 49

Источник экстракта: Е.coli НВ 101, трансформированная с помощью;

Z-KT279(P st)/Hcl F-2h-АН8

2-KT280(P st)/Hcl F-2h-АНЗ

2-KT287(P st)/Hcl F-2h-AH 6

Z-pBR322(Pst)/HclF-SN 35

2-р ВR322(Pst)/ÍñlF-$И 42

Z- BR322 Pst /HclF-SN 32

Полученные белки обладают иммунологической или биологической активностью 15

ИФН.

Плазмиду Hif-SW35 обрабатывают

Pst1, LAC-Alu фрагмент встраивают в плазмиду, Определяют структуру модифицированной плазмиды Z-pBR322(Pst) 20 (HclF-SN35-AH16), а также аминокислотную последовательность с концевым амином для белка, получаемого в Е,coli. Нуклеотидная конструкция соответствует такой последовательности, в которой фрагмент LAC-Alu 25 присоединен к первой аминокислоте из

ИНФ-а 1(SN 35), Аминокислотная последовательность амино-концевой части полученного в Е,cali протеина подтвержадет, что получают "липкий" белок, имеющий шесть 30 аминокислот, встроенный в последовательность И Ф Н-а l(SN 35), Однако штамм, трансформированный модифицированной плазмидой, производит приблизительно в

100 раз больше полипептида, обладающего 35 биологическими и иммунологическими свойствами человеческого лейкоцитарного интерферона по сравнению с организмом хозяина, трансформированным немодифицированным Z-pBR322(Pst) (HclF-SN35), 40

Гибридную плазмиду расщепляют

BSpl. После термической инактивации (65ОС, 30 мин) фермента смесь доводят до концентрации 50 мМ трис-HCI (рН 8) и нагревают (37 С, 30 мин), После экстракции 45 фенолом и эфиром самый крупный фрагмент 1 сДН К выделяют при низкой температуре на желатинизирован ной ага розе (0,8%) и присоединяют связующие Hind III, Çàòåì клонами из серии2-рBR322(HclF-SN-1 до

SN-95.

Некоторые из приведенных наиболее активных производителей проверяют более тщательно. Культуры выращивают до поздней логарифмической фазы (наблюдаемое

0Amo равно приблизительно 0,9) и клетки лизируют в 1/50 объема культуры, Обнаруживают следующие активности с использованием в качестве отрицательного контроля

Z-pBR 322(Pst)(HcIF SN32). модифицированный фрагмент присоединяют к расщепленной Hind III плазмиде HSpBR322/EcoRI/ а acuv5-150/LAC-150/ выделением из содержащих фрагмент гелевых частиц (каждая приблизительно по 20 микролитров) при 65 С, охлаждением до

37 С и добавлением 20 ед/мл Т4 ДНК-лигазы, Через 16 ч при 15 С в отвердевшем геле происходит связывание, Одну десятую объема 100 MM трис-H CI (рН 7,5), 100 мМ Ca Clz, 100 мМ MgClz добавляют в образец, нагревают 5 мин при 65 С и охлаждают до 37 С.

Образцы затем используют для трансформации обработанной Са Е.coliHB101, инкубируют при 0 С в течение 20 мин, нагревают при 42 C в течение 1 мин и в течение 10 мин при 20 С. После добавления

1 M триптоновой среды образцы инкубируют 60 мин при 37 С и помещают на агаровые пластинки, содержащие ампициллин. Затем от этих культур отделяют плазмиду ДНК и гибридную плазмиду, содержащую ИФН-а

1 с его присоединенным по 5 -концу LACфрагментом, идентифицируют ограничительным анализом, Затем плазмиду расщепляют с помощью EcoRI и переваривают экзонуклеазой BaL-31 (0,06 ед/мл, 2—

4 мин при 30 С) для удаления выступающего

EcoRI конца фрагмента LAC и для укорачивания р-галактизидазного кодирующего сегмента.

Плазмиду расщепляют В 9ф, самый большой фрагмент отделяют на агарозном геле (0,8%). Затем этот фрагмент обьединяют с фрагментом BSpl-Вц!Д из 2-рВR322/Ры/

/НсIF-$М35 и результирующую гибридную

1764515

23 плазмиду используют для трансформации

Е.coli НВ101. Трансформированные колонии подвергают отборочным испытаниям на

ИФН-активность и выбирают один клон, имеющий высокую ИФН-активность. Этот 5 клон обозначают Е,coli НВ101(С8-ИФН-а

1), à его гибридную плазмиду С8-ИФН-а1, Анализ С8-ИФН-а1 последовательности ДНК показывает, что кодирующая последовательность, следующая за 10 инициирующим триплетом, определяется первыми семью аминокислотами Р-гадлактозидазы, остаток Pro образован слиянием аминокислот от16до 23 в сигнальной последовател ьн ости И Ф Н-а1 посл едовател ьно- 15 сти ИФН-a1 (SN 35). Миниклеточные штаммы Е.coli (DS 410), трансформированные гибридной плазмидой С8-ИФН- а1 производят приблизительно 50 миллионов единиц ИФН на литр, или приблизительно в 2500 раз больше полипептида, обладающего иммунологической или биологической активностью ЧеИФН по сравнению с миниклетками, трансформированными немо25 ИФН-а активность Hif-35 экстрактов элюируют перед цитохромом с величиной кд 0,45.

