Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах

 

Использование: изобретение может быть использовано для определения содержания тканевых примесных компонентов в сиальных препаратах. Цель: повышение чувствительности тест-системы. Сущность: для иммунизации лабораторных животных используют экстракт тканевых примесей, вначале 100-200 мкг экстракта и 0,1-0,2 мл . полного адъюванта Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100-200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200-300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутримышечно и.внутрибрюшинно, а затем 400- 500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно. Из полученной сыворотки с титром 1/1280- 1/2560 выделяют lgG-антитела и конъюгируют их с пероксидазой хрена при концентрациях белка 17-ЗН мкг/мл и фермента 1,85-3,6 мкг/ил. Положительный эффект: полученная тест-система позволяет значительно (в 80-5120 раз) повысить чувствительность способа определения тканевых примесных компонентов в риккетсиальных препаратах и количественно определить их содержание. При этом обеспечивается значительная экономия материальных средств, т.к. сокращаются сроки иммунизации живо-, тных до 66 дней с 87 по прототипу и снижается расход сыворотки на исследование одной пробы в 600 раз. ел с 00 о Ј ю 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4840932/14 (22) 10.05.90 (46) 15.03.93. Бюл, ¹ 10 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера . (72) Н.К. Токаревич и Е.Н. Горбачев (56) Пушкарева В.И. Антигенная и протективная активность корпускулярного антигена из риккетсий Провачека, инактивиррваннйх гамма-излучением. Автореферат дисс. канд. мед. наук. M.: 1986, с. 24. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТКАНЕВЫХ ПРИМЕСЕЙ В РИККЕТСИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ (57) Использование: изобретение может быть использовано для определения содержания тканевых примесных компонентов в риккетсиальных препаратах. Цель: повышение чувствительности тест-системы. Сущность; для иммунизации лабораторных животных используют экстракт тканевых примесей, вначале 100-200 мкг экстракта и 0,1-0,2 мл, полного адъюванта Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла

Изобретение относится к иммунологии, а именно к получению биологических препаратов, Цель изобретения — повышение чувствительностии тест-Чистемы.

Цель достигается тем, что в способе, включающем введение антигена кроликам с последующим забооом крови, в качестве антигена используют экстракт тканевых примесей, при этом в начале 100-200 мкг

„„5Q„„1801494 А1 щ А 61 К 39/395, G 01 N 33(547

Ю и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят

100-200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200 — 300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутримышечно и.внутрибрюшинно, а затем 400500 мкг экстракт вводят внутрибрюшинно.

Из полученной сыворотки с титром 1/12801/2560 выделяют 19G-антитела и конъюгируют их с пероксидаэой хрена при концентрациях белка 17-ЗН мкг/мл и фермента 1,85 — 3,6 мкг/ил. Положител ь н ы и эффект: полученная тест-система позволяет значительно (в 80 — 5120 раз) повысить чувствительность способа определения тканевых примесных компонентов в риккетсиальных препаратах и количественно определить их содержание. При этом обеспечивается значительная экономия материальных средств, т.к. сокращаются сроки иммунизации животных до 66 дней с 87 по прототипу и снижается расход сыворотки на исследование одной пробы в 600 раз. экстракта и 0,1-0,2 мл ПАФ вводят в подушечку стопы левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят

100 — 200 мкг подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды

200 — 300 мкг экстракта подкожно и внутри3

1801494

10

30

35. \

55 мышечно, затем внутримышечно и внутрибрюшинно, а затем 400-500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно, из полученной сыворотки с титром 1/1280 — 1/2560 выделяют

IgG-антитела и конъюгируют их с пероксидазой хрена при концентрациях белка 17—

34 мкг/мл и фермента 1,85 — 3,6 мкг/Mll.

Пример 1, Вскрывают 15 — 17 дневные развивающиеся куриные эмбрионы, извлекают из них желток, гомогенизируют в течение 20 мин, при 8000 об/мин в 4-х кратном объеме забуференного физиологического раствора, рН 7,3, Полученные гомогенаты далее центрифугирчют 20 минут при 250, надосадочные жидкости замораживают (сутки при -20 С, затем размораживают при комнатной температуре и повторно центрифугируют 45 минут при 1000 на холоде, Полученный таким образом экстракт лиофильно высушивают, определяют его массу и используют в качестве антигена при иммунизации кроликов в качестве референс-антигена для иммуноферментного анализа (ИФА) и для реакции связывания комплекта (РСК), Иммунизацию кроликов-самцов массой

2-2,5 кг проводят по следующей схеме:

1-я иммунизация в подушечку стоп левой задней конечности 150 мкг антигена и

0,1 мл полного адьюванта Фрейнда, 150 мкг антигена и 0,2 мл адъюванта в область подколенного лимфатического узла левой лапы;

150 мкг антигена внутримышечно в левую заднюю лапу, 2-я иммунизация через 5 дней — 150 мкг антигена и 0,1 мл полного адъюванта Фрей.нда в п0душечку стоп правой задней конечности и 150 мкг антигена и 0,2 мл адъюванта в область подколенного лимфатического узла правой лапы и 150 мкг антигена внутримышечно в правую заднюю лапу.

3-я иммунизация через 45 дней — 150 мкг антигена подкожно и 150 мкг антигена внутримышечно, 4-я иммунизация через 2 дня — 250 мкг антигена подкожно и 150 мкг антигена внутримь|шечно.

5-я иммунизация через 2 дня — 250 мгк антигена внутримышечно и 250 мкг антигена внутрибрюшинно.

