Способ получения формиатдегидрогеназы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для промышленного получения формиатдегидрогеназы. Целью изобретения является повышение выхода фермента за счет снятия репрессии его биосинтеза, вызываемого металлами, входящими в материал ферментера. Культивирование метилотрофных бактерий PSEUDOMONAS SP. 101 ВКМ В-1545Д, продуцирующих формиатдегидрогеназу, осуществляют на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве единственного источника углерода и энергии, в присутствии 10<SP POS="POST">-</SP>6 - 10<SP POS="POST">-</SP>3 М вольфрамат -иона. Удельная активность достигает 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„Я0„„14795(3 д5д 1 С 12 N 9/Оч

Н АВторСком,к СвиДКткпьСтвМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

Р0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГННТ СССР (21 ) 4305717/31 — 13 (22) 15. 07. 87 (46) 15.05.89. Бюл. № 18 (71) МГУ им. M.В.Ломоносова, Институт биохимии им. А.Н.Баха и Научно-производственное объединение "Фермент" (72) И.В.Березин, В.В.Карзанов,,В.И.Тишков, Т.В.Авилова, А.М.Егоров, Р.Ê.BàéòêÿBè÷þñ, P.É.ÏeòKÿâè÷åHå и А.-С.А. Глемжа (53) 577.15 (088.8) (56) Egorov А.N., Avilova Т.V., Dickov М.М., Popov V.Î., Rodionov

Yu.V., Berezin I.V. -Eur. f. Biochem.

1979, v. 99, р. 569-576.

Авторское свидетельство СССР

¹ 543672, кл. С 1? N 9/04, 1976.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения НАД-зависимой

Формиатдегидрогеназы, и может быть использовано в процессе полученйя различных физиологически активных соединений (аминокислоты, стероиды, спирты и т. д.) с системой регенерации НАДН на основе формиатдегидрогеназы, для количественного определения муравьиной кислоты (формиат-иона) в сложных биологических смесях (сыворотка крови, культуральные среды, пищевые продукты), для создания биохимического топливного элемента, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМИАТДЕГИД—

РОГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для промышленного получения формиатдегидрогеназы.

Целью изобретения является повышение выхода фермента за счет снятия ре-. прессии его биосинтеза, вызываемого металлами, входящими в материал ферментера. Культивирование метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101

ВКМ В-1545Д, продуцирующих формиатдегидрогеназу, осуществляют на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве единственного источника углерода и энергии, в присутствии 10 - 10 М вольфраматиона. Удельная активность достигает I700 нмоль/мин на 1 мг белка. 2 табл. использующего в качестве топлива метанол или формиат, а также в научных целях.

Цель изобретения — повышение выхода формиатдегидрогеназы за счет снятия репрессии биосинтеза фермента под действием легирующих добавок покрытия ферментеров.

Способ осуществляется следующим образом.

Бактерии Pseudomonas sp. (101)

BKM В-.1545Д культивируют на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: КН РО 2,0, сульфат аммония 2, 0; хлорид натрия 0,5; суль147951 фат магния семиводный 0,025, растворимая соль вольфрамовой кислоты (калия, натрия, аммония и т. д.) как источник вольфрамата-иона 10 " — 10 М дистиллированная вода. Среду стерили5

3уют в течение 20 мин при 1 атм, рН среды после стерилизации 7, 2. Отдельно готовят 10 — ный раствор дрожжевого автоли— эата, который стерилизует в течение

?О мин при 0,5 атм и вносят в среду из расчета О,1 — 10 мл на 1 л среды.

Метанол не стерилиэуют и добавляют к среде до концентрации 1 . Посевной материал вносят в количестве 2-5 . 15

Культивирование проводят в 100 л ферментере при 28 С,расходе воздуха

О, 5: 1 в течение 45-52 ч. Удельная активность формиатдегидрогеназыв бесклеточных экстрактах составляет 1600- 20

170А нмоль/мин на 1 мг белка. Выход биомассы 250-300 г сырых клеток.

Наиболее оптимальной является концентрация вольфрамат-иона от

1Г до 10 M. В указанном диапазоне 25 концентраций удельная активность формиатдегидрогеназы практически одинакова и составляет 16001700 нмоль/мин на 1 мг белка. При повышении концентрации вольфрамат-иона щ до 10" М происходит резкое снижение скорости роста самой биомассы. При концентрации вольфрамата менее 10 M увеличения выхода фермента не наблюдается.

Исследование влияния ионов металлов на биосинтез формиатдегидрогеназы (табл. 1) показывает, что большинство из них, почти не влияя на общий выход биомассы, вызывает резкое уменьшение активности формиатдегидрогеназы.

Как было показано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, снижение активности формиатдегидрогеназы при культивировании в присутствии различных ионов металлов сопровождается уменьшением содержания самого фермента в клетках, т. е. эти ионы вызывают репрессию биосинтеза формиатдегицрогеназы. Единственным ионом, который не только не подавляет биосинтез фермента, а наоборот индуцирует увеличение содержания и уровня активности формиатдегидрогеназы в клетках, является вольфрамат5 ион. Такое влияние вольфрамат-иона на биосинте.з формиатдегидрогеназы в метилотрофных бактериях в литератур ных данных не описано. Предполагают, что вольфрамат-ион каким-TA образом влияет на процесс утилизации формиа" та клетками.