Следовательно, кажущийся молекулярный вес вещества составляет от 20000 до 30000, в фракциях контрольного экстракта Hif-32

30 активности не было обнаружено.

ЧеИФН-а (специфическая активность

1,2х10 lu/ìr) и Hif-35-Hif-287-6 S100 эксе тракты инкубируют с различными разбав35 ленными растворами антисыворотки овцы против ЧеИФН-а (специфическая активность 450000 единиц/мл) в 100 микролитрах модифицированной среды Eagles (МСЕ) с

107 сыворотки теленка в течение 30 мин

40 при 37 С и 45 микролитов анализируют на

ИФН-активность путем редукционного анализа цитопатического действия, Следовательно, ИФН-а экстрактов чувствителен к трипсину и, следовательно, к протеину, Hif-35 S100 экстракт (50 единиц) 0 30

0,1 20

1 20

10 2

50 0

Экстракт Hif-35 (1мл) и экстракт S100

Е.coli НВ101 (Z-pBR322(Pst) (HclF-SN32) ("Hif-32 экстракты" ) хроматографируют на

32 мл колонке Сефадекс G- 100 при 4 С в 50 миллимолях К-фосфатного буфера (рН 7,4), Скорость потока составляет 2 мл/ч и отбирают фракции объемом 1,0 мл, Определяют поглощение при 280 нанометров, 405 нанометров (цитохром с) и ИФН-а активность. дифицированным Z-pBR322(Pst)(Hif SN 35).

Аминокислотная последовательность полипептида, полученного с помощью плазмиды C8-NcDH a1 подтверждает, что продукт представляет собой "липкий" белок, имеющий семь аминокислот из Р-галактозидазы, одну кислоту, образовавшуюся в результате слияния аминокислоты 16 — 23 из сигнальной последовател ь ности И Ф Н-а1-входя щей в ИФН-а1.

Пример 9. 50 микролитров образцов аутеничных ЧеИФН-а(специфическая активность 1,2х10 U (мг, 50U), экстракты S100, описанных выше Е,coli Н В101 (ZpKT287(Pst)/HclF-2h АНС("Hif-287-6-экстракты") (2000/мл, 10U) и Е.coli Н В 101 (Z-p В В322(Рз1)/Hcl F-SN 35) (" Hif-35 экстракты") (1000U/мл, 50U) инкубируют с различным количеством трипсина, как показано ниже, в течение 30 мин при 37 С, Так как экстракты S100 имеют высокое содержание протеина, а ЧеИФН-анет, то смесь ЧеИФНа и контрольный экстракт S100Hif-32 испытывают параллельно:

25

1764515

Антитела, направленные против ЧеИФН-й, специфически ингибируют ИФНактивность полипептидов, полученных в

E.coli трансформацией с некоторыми рекомбинантными молекулами ДНК, содержащими HclF-2h ДНК последовательность.

Пониженное воздействие антитела на

ИФН-а, полученное в Е,cali, может отражать структурные различия между последним и натуральным ЧеИФН-а, например, Эти результаты показывают, что Hif-35 и Hif-287-6 экстракты проявляют защитное действие на клетках человек и на клетках мыши проявляется слабый эффект (10 o) как это типично для интерферона человека.

Экстракты Е,coli НВ101 (ZpBR322(Pst)/Hif-SN 3-АН 6 сравнивают с аутентичным ИФН по его действию на некоторые функции клетки. ИФН-а, полученный из Е.coli, проявляет следующие свойства натурального ИФН-а:(1) он увеличивает активность уничтожения лимфоцитов человека, (2) он усиливает цитотоксичность зависимой от антиела промежуточной клетки, (3) он подавляет ингибирование антиген и митоген-наведенной миграции лейкоцитов, и (4) он проявляет

-возрастание ИФН-чувствительности клеток, Эти свойства индуцированы активноотсутствие углеводородного фрагмента, присутствие сигнальной последовательности, или слияние с частью P-лактамазной последовательности.

5 Клетки человека CCL23 или клетки мыши

1 929 обрабатывают экстрактами Е.coii ЧеИФН-а (специфическая активность 1,2х10 единиц/мг) или ИФ мыши, инфицируют вирусом и ИФН-а активность определяют путем

10 анализа цитопатического эффекта, стью ИФН-als синтезированным Е.coli против опухолей и рака человека.

Пример 10. ИФН-а без амино-концевых последовательностей получают в Е,coli

15 и подтверждают, что он проявляет активность в соответствии с активностью ИФН.

Для того, чтобы получить соответствующую рекомбинантную молекулу ДНК, плазмиду Hif-2h гидролизуют EcoRI u BamHI u

20 фрагмент, содержащий ИФН-do. кодирующую последовательность, отделяют на агарозном геле и сливают с последовательностью, кодирующей — не-ИФН- а 1EcoRI/BamHI фрагмент плазмиды Hif-SN

25 35, в которой отсутствует Pst1 сайт, примыкающий к 3 концу гибридной вставки по сравнению с Hif-2h. Полученную плазмиду обрабатывают рестриктазой Pstl/Bgll амина-концевого фрагмента ИФН- а1 кодирую30 щей последовательности, На ere место встраивают ряд ИФН- а1 фрагментов, пол1764515

