Способ определения модифицированного альбумина в крови человека

 

Использование: в области медицины, в частности в клинической биохимии. Сущность изобретения: из сыворотки крови больного осаждают глобулины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной его концентрации 0,8-1,0 М и белка 0,2-0,5 мг/мл, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм, определяют интенсивность флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитывают их соотношение. Способ прост в исполнении и позволяет повысить чувствительность определения модифицированного альбумина. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕЙНЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4840699/14 (22) 18.06.90 (46) 30.10.92. Бюл. (Ф 40 (71) 1 Ленинградский медицинский институт им. акад. И,П.Павлова (72) Т.B.Ïýðxoìåíêo, К.К.Туроверов, И.M.Êóçíåöîâà, Я.B,×óïðèíà, А.Д.Кожевни- . ков и А.И.Куликова (56) Ажицкий Г,I0. и др, Транзиторные минорные фракции сывороточного альбумина человека: физико-химические свойства. /!

Вопросы медицинской химии. — 1984, т. 30, вып. 5. с. 50-56. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА В КРОВИ

ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении модифицированного альбумина в крови человека.

Известен способ определения модифицированного альбумина, включающий изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в геле с использованием борат-полиольного градиента рН в одно- и двухмерной системе.

Альбумин выделяют препаративным электрофорезом (ЭФ) в агарозном и полиакриламидном гелях (ПААГ). Аналитическое и и реп а рати вное ИЭ Ф в борат-полиол ьной системе осуществляют в ПААГ. В качестве буферного раствора используют 0,1 М барную кислоту, оттитрованную трисом до рН

7,5. После ИЭФ гель извлекают из трубочки и окрашивают кумасси G-250. При препаративном ИЭФ из гелевого блока вырезают контрольную полоску, окрашивают ее; из блока вырезают участки геля, соответствую;

„„ Ц„„1772744 А1 (57) Использование: в области медицины, в частности в клинической биохимии. Сущность изобретения: из сыворотки крови больного осаждают глобулины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной его концентрации 0,8-1,0 М и белка

0,2-0,5 мг/мл, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм, определяют интенсивность флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитывают их соотношение. Способ прост в исполнении и позволяет повысить чувствительность определения модифицированного альбумина..1 табл. щие белковым фракциям. Гель измельчают на холоду и элюируют на воронке с бумажным фильтром. Элюат троекратно промывают в стакане для ультрафильтрации (фильтр

УАМ-50 "Владипор") дистиллированной водой, а затем 0 1 M фосфатным буфером рН

7,0, после чего фракции концентрируют. Дополнительная очистка от примеси глобулинов осуществляется методом препаративного диск-электрофореза в ПААГ. Для определения дисперсии оптического вращения и спектров кругового дихроизма используют концентрации белка в пробах 1 мг!мл. Данный способ принят за прототип;

К недостаткам способа относятся: сложность осуществления, длительность и необходимость накопления для анализа сравнительно высоких концентраций белка, что ограничивает возможность использования этого метода и значительно снижает его чувствительность.

1772744

30 хлорида натрия параметры спектров флуоресценции не зависят. от ионной силы раствора. При концентрации белка ниже5,2 45

Целью изобретения является упрощение, ускорение, а также повышение чувстви1 с . "IbносTи сГ .Особа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения модифицированного альбумина в крови человека,. включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению, из сыворотки крови асаждвют глобупины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия да конечной концентрации белка 0,2-0,5 мг/мл и конечной концентрации хлорида натрия(8-1;0 М, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм; определяют интенсивности флуоресценции при длинах волн

320 и 365 нм и рассчитывают их соотношение, Выделение альбуминов из сыворотки крови путем осаждения глобулинов сульфатом аммония не требует больших затрат времени и сложного оборудования. Применение СФЛ анализа позволяет работать с низкими концентрациями белка; для проведения исследования необходимо 0,2-0,5 мг/мп (или 0,003 мл исходной сыворотки крови), что существенно повышает чувствительность способа; В прототипе для анализа требуется 1 мл/мл. В способе на анализ крови одного больного затрачивается 2,5 ч, а в прототипе — сутки и более. Раствор хлорида натрия не влияет на спектральные характеристики альбумина, При концентрации хлорида натрия ниже 0,8 М белок после семидневного хранения выпадает в осадок, кроме того в такой среде быстро размножаются микроорганизмы; при концентрации хлорида натрия выше 1

М, ионная сила раствора сталь высока, что может привести к изменению характеристик триптофановой флуоресценции. В пределах указанных величин концентраций мгlмл вклад во флуоресценцию примесей, содержащихся в растворителе, становится сопоставимым с уровнем свечения самого белка. При концентрации белка выше 05 мг/мл существенным становится отклонение от линейной зависимости между концентрацией белка и интенсивностью флуоресценции.

