Способ получения пироглутамилсодержащих субстратов

 

Использование: в медицинской и биологической химии. Сущность: способ получения пироглутамилсодержащих ферментных субстратов общей формулы: L-GLp-MR-C CH-C-N02 СН СН-СН где R-H, -Phe, -Phe-Ala, -Ala-Ala-Leu. Реагент 1: хлорангидрид L-пироглутаминовой кислоты , полученный непосредственно перед введением в реакцию обработкой L-пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре -5-10°С в абсолютном хлорированном углеводороде: . Реагент 2: RNH-C-CH-C-N(2 сн сн-сн Процесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение 16 ч. Предпочтительно при получении соединений I, где , в качестве основания используют избыточное количество n-нитроанилина. Выход 70-95%. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. со С

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК Ы,, 1781226 А1 (st) 5 С 07 К 5/00; С 07 0 207/12

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР

Ф -, ", т ° (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ = -." /

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4812402/04 (22) 05,02.90 (46) 15,12.92, Бюл. N 46 (71) Рижский политехнический институт им.

А.Я.Пельше (72) И,Т.Равиня, Д.P.Çèöaíå, Ю.Б,Слиеде, И.А,Рийкуре и З.Ф.Тетере (56) Авторское свидетельство СССР

N 1025091, кл. С 07 К 5/00, 1984, Авторское свидетельство СССР

N. 1198082, кл. С 07 К 5/00, 1984.

Fujiwaka К. и др, New chrornogenic and

Fiuorogenic substrats for Pyrrolidonyl

Peptidase. — J, Biochem. 1978, 83, 1145-1149. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРОГЛУТАМИЛСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ (57) Использование: в медицинской и биологической химии. Сущность: способ получения пироглутамилсодержащих ферментных субстратов общей формулы:

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пироглутамилсодержащих субстратов, которые находят применение в медицинской биологической химии, Известно несколько способов синтеза и-нитроанилидов пироглутамилсодержащих субстратов. Их получают конденсацией пироглутамилпептида с и-нитроанилидом аминокислоты, Известен способ получения пироглутамилпептидов методом активированных эфиров с использованием пентафторфенилового или N-оксисукцинимидного эфиров. Конденсация пироглутамилпептида с и-нитроанилидом аминокислоты проведена с N,N --дициклоf

Ь i 1.p NR С Сн с И02

l И

СН=СН- СК где R-H, -Phe, -Phe-Ala. -Ala-Ala-Leu. Реагент

1: хлорангидрид L-пироглутаминовой кислоты, полученный непосредственно перед введением в реакцию обработкой L-пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре -5-10 С в абсолютном хлорированном углеводороде:, Реагент 2:

RN н-с Ск-с-N0 .2

СН=СК-CH

Процесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение 16 ч.

Предпочтительно при получении соединений l, где A=H, в качестве основания используют избыточное количество п-нитроанилина, Выход 70-95 1 з.п. ф-лы, 2 табл. гексилкарбодиимидом, иногда в присутст- 4 вии одного эквивалента N-оксисукциними- 00 да. ° Ъ

Известны ферментативные способы ) ) получения п-нитроанилидов пироглутамилсодержащих субстратов путем конденсации (О фрагментов с использованием химотрипсина и термолизина.

Эти спасовы нв позволяют полуявть, 3 » продукты с достаточно вйсоким выходом, они не удобны для использования в промышленности при крупномасштабных производствах и требуют дорогостоящих. реактивов.

Известны способы получения пироглутамилсодержащих ферментных субстратов путем конденсации Вос-замещенной L-nu1781226

55 роглутаминовой кислоты с и-нитроанилидом в присутствии конденсирующего агента (ДЦК) при 0 С с последующей выдержкой при комнатной температуре.

Недостаток известного способа. состоит в том, что в нем используют защищенную по аминогруп пе пироглутаминовую кислоту, дициклогексилкарбодиимид (сильный аллерген), кроме того при осуществлении известного способа требуется дополнительная стадия — отщепление защитной группы. Выход целевого продукта невысок и составляет 177,.

Недостатком известных способов является использование в синтезе N-защищенных производных пироглутаминовой кислоты.

Цель описываемого способа — повышение выхода пироглутамилсодержащих ферментных субстратов и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается описываемым способом, в котором хлорангидрид 1-пироглутаминовой кислоты полученный непосредственно перед введением в реакцию обработкой 1-пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре -5 — 10 С в абсолютном хлорированном углеводороде, вводят во взаимодействие с азотсодержащим ароматическим нитросоединением формулы A-ХН Я-ВО, где А=Н. L-Р11е

L-Phe-1 -Ala, 1=А!а2-1.-Ala-1-Leu и процесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение 16 часов, предпочтительно при А=Н в качестве основания использовать избыточное количество п-нитроанилида, Способ осуществляют следующим образом.