20

55 ученных гидролизом плазмиды Hif-2h с Pvu

11, обработкой Ва1 экзонуклеазы, присоединением Pst 1 линкеров с последующей обработкой Bgl II, Полученные таким образом плазмиды содержат последовательности, кодирующие И Ф Н-а, в которых отсутствуют различные части их аминоконцевых последовательностей. Плазмиду 2Н-М8 гидролизуют Pstl и определяют ее нуклеотидную последовательность, Плазмида 2НМ8 содержит несколько нуклеотидов между

Pst сайтом и первым кодоном ИФН-а I, Плазмиду 2Н-М8, гидролизованную Pstl, обрабатывают полинуклеатидкиназой/dATP, Sl экзонуклеазой и Sal 1, Эти фрагменты помещают под контроль LAC присоединением их к LAC фрагменту, полученному из плазмиды Lac 3 Р8 обработкой

EcoRI эндонуклеазой S1 и Sal1, Кодирующие посл едовател ьн ости И Ф Н- а1 полученных таким образом ряда плазмид, испытывают недостаток различных частей на амина-конце, соединенных в направлении против часовой стрелки путем AUG c фрагментом, содержащим LAC промотор, В клетках Е.coli (DS 410) обе этих плазмиды экспрессируют полипептиды, которые проявляют И Ф Н-активность.

Проверяют клоны, которые проявляют слабую гибридизацию к фрагменту Hif-4ñ и идентифицируют клон Е,aoli НВ101 (Zр В 8322(Рзт)/Н c! F-11-206).

Гибридная плазмида Z-pBR322(Pst)

HclF-11-206 ("HCIF-11-206") из клона и его вставка "Hif-11-206" слабо гибридизуется к

Hif-4c и Hif=2h фрагменту, Трансформация клеток Е.coli плазмидой Н Н!-206 обеспечивает получение полипептидов, проявляющих биологическую или иммунологическую активность Ч е И Ф Н-а.

Нрклеотидную последовательность Hif11-20 фрагмента (Pstl) фрагмент плазмиды

ДНК размером 790 вр, выделенной из культуры HclF-Y) определяют с помощью общеизвестных методов, Гидролизованную ДНК (обычно 10 микрограмм) метят по 5". Меченые фрагменты разделяют вторым рестрикционным ферментбм, продукты отделяют электрофорезом через 5% полиакриламидный гель в трис-борат-ЭДТУК буфере, экстрагируют из геля и очищают, Получают следующие различные фрагменты:

25 и 26 — расщепление Hif-11-206 с помощью Pvu II, мечение, расщепление с помощью Bg Н I, выделение Pstl*-Bgl5 фрагмента (257 вр) ("25") и Pstl*Bgill фрагмента (279 ap) ("26").

21, 22 и 23 — расщепление Hif-11-206 с помощью Pvull, мечение, расщепление с помощью Bglll, выделение Pvull*-Bglll фрагмента, (88 вр) ("21") Pvull*-Bglll фрагмента (176 вр) ("22") и Pstl*Bg ill фрагмента (214 вр) ("23").

11, 12, 13 и 14 — расщепление Hif-11-206 с помощью В9Ш, мечение, расщепление с помощью Pstl, выделение Bgill*-Psti фрагмента (279 вр) ("14") и комигрейтная смесь

Bglll-Pstl фрагмента и Bglll*-Bglll* фрагмента. Расщепление смеси с помощью Pvu

II и выделение Bg ill*-Psti ôðàãìåíòà (257 вр) ("13"), Bglll*-Pvu II фрагмента (176 вр) ("12") и Bg ill*-Pvull фрагмента (88 вр) ("11").

27L, 27LI, 41, 43, 44 и 45 — расщепление

Hif-11-206 с помощью Hinfl, мечение исходных фрагментов: Hinfl*-Hinfl* (113 вр) ("27"), Hinfl*-Hinfl* (146 ep) ("28"): Hinfl*-Hinfl* (159 вр) ("ЗОР"), Hinfl*-Hinl* (379 вр)("31 Р") и

Hinfl*-Hinfl* (1522 вр)("32Р"), Расщепление

28Р с помощью Мво11 и выделение фрагмента Hinfl* Мво11 (112 вр) ("41"). Расщепление 30Р с помощью Мво11 и выделение фрагмента Hinfl*-Maoll(125 вр) ("43"). Расщепление 31Р с помощью Рзт!и выделение фрагмента Hinfl*-Pstl, (151 вр) ("44"). Расщепление 32Р с помощью Pstl и выделение фрагмента Hinfl*-Pstl (139 вр) ("45"). Разделение тяжа 27Р с получением двух тяжей ("27U" "27L").

Из сравнения аминокислотной последовательности вставок видно, что Hlf-11-206 фрагмент кодирует интерферонподобный протеин, имеющий на одну аминокислоту меньше, чем фрагмент Hif-2h(аминокислота

44 (ASp), присутствующая в Hif-2h, не содержится в Hif-11-206). Кроме того, различны

10% нуклеотидных последовательностей и

17% остатков производных аминокислот двух фрагментов. Сравнение 35 aMv но-концевых аминокислот с лимфобластоидным интерфероном показывает, что вставка Hif11-206 кодирует протеин, который отличается 5 остатками. Следовательно, должны существовать по крайней мере три различных ИФН гена лейкоцитного типа (альфа типа)-Hif-2h фрагмент.