6-я иммунизация через 2 дня — 450 мкг антигена внутрибрюшинно.

Через 10дней после последней иммунизации кроликов обескровливают, определяют уровень антител в PCK c референс-антигеном. Минимальный титр сыворотки составляет 1: 1280 — 1:2560.

Из полученной сыворотки выделяют

IgG"антитела, коньюгируют их с пероксидазой хрена (концентрация белка в рабочем разведении конъюгата в интервале 17 — 34 мкг/мл; концентрация фермента — 1.85-3,7 мКг/мл). методом перйодатного окисления фермента и последующем восстановлением боргидридом натрия.

Готовую тест-систему хранят при +4 С в течение года и используют по мере надобности.

Для определения количества тканевых примесей в исследуемых риккетсиальных препаратах постановку иммунологической реакции осуществляют в "прямом" варианте. При этом в лунки полистироловой панели вносят приготовленные на сорбирующем карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,5; 0,05 М) разведения исследуемых образцов в объеме 0,15 мл и ряд двукратных разведений (от 20 мкг/мл до 20 нг/мл) стандартизированного референс-антигена, представляющего собой экстракт тканевых примесей. После инкубации при

4 С в течение 18 час панель промывают промывочным буферным раствором. Затем в лунки вносят по 0,1 мл иммунопероксидазного конъюгата и инкубируют в течение 1 час при 37 С. После повторной промывки панели в лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Через 40 мин проводят учет результатов иммунологической реакции по интенсивности цветной реакции, которая пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце примесных компонентов.

Количественное содержание примесных компонентов в соответствующем разведении исследуемого образца определяют путем сопоставления значения оптической плотности окращенного продукта при длине волны 450 нм (ОП) с линейным участком калибровочной кривой, полученной путем титрований стандартизован ного референс-антигена.

Концентрацию примесных компонентов в исходном образце рассчитывают по формуле С =- А х и; где С.— концентрация примесных компонентов в исходном образце, А — концентрация примесных компонентов в разведении; п — разведение образца, Пример 2, Постановка иммунологической реакции с использованием иммунопероксидазного конъюгата при концентрации белка 17 мкг/мл и концентрации фермента 1,85 мкг/мл.

При заданных условиях отмечаются высокие значения ОП при исследовании референс-антигена (0.8 + 0,05 при концентрации 1 мкгlмл) и низкие значения

ОП в контроле.конъюгата и при исследова1801494 и при исследовании отрицательных контрольных образцов (0.02 +. 0,02). Однако при этом наблюдается резкое снижение значений ОП при исследовании референсантигена (0,25 + 0,05 при концентрации 1 мкг/мл}, вследствие чего более чем в 2 раза снижается чувствительность анализа.

Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения тканевых примесей более чем в 1000 раз.

Кроме того, применение способа позволяет осуществлять количественный приборный учет результатов анализа и обеспечивает значительную экономию материальных средств, так снижает в 600 раз расход сыворотки на одно исследование, .

Составитель В. Брусиловская

Техред М.Моргентал Корректор Е Папп

Редактор

За аз 806 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 нии отрицательных контрольных образцов (0,05 0,05).

При исследовании в заданных условиях риккетсиальных .препаратов содержание примесных компонентов варьирует вдиапа- 5 зоне от 0,018 до 0,40 мкгl мл для коммерческих препаратов и от 0,004 до 0,056 мгlмл для лабораторных серий.

Пример 3. Постановка иммунологической реакции с использованием иммуно- 10 пероксидазного конъюгата при концентрации релка 34 мкг/мл и концентрации фермента 3,? мкг/мл, При определении содержания ткэневых примесных компонентов в риккетсиальных 15 препаратах в заданных условиях получены результаты аналогичные описанным в при; мере 1, Пример 4. Постановка иммунологической реакции с использованием иммуно- 20 пероксидазного конъюгатэ при концентрации белка 136 мкг/мл и концентрации фермента 14,5 мкг/мл.

При заданных условиях отмечаются высокие значения ОП при исследовании рефе- 25 ренс-энтигена (0,9 . 0,1 при концентрации 1 мкг/мл). Однако, при этом имеют место также высокие значения ОП в контроле конъюгэта и в лунках с отрицательными контрольными образцами 30 (0,3 0.05).

При определении содержания примесн ых компонентор в заданных условиях име- ют место высокие значения фонового окрашивания при исследовании риккетси- 35 альных препаратов. что затрудняет учет результатов иммунологической реакции и

° снижает чувствительность и специфичность анализа (до 40 ).

Пример 5. Постановка иммунологи- 40 ческой реакции с использованием иммуно- пероксидазного конъюгата при концентрации белка 4,25 мкгlмл и концентрации фермента 0,45 мкг/мл.

При заданных условиях отмечаются 45 низкие значения ОП в контроле коньюгата

Формула изобретения

Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах, включающий введение антигена кроликам с последующим забором крови. и выделением иэ полученной сыворотки иммуноглобулиновой фракции, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности тест-системы, в качестве антигена используют экстракт тканевых примесей, при этом в начале 100 — 200 мкг экстракта и 0,1-0.2 мл полного адъюванта

Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в.область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100 — 200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200-300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутримышечно и внутрибрюшинно, а затем 400 — 500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно, из полученной сыворотки с титром 1/1280 — 1/2560 выделяют IgG-антитела и конъюгируют их с пероксидазой хрена при концентрациях в конъюгате белка 17-34 мкг/мл и фермента 1,85 — 3,5 мкг/мл.