Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов кролика

 

Использование: биотехнология и медицинская диагностика на основе иммуноферментного анализа. Сущность изобретения: получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к легким цепям иммуноглобулинов кролика. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0. Титр МКА в культуральной жидкости составляет 1:64, а в асцитной - 1:2560. МКА относятся к IgO, они специфически взаимодействуют с антигенными детерминантами легких цепей X и А иммуноглобулинов кролика. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 21 пассажа in vitro. 1 табл. сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социмистич схих SU и 1778184А1 (5I)5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР),19 1 J9

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTGPCHGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

СО

СО Ф

1 !

1 (21) 4881639/13 (22) 11.11.90 (46) 30.11.92. Бюл. h," 44 (71) Томский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Научнопроизводственного объединения "Вирион" (72) М.А.Аркина, Г.М. Ратнер, Т.А.Менявцева, Т.Л.Мирютова, З.P.Êóñêîâà и Т.Д.Лимарева (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ITS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К ЛЕГКИМ ЦЕПЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КРО-

ЛИКА (57) Использование: биотехнология и

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии и касается получения гибридомы, продуцируюцей моноклональные антитела (МКА) к легкии цепям иммуноглобулинов кролика, которые могут быть использованы для создания универсаль» ного антивидового кроличьего конъюгата, необходимого при определении активности гипериммунных кроличьих сывороток в имиуноферментном анализе.

Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено.

Итаии получают следующим образом.

Белых мышей Ва1Ь/с (масса 14-16 г) иммунизируют имиунохимически чистыми легкиии цеплми IE,G кролика еженедельмедицинская диагностика на основе иммунофериентного анализа. Сущность изобретения: получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к легким цеплм имиуноглобулинов кролика. Втамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ва1Ь/с с клетками мышиной ииеломы Sp 2/О, Титр МКА в культуральной жидкости составляет. 1:64, а в асцитной - 1:2560. МКA относятся к IE;G, они специфически взаимодействуют с антигенныии детерминантами легких цепей ® и 9 иммуноглобулинов кролика. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 21 пассажа

in vitro. 1 табл. но, вводя внутрибрюшинно по 250

300 мкг антигена на мышь в смеси с адъювантом фрейнда. За 4 днл до гибридизации мышам в течение трех дней подряд вводят антиген внутривенно в той же дозе без адюъванта. Затем извлекают селезенку и используют ее для выделения иммунных спленоцитов.

Слияние клеток миеломы и иммунных спленоцитов в соотношении 1:5 проводлт с помощью 503-ного полиэтиленгли коля с м.м. 1000. После слияния взвесь клеток в концентрации (3-5)х х 10 в 1 мл переносят в 96-луночные панели по 200 мкл на фидерный слой перитонеальных макрофагов мыши, полученный в течение 1-2 суток клетки о

9 инкубируют при 37 С в атмосфере, содержащей 54 С02.

1778184

Селекцию гибридом осуществляют населективной среде I AT, содержащей гипоксантин (1 ° 10 И),аминоптерин (4 х

> 10 И), тимидин (1,6 10 И), с последующим 3-кратным реклонированием методом лимитирующих разведений, Пер.вичный скрининг гибридом проводят через 21-30 дней инкубации для определения продукции специфических анти- 10 тел в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием планшетов, активи1 ованных легкими цепями ТдС кролика и меченных пероксидазой антител кбелкам сыворотки мыши. В качестве контроля используют сыворотки мышей, содержащие антитела к легким цепям иммуноглобулинов кролика в высоких титрах. Ртбирают и последовательно размножают клон гибридных клеток, наиболее стабильно продуцирующий ИКА необходимой специфичности в 96-24-6луночных панелях, а затем в культуральных флаконах возрастающего обьема. 25

Полученный штамм обозначают "N15".

Он депонирован 16,05.90 r в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Все-союзной коллекции клеточных культур Э0 под номером ВСКК(П) 489Л и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Клетки штамма N15 культивируют в среде

ГРУП-1640 с добавлением 2 ° 10 з И

1-глутамина и 10-153 сыворотки плода коровы. Для селекции гибридных клеток в ростовую среду добавляют

1.10 И гипоксантина, 4-10 И амино- птерина и 1,6 10 И тимидина. Гибри- .@0, -5 дому культивируют как в пластиковых, так и в стеклянных сосудах, оптималь- ная посейная доза 100-200 тыс. клеток в 1 мл, кратность рассева 1:2 - 1:7, интервалы между пассажами 2"3 суток.