Способ может быть осуществлен следующим образом, Из сыворотки крови человека осаждают глобулины. методом высаливания в присутствии 33 $ сульфата амония при постоянном перемешивании в .Ф течение двух часов п ри комнатной температуре. Суспензию центрифугируют при 700 q в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость используют для проведения спектрофлуариметрических исследований после соответствующего разбавления хлоридом натрия до конечной концентрации белка 0,2-0,5 мг/мл и конечной концентрации хлорида натрия 0,8-1,0 М.

СФЛ анализ одной пробы длится в среднем l. мин. Полноту осаждения глобулинов контролируют методом диск-электрофареза B

ПААГ. В качестве характеристики спектра флуаресценции используют величину параметра А, представляющую отношение интенсивностей на склонах спектра флуоресценции и являющуюся очень чувствительной характеристикой даже небольших спектральных сдвигов: А = Ьщ/l, где l>zz и l «„- — интенсивности в спектрах флуаресценцйи при длинах волн 320 и 365

0 нм соответственно. . Характер спектров флуоресценции и спектров поглощения (максимум в области

280 нм) препаратов альбуминов из сыворотки доноров и больных хроническим гломеру5 ланефритом (ХГН) свидетельствует о том, что во всех случаях флуоресценция обусловлена собственными хромофорами белка— триптофанавыми и тирозиновыми остатками. При возбуждении излучением с длиной волнь1 296,8 нм, т,е. в той спектральной области, где вклад тирозиновых остатков е поглощении незначителен, регистрируется только флуоресценгция триптафана, при возбуждении излучением с длиной волны 28

5 нм, наряду с триптофановыми остатками, значительный вклад s коротковолновой области спектра дают тиразиновые остатки. В случае сывароточного альбумина доля тирозиновых остатков в излучении значительна, 0 поскольку в составе молекулы этого белка имеется 18 тирозииовых и только 1 триптофановый остаток. В настоящей работе решено ограничиться анализом только триптофановой флуоресценции. Поэтому параметр А измерялся при возбуждении длиной волны 296,8 нм.

Пр и м е р 1. Больной Ленцер Д.А. 24 г„диагноз мембранозно-пропиферативный гломерулонефрит с нефротическим синдромом. суточная потеря белка (СПБ) 6,5 r/ñóò. концентрация альбумина в крови — 20,0 г/л.

Выделение альбуминов из сыворотки крови проводили по приведенной выше методике, определяли параметр,А при концентрации

5 альбумина 0,20 мг/мл, концентрации хпорида натрия 0,8 M. Получили величину параметра А = 1,62ч-0,02, Пример 2, Больной Ленцер ДА.

Определяли параметр А при концентрации альбумина 0,5 мт/мп, концентрации хпори1772744

Составитель Т.Пархоменко

Техред M.Моргентал Корректор -Н.Ревская

Редактор .

Заказ 3843 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 да натрия 1,0 M. Получили величину препарата А = 1,63.+0,04.

Пример 3. Больной Ленцер Д.А, Определяли параметр А при концентрации альбумина 0.3 Mr/мл,.концентрации хлорида натрия 0,9 М. Получили величину параметра А = 1,65+0,02.

Пример 4. Донор В., 18 лет, практически здоров. Определяли параметр А при концентрации альбумина 0,3 мг/мл и концентрации хлорида натрия 0.9 М. Получили величину параметра А = 1,22 +0,02.

Результаты исследования представлены в таблице, Средняя величина параметра А для 12 здоровых доноров составляет 1,26+0,01. Из данных таблицы следует:

Больные ХГН и здоровые доноры различаются по параметру А (спектр распределения) с Р < 0,001 по критерию

Вил коксона-Манна-Уитни, Обнаружена высокодостоверная, приближающаяся по величине к прямой функциональной связи зависимость между величиной параметра А и суточной протеинурией. Коэффициент ранговой корреляции па Спирмену р- 0.885; Р < 0,005..

Имеется достоверная обратная зависимость между уровнем альбумина в сыворотке крови и величиной параметра А. р-0,461, P < 0,05.

5 Применение способа позволяет упростить, ускорить методику и повысить чувствительность определения модифицированного альбумина. Используемые реактивы и методы исследования по10 зволяют сохранить первоначальную структуру модифицированного альбумина, находящегося в сыворотке крови, Формула изобретения

Способ определения модифицирован15. ного альбумина в крови человека путем ее биохимического исследования, о т л и ч а ющ и й. с я тем,.что, с целью упрощения, ускорения и повышения чувствительности способа, из сыворотки крови осаждают гло20 булины сульфатом эммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида .натрия до конечной его концентрации 0,81,0 М, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм; определяют

25 ее интенсивность при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитйвают, соотношение этих показателей.