Клетки Е.coli НВ101, содержащие гибридную плазмиду, выращивают в реде триптона при встряхивании до ОДжо 1 — 2 раза, Клетки собирают, взвешивают, вновь суспендируют в отношении 1/100 или 1/20 от первоначального объема культуры и лизируют. Надосадочные жидкости S-30 испытывают редукционным анализом CPE e микротитровочных пластинках. Экстракты из контрольных клеток были отрицательны

1764515

30 (< 1 I,U./ìë). Клетки СС1 23 человека и клетки бычьей эмбрионной почки (БЭП) (FLOW) выращивают в МЕМ-10 плодной сыворотки теленка. Клетки инфицируют соответствующим разбавленным раствором вируса 5

Менго через 24 ч. Количество белка оценивают визуально относительно частично очищенного лейкоцита ИФН (препарат PIF) известного титра, Этот препарат был в три раза активнее на клетках человека по срав- 10 нению с клетками быка, Следовательно, И Ф Н- а1 примерно в 30 раз менее активна на клетках человека, чем

ИФН-а2, Они оба проявляют одинаковую активность на бычьих клетках. Таким обра- 15 зом, ИФН могут быть, в дополнение к их использованию в качестве антивирусных и антиопухолевых или антираковых агентов в человеке использованы в лечении этих заболеваний у крупного рогатого скота, На- 20 пример, препараты ЧеИФН-а применяют в лечении FMDV и других хорошо известных вирусных инфекций крупного рогатого скота. Это даже более приемлемо для ИФН-а

1, так как его активность на клетках быка 25 примерно в 20 раз больше, чем активность на клетках человека.

Улучшенный выходдостигается вслучае

ИФН- а1 с конструкцией С8 (указано выше), такую же конструкцию получают и для ИФ Н-а 30

2, 2-рВВ322(Рэт)/Hif-11-206 расщепляют полностью с помощью Bspl и частично с помощью Pvuli и фрагмент 867 вр выделяют из

6% полиариламидного геля. Этот фрагмент затем лигируют до 2590 вр Pvulf фрагмента 35

С8-ИФН-a1*. Полученной гибридной плазмидой трансформируют Е,coli НВ101 и клоны отсеивают на ИФН активность, Один крон, проявляющий высокую активность, отбирают и вводят в Е,coli НВ(С8-ИФН- а2). 40

ДНК-последовательность гибридной плазмиды С8-И Ф Н-й 2 о бра баты ва ют таким образом, чтобы она подобно С8-ИФН-а 1 имена кодирующую последовательность после инициаторного триплета, которая on- 45 ределялась сначала семью аминокислотами

Р-галактозидазы, остатком Pro и 16 — 23

ИФН-а 2 сигнальной последовательности.

Клетки, трансформированные с этой плазмидой, дают 100 — 200 миллионов единиц на литр ИФН и выход ИcDH-а2 был в 20000—

40000 раз выше, чем при использовании клеток, трансформированных в немодифицированным Z-pBR322 (Pst)/Hif-11- 206, Сравнение выходов С8-ИФН-а1(50х 10 единиц/л) и С8-ИФН-а2 (100 — 200 миллионов единиц/литр) на первый взгляд является неожиданным, так как ИФН а 2 примерно в 30 раз более активен, чем ИФНа1 на клетках человека (показано выше). Однако сравнение количества 2 протеинов, полученных в результате культивирования клеток, трансформированных двумя С8 плазмидами показывает, что в С8-ИФН-а1 протеина в 5 — 6 раз больше, чем в С8-ИCDНQ2, Плазмиду, содержащую LACAlu фрагмент, получают в результате обработки известного Lac промотора с Alu? и достройкой фрагмента с EcoRI линкерами. Полученный фрагмент встраивают в BR322 при EcoRI сайте и маленький фрагмент EcoRI-EcoRI удаляют из конструкции. Полученную плазмиду обозначают 404, расщепляют с Hindlll и Pvull для вставки ИФН-2 содержащего фрагмента. Этот фрагмент ИФН-а2 получают частичным гидролизом Z-pBR322(Pst)/

HclF-11-206("206"), достройкой SauÇA фрагмента с помощью Hindlll линкера и расщеплением с Bsp1, После сшивают фрагмент

Hindlll-Pvull плазмиды 404, полученную плазмиду гидролизуют Hindlll и RcoRI, обрабатывают S1 нуклеазой для приближения

LAC промотора к ИНФ-а 2 гену и вновь лигируют. Эта конструкция идентифицирована как плазмида LAC-AU (c2) имеет ИФНа2 ДНК последовательность под контролем

LAC промотора, Кроме того, ИФН-а2 последовательность расположена сразу же после инициирующего AUG кодона этого промотора. Следовательно, по крайней мере часть

ИФН, полученного с помощью этих плазмид, будет зремым ИФН, напримео, ИФН без каких-либо аминокислот сигнальной последовательности, В миниклетках выход

ИФН-а2, полученного с плазмидой LAC-AUG (а 2) составил 5 — 10 миллионов единиц на литр.

Генетический маркер из pBR322 связывают с AUG и ИФН- а 2 геном из Hi f-11-206.

