Штамм бактерий alcaligenes paradoxus - продуцент катехол-1, 2-оксигеназы

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой Новый штамм бактерий Alcaligenes paradoxus ВКПМ В-3978 - продуцент катехол-1,2- оксигеназы, фермента, используемого для биокаталитического получения цис, цис-муконовой кислоты. Цель изобретения - повышение удельной активности катехол-1,2Чэксигеназы и уменьшение времени культивирования. Штамм культивируют на минеральной питательной среде, содержащей бензойную кислоту в качестве источника углерода. Время культивирования 6 ч-.- Удельная активность катехол-1,2-оксигеназы 2,7 ед/мг белка. 2 ил.

ССОЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„, 1449581 А1

gg 4 С 12 N 9/04,1/20

" " 08дЩЯ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

Н АOTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4237253/31-13 (22) 30.04.87 (46) 07,01.89. Бюл. Р 1 (71) Институт биохимии им.А.Н.Баха (72) С.-P.Ìàòåâoñÿí и А.N.Áåçáoðîäîâ (53) 577,15 (088.8) (56) Ко1ima J., Fujisawa Н., Nakasawa А. atal. I.Biol. - 1967, 242, 14, 3270-3278.

Nakazawa Т., Nakazawa А. Methods

in Fnsymology, 1970, V.17а, р.518. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES

PARAD0XUS - ПРОДУЦЕНТ КАТЕХОЛ-1«2ОКСИГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новы1Г штамм бактерий Alcaligenes paradoxus

ВКПМ В-3978 - продуцент катехол-1,2оксигеназы, фермента, используемого для биокаталитического получения цис, цис-муконовой кислоты. Цель изобретения - повышение удельной активности катехол-1,2-оксигеназы и уменьшение времени культивирования.

Штамм культивируют на минеральной питательной среде, содержащей бензойную кислоту в качестве источника углерода. Время культивирования 6 чт

Удельная активность катехол-1,2-оксигеназы 2,7 ед/мг белка. 2 ил.

1 1449581 2

Изобретение относится к биотехноло1ии и представляет собой новый штамм Alcaligenes paradoxus В-3978, являющийся продуцентом активной ка5 те1сол-1, 2-оксигенаэы (К,Ф. 1,12, 11, 1), которая может быть использована для бибкаталитического получения цис„ ци с-муконовой кислоты.

Цель изобретения — выявление штам- 10 ма„ обладающего более высокой удельно активностью катехол-1,2-оксиге- на ы и уменьшение времени культивиро ания.

Штамм Alcaligenes paradoxus В-3978 вь еляют методом накопительной культ ы из почвенных образцов, получен методом длительной адаптации к росту на ароматических углеводородах (бенэайная кислбта, пирокатехин) в качестве единственных источников углерод и энергии.

Штамм А1са1х8епез paradoxus В-3978 ж еет следующие характеристики.

Культурально-морфологические приз- 25 и ки. Клетки — одиночные или соедин нные по две кокковидные палочки.

П движные. Движутся при помощи перйтрихальных жгутиков. Грамотрицатвльные. Эндоспор не образуют. П".-и 30 роосте на NTIA образует отдельной, кр1 глой д>ормы колонии, к центру чуть приподнятые со срезанной верхушкой„

На третьи сутки роста в диаметре к лонии достигают 5-6 мм. С возраст35 т м колония растекается по arapy.

П верхность матовая, консистенция м аяся пастообразная. Непрозрач ная, окрашена в кремовый цвет. Край колоний слабо волнистый, внутренняя 40 с1руктура гомогенная. В агар при росте не врастают. На синтетической агаризованной среде с бензоатом рост и форма колоний. аналогичны росту на

NItA. На МПБ образует тонкую пленку со слабой мутью и хлопьевидным белым оСадком, °

Физиолого-биохимические свойства, Аэроб. Оптимальная температура роста

25-30 С, максимальная 37 С, оптимальная рН 6,0-7,5.

Оксидазоположителен. Каталазоположителен. Целлюлозу не расщепляет.

Уреазная активность отсутствует.