Культура суспензионная, стационарная., Клетки обладают хорошей адгезивной " способностью, легко снимаются со стенок сосуда встряхиванием и пипетированием без применения растворов трип-, сина либо версена. Гибридому N15 .50 культивируют в брюшной полости мышей линии Ва1Ь/с, предварительно праймированных неполным адъювантом Фрейнда. Образуются асцитные или солидные

1 опухоли. Лсцитные опухоли продуциру- 55 ют асцит в те ение 8-18 дней, начиная г 6-14 дня после инокуляции 110 млн. клеток на животное.

Продуктивность штамма и хапактеристика полезно> о продукта. 6тамм

N15 продуцирует MKA к легким цепям

Л и Х иммуноглобулинов кролика.

Специфичность ИКЛ подтверждается методами ИЙА и иммуноблотинга. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:64, в асцитной - 1:2560 (непрямой ИфА). Стабильность продукции антител сохраняется на протяжении 21 пассажа in vitro (срок наблюдения) .

Контаминация штамма. При исследовании клеток штамма N15 на наличие посторонних агентов микробиологическим и электронномикроскопическим методами бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

Криоконсервирование и реконсерва" ция. За сутки до криоконсервирования проводят смену ростовой среды на свежую. Среда замораживания: 453 кондиционированной среды, 45 эмбриональной сыворотки, 10. диметилсульфоксио да. Режим замораживания - с 4 С до Р

-25 С со скоростью 1 градус в минуо о ту, затем - до -70 С по 5 С в минуту, ампулы с клетками следует выдержать при такой температуре в течение

10 мин, хранить в жидком азоте при

-196 С.

Реконсервация - на водяной бане при 37ОC. Жизнеспособность клеток после размораживания при окрашивании трипановым синим составляет 883. Способность продуцировать антитела сохраняется на прежнем уровне.

Пример 1. Планшеты.для ИФА активируют препаратом иммунохимичес .ки чистых легких цепей иммуноглобулинов кролика, режим активации: концентрация белка - 40 мкг/мл, наслаивающий буферный раствор — карбонатбикарбонатный буфер рН 9,6, время инкубации - 18 ч при 4 С. После отмывания планшетов от несвязавшегося белка (6 раз поочередно водопроводной водой и дистиллированной водой с

0,054 твина-20) в лунки вносят исследуемые пробы культуральной жидкости с продуктами жизнедеятельности гибридного клона М15, а также положительный (сыворотка мышей, иммунизированных легкими цепями иммуноглобулинов кролика) и отрицательный (культуральная жидкость, не содержащая продуктов жизнедеятельности гибридом) контроли (К+ и К- соответственно).

17

3 ч при белки образоПроволят инкубацию в течение о

37 С, о1мывают несвязавшиеся как описано выше и проявляют

Bавшиеся иммуíHûå комплексы с помощью иммуноферментногo конъюгата, представляющего собой меченные перокси,дазой кроличьи, антитела к иммуноглобулинам мыши (рабочее разведение конъюгата — 1:1000, время инкубации о

1 ч при 37 С). После окончания инкубации в лунки планшета вносят субстратную смесь, представляющую собой

О,ОМ раствор ортофенилендиамина на цитратном буфере рН 4,7-5,1 с добавлением О, 031 перекиси водорода: реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку 60 мкл 50ь серной кислоты после достаточно выраженного (ви" зуальный контроль) изменения окраски в лунках с испытуемыми пробами. и К+, оптическую плотность продуктов ферментативной реакции измеряют с помощью спектрофотометра с вертикальным ходом луча типа "Цп1зса»".

Определение титров ИКА в культуральных и асцитных жидкостях в ИФА проводили по методике, аналогичной вышеописанной,но исследуемые пробы в этом случае вносили в различных разведениях (от 1:2 до 1;256 или от

1:20 до 1:2560) и параллельно раститровывали положительный и отрицатель" ный контроли. За титр исследуемой пробы принимали то ее последнее разведение, значение оптической плотности (ОП) в котором не менее, чем в два раза превышало величину ОП соответ ствующегo разведения отрицательноro контроля (при непрерывном условии абсолютная величина ОП в этом разведении не должна быть меньше 100).

Результаты исследований представлены в таблице.