Эту конструкцию получают в результате гидролиза pBR322 с помощью Мво11, обработки S1, присоединения линкера как это сделано ранее, и повторно реклонирования фрагмента в EcoRI сайт pBR322 и удаления сайта EcoRI. Полученную плазмиду ("/3-LacAUG плазмида") соединяют с Hindlll линкер-Bspl фрагментом 206, обоработанным

S1. После расщепления с помощью EcoRI u обработки S1 и фосфатазой, выделяют плазмиду экспрессии P-Lac-AUG (а 2). Конструкции с другими генами получают подобным слиянием с помощьюPLac-AUG плазмиды для клонирования других генов или конструкций с использованием сайта Sau ÇA в плазмиде P-Lac-AUG (а 2), Эта плазмида, обозначена как о-LacAUG (а 2) при трансформации клеток реци31

1764515

32 пиента позволяет получать ИФН-а 2 без слияния с другими протеиновыми последовательностями. В клетках наблюдают выходы 50 — 100 миллионов единиц на 1 л.

Предпочтительно использование штамма 5

Е,coli DS 410.

Пример 11. Конструируют ряд гибридных молекул ИФН-а1 и ИФН-а2, обнаруживают, что эти гибридные конструкции отличаются количественно различными 10 свойствами и активностями по сравнению с каждым из родственных ИФН-а 1 или

ИФН-а 2.

Плазмиды 1, II, III и И в этих конструкциях обрабатывают рестриказами Bspi, Ча- 15 стичное расщепление ДНК проводят при пониженных количествах фермента. После тепловой инактивации (65 С, 30 мин) рестриказы, образцы доводят до 50 мМ TpucHCI (рН 8) и в случае необходимости 20 добавляют щелочную фосфатазу кишечника теленка (1 объем на мкгДНК), Спустя 30 мин при 37 С образцы экстрагируют фенолом и простым эфиром. В большинстве случаев фрагменты ДНК выделяют на низкотемпе- 25 ратурной желирующей агарозе (0,8%), Для связывания кусочки желе, содержащие фрагмент (около 20 мкл каждый), расплавляют при температуре около 65 С, охлаждают до 37 С и добавляют 20U на мкл Т4ДНК 30 лигазы. Полученную смесь выдерживают при 15 С в течение 16 ч и в отвержденном геле получают связывание, Затем добавляют одну десятую объема от 100 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 100 мМ СаСЬ, 100 мМ МоС, обра- 35 зец нагревают 5 мин при 65 С и охлаждают до 37 С, Затем образцы добавляют к обработанным Са +, клеток, инкубируют при 0 С в течение 20 мин, нагревают 1 мин при 42 С и 10 мин при 20 С, и добавляют 1 мл трип- 40 тоновой среды. После инкубирования в течение 60 мин при 37 С культуры помещают на агаровые пластинки, содержащие соответствующие антибиотики.

Гибридную молекулу I, а-1/Pvuli/ а-2 45 гибрид конструируют путем частичного расщепления С8-ИФН-а1 (С8-а1) Pvu!1, дефосфорилирования, гидролиза Pstl и выделяют

Pstl-Pvull (Рг) фрагмент размером 1346 вр, Этот фрагмент связывают с 2135 вр Pstl (а)-Pvull(Pz) фрагментом, полученным в результате расщепления С8-ИФН-а 2(Supra) (С8- а2) Pvull и обработкой Pstl.

Гибридную молекулу II а-1(Bg I) а-2 конструируют, расщепляя гибридную молекулу

JBglII После дефосфорилирования большой фрагмент ВцЩ выделяют и связывают с маленьким фрагментом С8-ИФН-а 2. После клонирования гибридную плазмиду, содержащую маленький ВсПШ фрагмент в правильной ориентации, идентифицируют рестрикционным анализом, Гибридную молекулу Щ а-2/Pvuli/ а-1 конструируют обработкой С8-ИФН-а 1 Pvull, дефосфилированием, расщеплением Aval им выделением 1686 вр Рча!1(Рг)Ана! и 3233 вр

Pvull(P<)-Aval фрагментов. Эти фрагмены связывают с 300 вр Pvull(P1)-Pvull(Pz) фрагментом HclF-11-206 и плазмиду, содержащую маленький фрагмент Pvull, идентифицируют проверкой трансформированных штаммов

Е,coli на ИФН-е активность.

Гибридную молекулу И й-2/BgllT/à -1 сконструируют в результате гидролиза С8ИФН-а1 Во!Г и Ача м выделения фрагмента 1776 вр. Этот фрагмент связывают с фрагментом 3543 вр Bglli-Aval гибридной молекулы 11I.

Выращивают культуры клеток (DS410), трансформированные различными плазмидами, и бактерии, собранные центрифугированием, промывают PBS, суспендируют в

PBS (около 1/20 от исходного объема), инкубируют в течение 60 мин при 0 С с 1 мг/мл лизоцима, 10 мМ ЭДТУК, замораживают и оттаивают четыре раза, скашивают. пропуская пять раз через шприц и расщепляют центрифугированием.

