Способ выделения формиатдегидрогеназы

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения и очистки МАД - зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2). Цель изобретения - увеличение выхода фермента по активности. Бесклеточный экстракт получают разрушением суспензии клеток. Часть примесных блоков осаждают в 40% от насыщения сульфате аммония, а супернатант подвергают дальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе, содержащем в качестве модифицирующей фенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирующего буфера. Удельная активность фермента 11-12 мкмоль/мин на 1 мг белка. Выход по активности 82-86%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (ll) А1 (51)5 С 12 N 9/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4429785/31 — 13 (22) 23.05,88 (46) 23.03.90. Бюл, Ъс 11 (71) Институт биохимии им. А.H.Áàõà, ИГУ им. Y..В.Ломоносова и Научно-производственное объединенИе "Фермент" (72) В.И.Тишков, А. Г.Галкин, А.Y..Егоров, В.А.Кадушевичюс, P.É.Ïåòкявичене, P.Ê.Âàéòêÿâè÷í c и А.-С.A. Глемжа (53) 577,15.07(088.8) (56) Egorov А.И., Avilova Т.V., Dickov M.Ì,, Popov V 0., Rodionov Yu.V.

Berezin I.V., NAD-Dependent formate

dehydrogenase from methylotrophic

bacterium, strain, — Eur. I. Biochem.

1979, v. 99, ti 3, р. 569-576.

Авторское свидетельство СССР

Ис- 1479514, кл, С 12 N 9/04, 1987.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения и очистки |сАД-зависимой формиатде- гидрогеназы (КФ 1.2.1.2), которая используется для определения микроколичеств муравьиной кислоты в сложных смесях, в процессах тонкого органического синтеза получения простых и меченых физиологически активных соединений (стероиды, кислоты, аминокислоты и т.д.), с использованием системы регенерации НАДН на основе формиатдегидрогеназы.

Цель изобретения — увеличение выхода фермента по активности, Способ осуществляют следующим образом.

2 (54) СПОСОБ ВЪ|ДЕЛЕНИЯ ФОРИ!АТДЕГИДРОГЕНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения и очистки ИАД-зависимой формиатдегидрогенаэы (КФ 1.2,1.2). Цель изобретения — увеличение выхода фермента по активности. Бесклеточный экстракт получают разрешением суспенэии клеток. Часть примесных белков осаждают в 40Х от насыщения сульфате аммония, а супернатант подвергают дальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе, содержащем в качестве модифицирующей фенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирующего буфера. Удельная активность фермента 11-12 мкмоль/мин на 1 мг белка. Выход по активности 82-867..

Бесклеточный экстракт получают разрушением суспензии клеток в ультразвуковом деэинтеграторе или пе- ретиранием со стеклянными шариками, или раврушением замороженных клеток на Х-прессе, или другим соответству- 4 ь ющим способом. Часть примесных белков осаждают. в сульфате аммония (40X от насыщения), а супернатант подвергают дальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе, йь содержащем в качестве модифицирующей фенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирунщего буфера. Удельная активность фермента составляет 11-12 мкмоль/мин/MI белка. Выход по активности 82-867 °

1551741

П р и и е р 1. 50 г сырых клеток бактерий Pseudomonas sp. 101 ВКМ

В-1545D суспендируют в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, 0,01 М ЭДТА, рН

7,8. Разруп ение проводят на дезинтеграторе УЗУН в положении максимального резонанса (частота 22 кГц, мощность 0,3 Вт) в течение 20 мин при охлаждении (ванна со льдом и солью).

Клеточную суспензию центрифугируют

60 мин при охлаждении при 15000 g.

Общая активность формиатдегидрогеназы в супернатанте составляет

6100 мкмоль/мин, удельная активность

1,1 мкмоль/мин/мг белка. К полученному бесклеточному экстракту добавляют или мелко измельченный твердый сульфат аммония, или насыщенный раствор сульфата аммония до конечной концентрации сульфата (40 . насыщения). . Через 2-12 ч раствор центрифугируют

30 мин при охлаждении при 15000 g.

Осадок отбрасывают. Суммарная активность фермента в супернатанте составляет 6050 мкмоль/мин,.удельная активность 1,67 мкмоль/мин/мг белка.

Супернатант наносят на колонку с

40 г (90 мл) фенилсилохрома С-120 с концентрацией фенильных групп

1.17 мкмоль/г носителя. Носитель отмывают от части примесных белков 15 . от насыщения раствором сульфата аммония. Формиатдегидрогеназу элюируют линейным нисходящим градиентом: 15-ОХ от насыщения раство.- м сульфата аммония, общий объем градиента 400 мл.

Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,5 мкмоль/мин /мг белка.

Выход по активности 83Х.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линейный нисходящий градиент: 15-5 . от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активности фермента

11,9 мкмоль/мин/мг белка. Рьжод по активности 84Х.

Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линейный градиент: 20-О . от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активность формиатдегидрогеназы

10,9 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 86 .

Пример 4, Способ осуществля— ют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линейный градйент: 14-O от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активность формиатдегидрогеназы

12,1 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 67 .

П р и и е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используют линей- . ный градиент: 21-O от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активности формиатдегидрогеназы

9,8 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 89Х.

15 Пример 6. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве носителя используют фенил-сефарозу

СТ;4В (Pharmacia, 1 !веция) (140 мл) .

Удельная активность формиатдегидро2р геназы 11,2 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 82Х.

Пример 7. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве носителя используют модифицирован25 ный фенил-Тойоперл с концентрацией фенильных групп 230 мкмоль/г носителя (100 мл). Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,8 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 84 ., Пример 8. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве носителя используют модифицированный Сферон 1000 с концентрацией фенильных групп 160 мкмоль/г носителя (100 мл). Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,0 мкмоль/мин/мг белка, Выход по активности 84 .

Пример 9. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве

40 источника формиатдегидрогеназы берут биомассу дрожжей Candida methylica.

Суммарная активность фермента в бесклеточном экстракте 830 мкмоль/мин, удельная активность 0,33 мкмоль/мин/мг белка. После обработки раствором сульфата аммония (40 от насыщения) суммарная активность 810 мкмоль/мин, удельная активность 0,51мкмоль/мин/мг белка. После очистки гидрофобной хроматографией на фенилсилохроме удельная активность формиатдегидрогеназы равна 7,4 мкмоль/мин/мг, выход по активности 78, Формула изобретения

Способ выделения формиатдегидрогеназы, включающий дезинтеграцию биомассы микрооргани ма-продуцента, 1551 741 6 отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода фермента по активности, на стадии гидрофобной хро5 матографии используют носители с фенильными группами в условиях нисходящего градиента сульфата аммония от

15-20 до 0-5Х.

5 оса кдение части примесных белков сульфатом аммония вЂ,40X от насыщения — с последующей очисткой целевого продукта гидрофобной хроматографией на носителе с углеводородными группами в условиях нисходящего градиента концентрации сульфата аммония

Составитель А.Семенов

Редактор Н.Рогулич Техред М.Дидык

Корректор А.Обручар

Заказ 309 Тиржк 484 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уагород, ул. Гагарина, 101