Пример 2. Проводят электроФорез в 101-ном полиакриламидном геле (ПААГ) иммунохимически чистого кроличьего 18G, предварительно прокипятив его в течение 3 мин в буфере, содержащем 0,11 додецилсульфата нат рия и 2l бета-меркаптоэтанола . Такая обработка приводит к разрыву межцепочечных связей в молекуле IgG с разведением ее на тяжелые и легкие цепи.

Параллельно с 1ГГ кролика электрофорезу s ПЛАГ подвергают смесь белков с известной мол. массой (маркеры с мол. массой от f4000 до 14400 D), 78184 6 что позволяет точно определить после завершения электрофореза положение легких цепей IyG.

После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлоэный фильтр с помощью прибора для электропереноса: на регулировочные винты горизонтально расголоженного основания камеры помещают нижнюю титановук пластину, наливают в камеру 1,5 л буфера для электропереноса (трис-глициновый буфер, рН 8,6, смешанный в равных частях с метанолом и разведенныи дистил15 лированной водой в 5 раз), затем последовательно собирают "сэндвич"нижняя мягкая прокладка, прокладка иэ фильтровальной. бумаги, пластинка полиакриламидного геля с электрофд-, ретически разделенными молекулами тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов кролика, мембрана, на которую производится перенос (нитроцеллюлозный фильтр), верхняя прокладка иэ

25 Фильтровальной бумаги, верхняя мягкая прокладка, верхняя титановая пластина. Каждый слой укладывают осторожно, следя за тем, чтобы между слоями не попали пузырьки воздуха.

30 После того, как "сэндвич" готов, камеру герметично закрывают, ставят вертикально и подключают источник питания: отрицательный полюс со стороны геля, положительный - со стороны мембраны ° Перенос проводят в течение

2-Зч при напряжении 20-30 8.

После окончания переноса "сэндвич" . осторожно разбирают в обратной последовательности и мембрану с перенесенными на нее белками помецают в 0,02 И трис-НС1 буфер рН 7,5 с 0,15 М NaC1 и 23 бычьего сывороточного альбумина (буфер 1) на 30 мин, Затем мембрану высушивают и разрезают на узкие по"

45 лоски (примерно 0,5 см), которые помещают в буфер 2 (буфер 1 с добавлением 0 054 твина-20) на 30-60-мин, после чего полоски .мембраны погружают R раствор исследуемых моноклональ5О ных антител (последние предварительно разводят буфером 2 до концентрации белка 50 мкг/мл), проводят инку" бацию в течение 18-24 ч при 4 С, pалее полоски мембраны отмывают 5 раз буфером 2 и заливают рабочим раствором иммуноферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IpG мыши в разведении 1:500) на 4 часа при комнатной температуре. После

1 778184 получения универсальных антивидовых кроличьих кон ьюгатов, необхсдимых при тестировании активности гипериммунных кроличьих сывороток в иммуноферментном анализе. формула и з о б р е т е н и я

Определение титров МКА в культуральной и асцитной жидкостях

Титр

MKA

Разделе- ОП ОП ние пробы пробы КХарактеристика пробы

Культуральная жидкост ь, содержащая

ИКА (продуцент— клон N15, опыт от

22.08 ° 90 г.) 1: 128 91 58

1:256 81 33

2177 706

922 294

1:20

Асцитная жидкость, содержащая МКА (продуцент - клон

N15, опыт от

24.10-90 г.) 1:40

Г

Составитель M.Àðêèíà

Редактор Л.Павлова Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Н.Слободяник

Заказ 4)65 Тираж Подписное

ВИИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г.ужгород, ул. Гагарина,101 окончания инкубации пластин с конъогатом их отмывают 5 раз по 5 мин буфером. 2 и 3 раза по 5 мин 0,02 М трис-НС1-буфером рН 7,5. Проявление образовавшихся иммунных комплексов проводят с помощью раствора 4-хлорнафтола и диаминобензидина в метаноле с добавлением перекиси водорода (40 мин). В зоне взаимодействия МКА и легких цепей проявляется полоса коричневого цвета.

Таким образом, полученные Ml(A могут быть эффективно использованы для

Штамм гибридных культивируемых клеток 1us nusculus I,. ВСКК (П)

lf 489 Д, используемый для получения моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов кролика.

1:2 1322 . 123

1:4 960 95

1 8 817 81

1:16 296 63

1:32 258 60

1:64 128 49 1:64

1:80 430 229

1:160 319 151

1:320 238 96

1!640 201 79

1: l280 184 82

1 2560 156 67 1 2560