Активность клеток человека, мыши, морской свинки и быка были следующими:

1764515

40 имеют несколько фрагментов EcoRI u

Hindlll oáùèõ, Гибридизирующая часть chr-I и одна из гибридизирующих частей chr-10 такие же, как фрагменты Hind III-Hindlll u

EcoRI-EcoRI, которые гибридизуются с Hif45

2h зондом и имеют одинаковую длину(3,2 кв и 0,95 кв, соответственно). Гибридизующаяся часть chr-16 идентична гибридизующейся части chr-35, хотя ориентирована в противоположном направлении, поскольку каждый из двух клонов содержит фрагмент 1,4 BglllBgllI размером 1,4 и 2 EcoRI-EcoRI, 2 кв, которые гибридизуются с Hif-2h сДНК зондом, Следовательно, вставки chr-16 и chr-35 перекрываются, Геном индивидуального человека содержит не менее чем 10 различных ДНК последовательностей, которые перекрестно гибридизуются с Hif-4h, Этот вывод подкрепляется тем фактом, что соотношение

Сказалось, что все интерфероны имеют приблизительнс одинаковую активность по отношению к бычьим клеткам, но ИФН-а1 и дв гибридных ИФН а (I и I!), у которых есть два конечных аминофрагмента ИФН- а1, 5 обладают от около 10 — до 1000-кратно мен ьшей активностью по отношению к человеческим клеткам, нежели ИФН-а 2 и два гибридных ИФН а (III и IV), содержащих концевые аминофрагменты ИФН-а 22, Два 10 гибридных ИФН (I и Il) с концевыми аминочастями ИФН-а 1 обладают более низкой активностью по отношению к человеческим клеткам, нежели у самого ИФН-а1, Один из гибридов (III) с концевыми аминочастями 15

ИФН-а 2 обладает приблизительно такой же активностью по отношению к клеткам человека, что и сам ИФН-а2, Пример 12, Получают коллекцию гибридных фагов, полученных из фрагментов хромосомных ДНК зародыша человека, частичным гидролизом Haelll и Alul, присоединением EcoRI связующих к А Харон 4А ветвям. Этот генный банк скринируют по способу "in situ", используя в качестве зонда вставку меченного P ИФН-а 1 сДНК, вырезанную из pBR322/Pst/Hif 2h. Шестнадцать положительно гибридизованных фаговых клонов выделяют из 240000 бляшек повторной очисткой бляшек, Десять гибрид- 30 ных фагов препаратов ДНК расщепляют

HindlII, Tacl, Hhal, Baml, Е,coRI и Bglg, полученные фрагменты выделяют электрофорезом на агарозном геле, переносят на мембраны Миллипор и гибридизуют с меченной P Hif-2h с ДНК вставкой, зг

Клоны chr-3 и chr-26 представляют собой сегменты ДНК, которые перекрываются по большей части своей длины, так как они фрагментов Hif-2h гидролизирующихся, определенных в клоновом банке, составляет около 1 на 16000, Так как ИФН-а1 и ИФНа-2 сДНК имеют

1 и 2Bglll сайты, соответственно, внутри их кодирующих последовательностей, повидимому Hif-chr 35 является копией одного из двух ранее клонированных интерфероновых генов. Hif-chr 35 сильно гибридизующийся 3 Hif-2h сДН К фрагмент(содержащий только 3 некодирующую область) при сравнении с более слабой гибридизацией с другой хромосомной ДНК этого зонда подтвержает близкое соответствие Hif-chr

35 и Hif-2h.

Для дальнейшего анализа Hif-chr 35

Hindlll-BamHI выделяют из chr-35. Этот фрагмент (3,4 кв) содержит гибридизующую часть ("Kif-chr 35") chr-35. Данный фоагмент субклонируют в Pstl ñàéò pBR322, используя известную dC-dG-методику, и Е.coli НВ101 трансформируют полученной рекомбинантной молекулой ДНК.

Клоны этих трансформантов скриниру32 ют in situ гибридизацией колонии с меченым

P Hif 2h фрагментом и затем плазмиду

ДН К 2-р В Р322(Рз1)/Hchrug-35H B" HchrИФ-35НВ" выделяют из положительных клонов, Ориентацию гибридной вставки

"Hchr ИФ-35НВ фрагмента" в плазмиде по отношению кP-лактамазному гену рВ R322 определяют по EcoRI расщеплению и размерам полученных фрагментов, Вставку; ориентированную в правильной рамке считывания с ф-лактамаэой, обозначают а, а противоположно ориентированную Р, Культуры этих положительных клонов выращивают до кажущегося ОДыо = 0,8, бактерии собирают и лизируют по способу лизоцим-замерзание-оттаивание. Семь из

10 исследованных клонов демонстрируют

ИФН-а активность порядка 75 — 500 единиц/г клеток (цитопатичный эффект восстановительного анализа).

ДНК вставку одного из этих семи ИФНпродуцирующих клонов Е.coll НВ101 (Z BR322 (Pst) Hchr ИФ-35НВ ахарактеризуют далее рестрикционным анализом и определением нуклеотидной последовательности.

Плазмиду ДНК(Нспг ИФ-35НВ) получают из клона и определяют рестрикционные сайты, Hchr ИФ-35НВ а обрабатывают EcoRI, метят по концу 5 и гидролизуют ВоЩ и Pstl для отщепления ненужного фрагмента около 1 кв, 1,04 кв Ecorl BgllJ (3 проксимальный) и

0,96 кв EcoRI-Bgllj (5 -проксимальный) фрагменты выделяют электрофорезом на агарозном геле, Оба фрагмента ча =тично гидролизуют Hinfl, Bspl u Meoll соответст35

36 венно и полученные продукты выделяют на

1% агарозном геле в Трис-ацетатном буфере (рН 7,8),содержащем 1 мкгlмл этидиумбромида. После выстаивания радиоактивные полосы обнаруживают авторадиографиче- 5 ски, Аналогичным образом определяют

BstNI u HgiAI ñàéòû на 1,04 в 3 проксимальном фрагменте.