Положительное влияние вольфрамата на выход формиатдедрогеназы подтвер— жцен на примере ферментеров различной конструкции. При проведении культивирования в 100-литровых ферментерах отечественного производства, фирм "Электролюкс (Ывеция), Нордон", (Франция) и в 15-литровом ферментере фирмы "Нью Браунсвик" (США) величина удельной активности формиатдегидрогеназы составила 1000, 80, 92 и 410 нмоль/мин на 1 мг белка соответственно, При проведении культи-о вирования в присутствии 10 M вольфрамата величина удельной активности независимо от типа ферментера составила 1640-1700 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход фермента увеличился на на 70, а в случае других ферментерон выход возрос в 4-21 раз.

Изобретение имеет важное значение, поскольку позволяет проводить крупномасштабное культивирование бактерий Pseudomonas sp. (10,1) ВКМВ-1545Л для получения формиатдегидрогеназы независимо от марки и объема ферментера с. более высоким выходом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ

В-1545Л культивируют согласно известному способу в 100-литровом ферментере отечественного производства на минеральной среде следующего состава, г/л: КН РО 2,0; сульфат аммония 2,C", хлорид натрия 0,5; сульфат магния семиводный О, 025; вода дистиллированная. рН среды после стерилизации

7,2. Во время посева вносят 1 метанола и 0,2.мл 10 -ro раствора дрожжевого автолизата на 1 л среды. Посевной материал вносят в количестве

2-3%, Режим ферментации: температура

28 С, расход воздуха 1:1, избыточное давление О, 5 атм, стерилизация при

120 С в течение ? ч, паракультуру выращивают 48 ч. Удельная активность формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составляет 1000 нмоль

НЛДН/мин на 1 Mr белка.

Пример 2. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) HKM

t4795t3

Таблица

t00O

1,1

1,05

1,13

64

3

В-1545Д культивируют согласно приме— ру 1, но в ферментере фирмы "Электролюкс (Швеция). Удельная активность

1 формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составляет 80 нмоль/мин на i мг белка.

Пример 3. Метилотрофные бактерии Pseudomnnas sp. (101) ВКМ

В-1545Д культивируют согласно примеру ?, но в минеральную среду перед стерилизацией вносят различные кон— центрации вольфрамата натрия. Влияние концентраций вольфрамат-иона на выход формиатдегидрогеназы представлен в табл. 2.

Пример 4. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) BKM

В-1545Д культивируют соглас.но примеру 1, но в минеральную срецу перед стерилизацией добавляют вольфрамат калия в концентрации 10 N. Удельная

-4 активность формиатдегидрогеназы составляет 1700 нмоль/мин на мг белка °

Пример 5. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ

В-1545Д культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы "Нордон" (Франция). Удельная активность фор— миатдегидрогенаэы составляет 92

92 нмоль/мин на 1 мг белка.

Пример 6. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) BKM

В-1545Д культивируют согласно примеру 5, но в минеральную среду добав— ляют вольфрамат аммония в концентрации 10 М. Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет

1670 нмоль/мин на 1 мг белка.

Пример 7. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) BKM

Контроль /отечественный ферментер/

Контроль /ферментер фирмы "Электролюкс", Швеция/

MoO q

2MnO q

 — 1545Д культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы "Ньro

Браунсвик" (CUIA). Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет

410 нмоль/мин на t.èã белка.

Пример 8. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ

В-1545Д культивируют согласно приме10 ру 7, но в минеральную среду добавляют вольфрамат натрия в концентрации 10 М. Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет

1640 нмоль/мин на 1 мг белка, 15 Как следует из результатов экспериментов, приведенных в примерах 1-8, добавление в минеральную среду растворимой соли вольфрамовой кислоты позволяет повысить выход формиатде20 гидрогеназы и снять репрессию ее биосинтеза в любом типе ферментера.

Формула изобретения

25 Способ получения формиатдегидрогеназы, предсматривающий культивирование продуцирующих ее бактерий

Pseudomonas яр. BKM В-1545Д в аэроб1 ных условиях на синтетической пита30 тельной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метиловый спирт в качестве единственного источника энергии и углерода, отличающийся тем, что, с целью повьпиения выхода целевого продукта эа счет снятия репрессии биосинтеза формиатдегидрогеназы легирующими добавками материала ферментеров, в среду перед ее стерили40 зацией вносят растворимую соль вольфрамата в концентрации вольфраматаиона 10 -1О М.

1479513

Продолжение табл.1

0,99

0,98

1,03

0,61

0,85

1,12

Нет роста

Нет роста

1,1

1,1

1684

Т а б л и ц а 2

Концентрация, \70, M

Но—

Удельная активность формиатдегидрогенаэы в бесклеточных экстрактах, нмоль/мин на 1 мг белка мер, и/п

Составитель И.Привалова

Редактор М.Недолуженко Техред И.Ходанич

Корректор M.Màêñèìèøèíeö

Заказ 2504/25 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, 8-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

6

8

11

12

13

i4

1

3

5

7

В(он)

vo

Ni г

Со г

Zn г+

CrO

CrqO;

Ti

MOä

Контроль (пример 2)

10 8

81

Нет роста

76

64

51

84

68

76