Индивидуальность полученных соединений установлена методом ТХС на пластинках "Silufol" в системах: этанол-н-бутанол-вода = 1;4;1 (А); пиридинн-бутан ол-вода-уксусная кислота

=20:30:12:6 (Б); н-бутанол-уксусная кислотавода = 200;35;70 (В).

К суспензии 18,1 г (87 ммоль) пентахлорида фосфора в 150 мл абсолютного хлорированного углеводорода (метиленхлорид, хлороформ) порциями добавляют 10,2 г (79 ммоль) L-пироглутаминовой кислоты, поддержйваМ 1емпературу реакционной смеси

-5-10 С, При данной температуре перемешиваеотл еще 1 ч. Расотворитель отсасывают.

Прибавляют 79 MMoRb и-нитроанилида ами.нокислоты или пептида, или и-йитроанилина и 79 ммоль основания х (триэтиламин, пиридин, N-метилморфолин) в абсолютном

40 неполярном растворителе (тетрагидрофуран, диоксан). Прибавление ведет при температуре -5-10 С, затем перемешивают 2 ч при той же температуре, и оставляют на

16-20 ч при температуре 18-20 С. Растворительупаривают в вакууме водоструйного насоса (температура бани 40 С), остаток обрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты, отфильтровывают и на фильтре промывают водой. При перекристаллизации из спирта получают соответственный пироглутамилсубстрат, Выходы и свойства полученных соединений даны в табл,1.

При использовании и-нитроанилина для синтеза и-нитроанилина L-пироглутаминовой кислоты прибавление основания не требуется, По сравнению с известными способами получения пироглутамилсодержащих ферментных субстратов преимущество предло>кенного способа характеризуется тем, что по одной общей унифицированной схеме можно синтезировать любой представитель класса пироглутамилсодержащих ферментных субстратов. Это позволяет провести синтез выше названных соединений в одинаковых технологических условиях.

Кроме того, предложенный способ позволяет исключить работу с сильным аллергеном N,N-дициклогексилкарбодиимидом, который используется в известных способах для конденсации пироглутамилпептида с инитроанилидом аминокислоты, Для осуществления предложенного способа не требуется дефицитные и дорогостоящие ферментные препараты (химотрипсин, термолизин), которые используются в известных сйособах для синтеза препаративных количеств некоторых пироглутамилпептидов.

Формула изобретения

1. Способ получения пироглутамилсодержащих субстратов общей формулы где R-H, 1 -Phe-, -L-Phe-А!а, -1:А!а-AIa-Leu, путем взаимодействия производного 1пироглутаминовой кислоты с соответствующим азотсодержащим ароматическим нитросоединением в абсолютном неполярном органическом растворителе при пониженной температуре с последующей выдержкой при комнатной температуре, о тл ича ю щи йс я тем,что, сцельюупрощения процесса и повышения выхода, в качестве производного L-пироглутаминовой кислоты используют хлорангидрид L-пироглутаминовой кислоты, полученный непос1781226

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что при А-Н в качестве основания используют избыточное количество и-нитроднилина.

Таблица!

Синтезированные соединения, (номер) Т.пл., С (с; рзстворитель) 84 (систеиа) Выход, Х

Спирт для кристаллизации

r Известный способ

Нредлагае- Известный иыи способ способ

Нредлагае- Известный иыи способ способ

Нредлагаеиый способ

С-CIP-pHA (IV) -30(c1195X

СНЭСООН) 223-225

0 73 (А) Этанол

-30(с-1;

95Х

СН ОООН) 223"225

L- Cl p" P he-pNa (Ш а) +61 (с 0,3:

70Х

ДИФД ) 0,75 ($) 0,7$ (Б) Этанол

270 (раэл,) +60 (с0, 3;

70Х

ДМФА) 265- 268 (разл.) -18(с1 дпФА) -18(с 1;

Д11ФД) Иетанол 243-246

L-Glp-Phe-Аlа-PNA (111) 70

0,64 (8)

0,80 (Б) 261-264

1;Clp"А1а-А1а-Leu-рНА. 68

-15(a=0,5:

Д11ФД) Иетанол 262-265

-16(с0,5

ДИФД) Таблица 2

Составитель И.Равиня

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор С.Юско

Редактор

Заказ 4252 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 редственно перед введением в реакцию обработкой L-пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре (-5)-(-10) С в абсолютном хлорированном углеводороде, в качестве азотсодержащего ароматического нитросоединения — соединение общей формулы

A-НН-Я-НО, где А-Н, 1=Phe, -1 -Phe-Ata. -L=Ata-Ala-1 еи, и процесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение

16 ч.