Для определения нуклеотидной последовательности Нchr ИФ-35ГВ а расщепля- 10 ют различными растриктазами, полученные продукты выделяют электрофорезом через

5% полиакриламидный гель в Трис-боратном-ЭДТУК буфере и экстрагируют из геля и очищают. 15

Определяют последовательность нуклеотидов следующим образом; 1 и 2 — отщепление lchr -ИФ-35НВ а с помощью Bglo, внесение метки, расщепление EcoRI u Pstl и выделение В9(П*-EcoRI фрагмента(940 вр) 20 ("1") и Bglllx*-EcoRI(360 вр)("2"); 3 и 4 отщепление Hchr ИФ-35НВ а с помощью EcoRI, внесение метки, расщепление Bspl и выделение фрагмента EcoRI*-Bspl (680вр) ("3") и фрагмента EcoRI-Bspl (880 вр) ("4"); 5, 6, 7 и 25

8 отщепление Hchr ИФ-35НВ а с помощью

Pvull, внесение метки, расщепление Bglll u

EcoRI и выделение Pvull*-EcoRI фрагмента (780 вр) ("5"), фрагмента P v ul l*-B gill (215вр) ("6"), фрагмента Pvull*-Bgll7 (90 вр) ("7") и 30 фрагмента Pvull - EcoRI (290 вр) ("8");

9 и 10 отщепление Hchr ИФ-35 HB а с помощью EcoRI, выделение электрофорезом на 1% агарозном геле в трис-боратном

ЭДТУК буфере фрагмента с 1300 вр EcoRiEcoRI, дальнейшее расщепление Hinfl и выделение Hinfl-Hinfl фрагмента (459 вр), и фрагмента Hinfl-Hinfl (180 вр), внесение метки большего Hinfl-Hinfl фрагмента и расщепление Mboll позволило выделить Hinfl*Mbof (190 ap) ("9"). Внесение метки более короткого Hinfl-Hinfl фрагмента и расщепление Avail позволило выделить Нinfl*Avail фрагмента (150 вр), 45

11 — отщепление Hchr ИФ-35НВ а с помощью Mboll, внесение метки расщепление В9!П и выделение Mboll*-BglQ фрагмента (465 вр) ("11");

12, 13 и 14 отщепление Hchr ВФ-35НВ а с помощью Bspl м Bglll, выделение электро- 50 форезом на агарозном геле как описано ранее фрагмента 1200 вр Bspl-Bspll(a) расщепление HgiAI, внесение метки, расщепление Mboll и выделение HgiAI*-Mboli фрагмента (300 вр) ("12") и фрагмента HgiAI- 55

МЬо!!! (360 вр) ("13"), или (b) расщепление

BstNI, внесение метки, расщепление EcoRI и выделение BstNI*-EcoRI фрагмента (380 вр) ("14"), Последовательности в различных фрагментах определяют по способу Максам-Гильберта, Сравнение последовательности нуклеотидов кодирующей области Hchr ИФ-36НВ а и последовательности kif-2h (кодирующая область) показывает, что они идентичны, В частности, удивительно, что нет указания на наличие интронов внутри кодирующей последовательности Hchr ИФ35НВ афрагмента, т,е. между Hinfl центром в 5 некодирующей области и EcoRI центров в 3 некодирующей области.

Содержащие гены chr-3 и chr-26, которые, по-видимому, идентичны по данным гетеродуплексного анализа, отличают одним

BglD сайтом, исследуют на нуклеотидную последовательность. Пять нуклеотидов отличаются в 725 основных парах. По-видимому Hif-chr3 и Hif-chr 26 являются аллельными формами одного и того we гена, так как не только гены, но, по крайней мере

3 5 квр предшествующие и 6,0 квр последующие им образуют прекрасный гетеродуплекс из-за относительно небольшого отличия, которое охвтывает только изменения 2 аминокислот. Они обозначены ИФНа4а(НГ-chr 3 и ИФН- а4Ь/Hifchr 26). Нуклеотидную последовательность и соответствующую последовательность аминокис- лот

ИФН-а4в определяют по обычной методике.

При этом белки, закодированные каждой из последовательностей, отличаются друг от друга примерно в 15% их остатков.

Такое расхождение типично для продуктов неаллельных генов, которые разошлись уже

20 — 90 миллионов лет назад, Пример 13. Плазмиду Z-pBR322 (Pst) (Hchr ГИФ-35НВ а) используют в качестве источника Hif-chr 35 фрагмента для экспрессии в клетках мыши, Эту плазмиду гидролизуют Pstl и обрабатывают 5 экзонуклеазой для удаления 5 dG хвостов. Затем эот фрагмент встраивают в 5dG -Kpnl фрагмента плазмиды, полученной присоединением

Bam Hl-Bam Hl фрагментов pBR322 и ДНК полинома. Полученный вектор используют для трансформации мышинных ЭТЗ клеток, Эти трансформированные клетки обозначают мышь 3Т3 (полинома Hif chr 35), Спустя

20 — 40 ч определяют активность ИФН-G порядка 300 ед/мл ИФН-а на клетки человека и около 300 ед/мл на бычьи клетки.