Крахмал гидролизует. Желатину не разжйжает, молоко не пептонизирует. Не55 органический азот усваивает в аммонвйной форме. В азробных и анаэробнЫх условиях нитраты и нитриты не редуцирует. Сероводород, меркаптаны и индол не образует. Слабо аммонифицирует пептон. Без кислотообразования усваивает сахарозу, рамнозу, лактоэу, ксилозу, галактозу, арабинозу. Подкисляет среду при росте на среде

Хью и Лейфсона с глюкозой. Усваивает маннит, инозит, дульцит, сорбит. В качестве единственного источника углерода использует цитрат (без ростового фактора).

Штамм чувствителен к стрептомицину и тетрациклину и высокочувствителен к мономицину. Непатогенен, Пример 1. Штамм Аl.paradoxus

B-3978 культивируют в срвде, содержащей, г/л: КН.2РО4 3,4, К НРО4 4,3, (ИН ) 804. 2, NgC1 О, 343, СаС1 О, 026, МпС1 z О, 0015, FeSO< О, 008, Ха МоО

0,002, бензойная кислота 1,2, рН среды 6,5. Стерилизация — 0,05 атм

40 мин.

Посевной материал вносят в объеме 10 мл с содержанием 0,6 мг/мл сухой биомассы в колбы объемом 750 мл со 150 мл ростовой среды. Ферментацию проводят при 29 С на круговой качалке с 220 об/мин.

На фиг.1 и 2 представлены динамика накопления биомассы, скорость по-, требления субстрата, а также изменение активности катехол-1,2«оксигеназы в процессе роста культуры Alcaligenes paradoxus В-3978, Установлено, что наибольшая активность катехол-1,2-оксигеназы в расчете на мг сухой биомассы культуры наблюдается в конце логарифмической фазы роста популяции, т.е. на

6-й час культивирования.

Клетки отделяют от среды на 6-й час ферментации центрифугированием при 4500 g в течение 40 мин. Выход биомассы 3 r влажных клеток на 1 л ростовой среды. Дважды .промывают

0,05 М калийфосфатным буфером рН 7,5 и разрушают механическим способом

1 на прессе Хьюза при давлении

100 кр/см с предварительным замораживанием. Полученную биомассу центрифугируют при 20000 g 30 мин и в су- пернатанте определяют активность катехол-1,2-оксигенаэы.

Ме год определения спектрофотометрический, по увеличению поглощения при 260 нм. Реакционная cMecb в общем объеме 3,0 мл содержит 2,89 мл

0,1 М калийфосфатного буфера рН 7,5, 1449581

0,06 мл 0,01 M катехола и 0,05 мл бесклеточного экстракта, содержащего

О, 1-1 ед. активности/мл пирокатехазы. Показания прибора (СФ-46) записываются в интервалах 30 с в течение

3 мин. Единица активности пирокатехазы определяется как количество фер" мента, катализирукицее образование

1 мкМ цис, цис-муконовой кислоты в

1 мин. Молярный коэффициент экстинции цис, цис-муконата.принимают равным 16,800 при 260 нм, Удельную активность определяют как количество единиц активности, содержащихся в

1 мг белка. Содержание блока определяют по величине поглощения при 280 и 260 нм. В этих условиях удельная активность фермента 2,7 ед/мг белка.

Пример 2. Бактерии Alcali genes paradoxus культивируют аналогично примеру 1, но питательная среда имеет следующий состав, г/л: бен зоат натрия 3, дрожжевой экстракт

«0,5, К НР0 1,2, NaC1 1,6, FeSO+ О,1, МАЗО+ 0,2. Посевной материал вносят в количестве 20 мл. На 6-й час культивирования выход биомассы 3,5 r сырых клеток на 1 л ростовой среды.

Удельная активность катехол-1,2-ок10 сигеназы в бесклеточном экстракте

2,7 ед/мг белка. Таким образом, новый штамм позволяет более чем в три раза увеличить удельную активность катехол-1,2-окси15 геназы и сократить время культивирования.

Формула изобретения

2О Штам бактерий А1са1Цепез paradoxus ВКПИ В-3978 — продуцент катехол-1,2-оксигеназы.

Составитель И.Привалова

Техред Л. Сердюкова Корректор З.Пончакова

Редактор И.Горная

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ б934/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д . 4/5