Лизаты Е.со!! НВ101 инфицируют десятью гибридными лямбда-фагами и анализируют на присутствие ИФН. Семь из одиннадцати фагов (ace, кроме chr-10, chr12, chr-19 и chr-27) дают лизаты, содержащие ИФН с активностью в интервале от 3 до

1764515

ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGСАЛСТСАА

GCTGCTCTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACËGGAGGAC

CTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCÒGATGGAC

AGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTÑCAGAAGG

CTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACÑÒÑÒTTAC

CACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATТСТССАСС

GAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGG

TGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTT

CCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGССТСССАС

GTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCÀ GAËË

GATTAAGGAGGAAGGAA, TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGA 1 AhCAGG

ЛССЛССТТСАТССТССТСССЛСАЛЛТСАССЛСЛАТСТСТССТТССТГСТЫТСТСА

TGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAAССЛОТТССА

GAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCÒ СЛЛССТС

TTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGAСААА1TCT

ССЛСССЛЛСТСТЛ,CAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGСАССЛССЛ

GAGGGTCGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACТССЛТСТТСССТСТСЛЛСЛЛЛ

ТЛСТТСССЛЛСЛЛТСЛСТСТСТЛТСТ6ЛСЛСЛСЛЛСЛЛАТЛСЛССССТТСТСССТ

GGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCA

AGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA, TTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCA

AGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGÒËGÑAG

GAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCТССТССТТС

AAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAСТТССЛЛЛ

50 ед/мл, В случае chr-10 и chr-12, гибридизующие (к HIf-2h) Hindlli-Hindlll или EcoRIEcoRI фрагменты субклонируют в Pstl сайт

pBR322 и экспрессируют активности ИФНа в Е.coli, Формула изобретения

Способ получения лейкоцитарного интерферона, предусматривающий культивирование биологических культур, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, в качестве биологических культур используют штамм мик5 роорганизма Escherichia coli АТСС 31633 или 31634, трансформированный рекомбинантными плазмидными ДНК со вставкой

2-p B R322(P stl) Hc I F-11-206, ил и ZpBR322(Pstl)/HclN SN 35-АН1 6 с нуклеотид10 ной последовательностью

1764515

AGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTT

CAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTAC

ACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATQACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGG

GGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGËÑÑËËËÒÀ сттсслллсллтслстстстлтстслллслсллслллтлслссссттстссстсс

GAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAG лллстттллаллстллсалл, TGTGATcTGccTcAAAcccAcAGccTGGGTAGc

АССЛССЛССТТСЛТССТССТСССЛСЛСЛТСЛССЛСЛАТСТСТСТТТТСТССТССТ

TGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCÀÑÒÒCCA

AAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTÒCAATCTC

TTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCT

ACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATЛCAGGGGGT

GGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTÑËÑÑAAA

TACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCÒÒGÒGCCT

GGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCA лслллстттллсллстлласлл, ATGGcccTGTccTTTTcTTTAcTGATGGccG

TGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCACAC

CCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATC тстслтттстсстссстсллсслслслслтслтттссслттссссслсслсслст

TTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATÑAQATGAT. сслсслслссттсллтстсттслсслслслсслстслтстсстссттсссмслс лссстсстлслллллттттсслстсллстттлсслссллстсллтслсстаагас слтстстслтлслсслсаттсссстссллалслстсссстслтслл7с1сслстс слтсстссстстслсслллтлсттсслллсллтслстстттлтстллслслсллс лллтлсласссттстссстссслссттстслслсслслллтслтслслтссстст

ССТТТТСЛАСЛААСТТССЛЛААЛАСЛТТЛЛССЛССЛАССЛТ, або TGTGATCT

GCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTGATACTCCтсСллслЛАТс асллсллтстстслтттстсстссстсллсслслслслтслтттссслттссссс лс с л с с л с т т т с л т с с с сл с сл с т т с с л с лл с л с т с лл с с с л т с т с т с т с с т с с А тслслтслтсслсслслссттсллтстсттслсслслслсслстслтстсстсст тсссллслсласстсстлслллллттттсслстсллстттлсслссллстсллтс лсстссллсслтстстслтлслсслссттсссатасллслслстсссстслтслл

TGTGQACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCтттлтстл лслалсллслллтлслссссттстссстссслссттстслслсслслллтс тсл

GATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGСАТ;

1764515

Составитель Н,Кузенкова

Техред М,Моргентал Корректор Е.Папп

Редактор Т,Иванова

Заказ 3466 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 или последовательностью, которая гибридизуется со встравкой или указанной последовательностью при следующих условиях гибридизации; предгибридизация нитроцеллюлозного фильтра, несущего ДНК-последовательность или ДНК вставку в четырехкратном буфере с 0,1% (мас./об) фикола, 0,1% полинилпирролидона, 0,1% (мас.об.) бычьего сывороточного альбумина, 0,5% натрий додецилсульфата с 200 мкг/мл денатурированной фрагментированной

ДНК спермы лосося при 68 С втечение 7ч, а гибридизация с меченой ДНК-вставкой и

ДНК-последовательностью в четырехкратном буфере фиколла (мас,/об), 0,02% поливинилпирролирона, 0,02% (мас./об) бычьего сывороточного альбумина, 0,5% натрий додецилсульфата, 200 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, при 68 С в течение 16 ч, ополаскивание фильтра при комнатной температуре 0,53 SDS, отмывка при 68 С 2х0,53 S DS с однократной заменой раствора и 3 мл основания Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч.