Рекомбинантная плазмидная днк @ hrast @ =3, кодирующая онкоген hras=1 карциномы щитовидной железы человека, и способ ее конструирования

 

Использование: в генетической инженерии для определения экспрессии, структуры и функции онкогена HRAS1 в нормальных клетках, злокачественных и доброкачественных опухолей человека. Сущность изобретения: плазмида pHRASTh-З содержит BamH1-BamH1 - фрагмент ДНК рекомбинантного фага Я47,1, кодирующего онкоген HRAS1, карциномы щитовидной железы человека, имеющий точковую мутацию в 12-ом кодоне, промотор фага SP6 и фрагмент полилинкера фага М13, входящего в вектор pSP64. 2 с. п.ф-лы, 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/12

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4872379/13 (22) 21.08.90 (46) 15.05,93. Бюл. N. 18 (71) Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Н.Н.Петрова и Институт экспериментальной медицины АМН СССР (72) П.Г.Князев, А.Н.Суворов, О.М.Серова, В.И. Голубков, Г.Ф.Плужникова, М.Г.Максимишина, В.И.Бабенко, И.Ф.Никифорова и

А.А.Тотоля н (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДН К pHRASTh-3, КОДИ РУЮЩАЯ ОН КОГЕН

HRAS-1 КАРЦИНОМЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕИзобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии и представляет собой конструирование in vitro рекомбинантной плазмидной ДНК pHRASTh3, содержащей онкоген HRAS1, выделенный из банка ДНК карциномы щитовидной железы человека, на основе вектора pSP64.

Целью изобретения является создание плазмиднай ДНК, пригодной для транскрипции онкогена HRAS1 in vitro, а также получения антиомысловых РНК, определения структуры, экспрессии и функции этого гена в нормальных и опухолевых клетках человека.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рHRASTh-3 характеризуется следующими признаками: — имеет размер 9,7 т,п.н.; — содержит BamH1 — BamH1-фрагмент

ДНК карциномы щитовидной железы чело„„ 2„„1815273 А1

ЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Использование: в генетической инженерии для определения экспрессии, структуры и функции онкогена HRAS1 в нормальных клетках, злокачественных и доброкачественных опухолей человека. Сущность изобретения: плазмида pHRASTh-3 содержит BamH1 — BamH1— фрагмент ДНК рекомбинантного фага 147,1, кодирующего онкоген HRAS1, карциномы щитовидной железы человека, имеющий точковую мутацию в 12-ом кодоне, промотор фага SP6 и фрагмент полилинкера фага М13, входя щего в вектор pSP64. 2 с. п.ф-лы, 3 ил. века (без последовательностей ДНК фага) размером 6,7т.п.н., включающий всю транскрибируемую область онкогена HRAS1 и расположенную в антисмысловой ориентации; — имеет точковую мутацию (замену G на

Т) в 12 кодоне клонированного онкогена

HRAS1 (1,704 т.п.н. от BamH1 сайта в 5 — 3 направлении); — содержит BamH1 — BamH1-фрагмент

ДНК вектора pSP64 размером 3,0 т.п.н.; — несет промотор фага SP6 и полилинкер фага М13; — имеет уникальные сайты рестрикции; — несет ген устойчивости к ампициллину.

Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рНКАЯТп-3 заключается в том, что ДН К карциномы щитовидной железы расщепляют рестриктазой BamH1, 1815273 л и гируют с Bam H1-плечами вектора бактериофага А47.1 и упакованными в фаг рекомбинантными молекулами ДНК инфицируют клетки Е. cali Q359. С помощью гибридизацион ного анализа отбирают фаги, содержащие онкоген HRAS1, выделяют его и реклонируют в плазмидном векторе pSP64.

Прототипом полученной рекомбинантной плазмидной ДНК pHRASTh-3 является плазмида pEJ6,6, содержащая онкоген

HRAS1, также несущий мутацию (замена 6 на T) в 12 кодоне, клонированный в векторе

pBR322. В силу отличий репликативных характеристик векторов pBR322 и pSP64, клонирование в последнем позволяет получать на порядок больший выход плазмидной

ДНК р lRASTh-Ç, по сравнению с pEJ6.6, из одинакового количества биомассы E. coli.

Наличие сильного промотора фага SP6 в плазмиде pHRASTh-3, отсутствующего в

p E J 6. б, дает возможность синтезировать антисмысловую HRAS1 РНК, а присутствие полилинкера фага М13 обеспечивает использование более широкого спектра рестрикционных эндонуклеаз, чем в случае

pEJ6.6, для генетических манипуляций с плазмидной ДН К.

Банк генов ДНК рака щитовидной железы (РЩЖ) человека получали на основе вектора бактериофага iL 47,1 (Маниатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж, Молекулярное клонирование, 1984, М, Мир. 477 с.).

Высокоочищенную ДНК, выделенную фенол-хлороформным методом, обработанную протеинкиназой К и вновь депротеинизированную фенолом и хлороформом, гидролизовали рестрикционной эндонуклеазой BamH1. Разделение фрагментов ДНК

РЩЖ проводили в 1 геле агарозы с последующим выделением зон ДН К в пределах от

4,0 до 10 т,п.н. Присутствие в выделенных зонах последовательностей онкогена

HRAS1 тестировали по Southern на нитроцелл юлозн ых фильтрах (ВА85 Schlei cher and

Яс iull, USA) путем гибридизации ДНК со вставкой HRAS1 плазмиды pEJ6.6, меченной 32Р в реакции ник-трансляции, ДНК фракции N5 РЩЖ, дающей максимальный сигнал гибридизации с газ-специфическими последовательностями, лигировали с Baml-плечами вектора бактериофага 1 47,1 с помощью ДНК-лигазы Е. со!!. Упаковку рекомбинантных ДНК проводили с помощью упаковочных экстрактов, полученных из клеток ВНВ 2688 и ВНВ

2690. Скрининг банка рекомбинантных фагов проводили путем гибридизации ДНК из перенесенных бляшек на нитроцеллюлозные фильтры с меченым радиоактивным

55 зондом HRAS1. Из более 500000 клонов при первичном скрининге выявили 12 положительных сигналов гибридизации с онкогеном HRAS1. Несколько зон, содержащих рекомбинантные фаги, перекалывали на свежий газон клеток Е. coli Q 359 с последующей экстракцией фагов из бляшек в течение ночи SM-буфером. Рекомбинантный фаг

А 47,1-Ч-25 трижды субклонировали методом конечных разведений, затем наращивали на 10 чашках агарозной культуры Е. coli, штамм Q 359. Бактериофаг экстрагировали

SM-буфером в течение ночи, полученный фаголизат очищали и далее выделяли ДНК биохимическим методом. ДНК фага гидролизовали рестрикционной эндонуклеазой

BamH1, разделяли электрофорезом в 1 геле агарозы и получали 3 фрагмента. Два из них (размерами 23,5 и 10,5 т.п.н.) соответствовали "плечам" фага, третий-6,7 т.п.í. содержал последовательности генома человека. После переноса этих фрагментов на нитроцеллюлозные фильтры по Саузерну и последующей гибридизации иммобилизованной ДНК установлено, что с онкогеном

HRAS1 гибридизуется фрагмент размером

6,7 т.п.н. После препаративного гидролиза

50 мкг рекомбинантного 1 47,1-V-25 фага рестриктазой BamH1 фрагмент размером

6,7 т.п.н. выделяли из 1 геля легкоплавкой ага розы.

Полученную ДНКреклонировали в плазмидном векторе pSP64 (Melton D., Kreig P., Rebagliati М. et. al. Efficient! и vitro synthesis

of biologically active DNA and RNA

hybridization probes from plasmids

containing à bacteriophage SP6 promoter.

Nuc. Acid Res., 1984, V. 12, P. 7035 — 7056).

Для этого последовательность ДНК HRAS1 размером 6,7 т.п.н. и ДНК вектора pSP64, линеаризованного эндонуклеазой BamH1, лигировали с помощью ДНК-лигазы E, coll, Полученной рекомбинантной ДНК трансформировали компетентные клетки Е. coli

НВ 101. Колонии, устойчивые к ампициллину, дающие положительную гибридизацию с pEJ пробой, отбирали, выделяли ДНК и характеризовали ее рестрикционным анализом. На фото.1 представлены результаты электрофореза, с помощью которого определены размеры плазмиды pHRASTh-З, вставки ДНК онкогена HRAS1 человека (дорожка 2) и вектора pSP64 (дорожка 4). На фото.2 изображена схема рекомбинантной плазмидной ДНК pHRASTh-3, иллюстрирующая расположение вставки ДНК онкогена

HRAS1 человека в векторе pSP64, промотора фага SP6, полилинкера фага М13 и гена устойчивости к ампициллину.

1815273

При гидролизе 1-го экзона рестриктазой Mspl обнаружена мутация в 12-ом кодоне. С целью определения варианта замены нуклеотидов в 12-ом кодоне была проанализирована первичная последовательность нуклеотидов 1-го экзона онкогена HRAS1 щитовидной железы человека, содержащегося в плазмиде pHRASTh-3. Для этого 1 экзон гена HRAS1 после гидролиза рестриктазой Pst1 выделяли препаративно и клонировали в плазмиде pUC 19. Накопленную плазмиду рВБ1-12 гидролизовали рестриктазой EcoR1, разделяли электрофорезом в

6o ПАГ и выделяли фрагмент, имеющий размер 0,37 т.п.н, Для определения первичной структуры проводили мечение по 3-кон,цу при помощи фрагмента Кленова и секвенировали по Максаму-Гильберту. На фото 3 представлены результаты определения первичной последовательности нуклеотидов, окружающих 12 кодон, фрагмента плазмиды pHRASTh-3. На радиоавтографе отчетливо видна замена в 12-ом кодоне 6 на T.

Пример. Определение первичной структуры 1 экзона онкогена HRAS1 плазмиды pHRASTh-3, Клонирование фрагмента pHRASTh-3 в векторе pUC 19.

С этой целью последовательности 1-ro экзона онкогена HRAS1 после расщепления плазмиды pHRASTh-3 рестриктазой Pst-1 выделяют препаративно. Фрагмент размером 0,37 т.п.н., представляющий собой 1 экзон онкогена, реклонируют в векторе pUC

19. Около 200 мкг полученной плазмиды рВБ-1, содержащей 1-й экзон онкогена

HRAS1, гидролизуют рестриктазой EcoR1 и вектор от вставки отделяют в 6 ПААГ.

Ф рагмент, имеющий размер 0,37 т.п.н., из

ПААГ экстрагируют элюирующим буфером (150 мМ NaCI, 50 мМ Трис-HCI, рН 7,5, 2 мМ

ЭДТА) в течение ночи при комнатной температуре, очищают на колонке с 4Е-АЕ-целлюлозой и осаждают 2,5 объемами этилового спирта.

Секвенирование 1 экзона онкогена

HRAS1 плазмиды pHRASTh-3 методом Максама-Гильберта.

ДНК метят по 3 -концу 32Р дАТФ при помощи фрагмента Кленова. 10 мкг меченой

ДНК растворяют в 20 мкл Н О и распределяют по 5 мкл в 4 пробирки, стоящие во льду.

В первую пробирку, где проводят химическую реакцию по гуанину, добавляют 14 мкл

НгО и 0,5 мкл 20 диметилсульфата; во вторую — по гуанину и аденину — 14 мкл НгО и 19 — концентрированной муравьиной кислоты; в третью — по цитозину и тимину — 20 мкл HzO и 25 мкл гидразина; в четвертую 15

55 мкл 5М LiCI и 1 М ЭДТА мкл гидразина.

Химические реакции продолжаются: в первой пробирке — 6, в третьей и четвертой — 8, во второй — 2 мин. Температура реакции во второй пробирке 22 С, а в остальных — 10 С.

По окончании реакции в каждую пробирку добавляют по 500 мкл 2 LICI04 в ацетоне и два объема этилового спирта. После центрифугирования при 12000 об/мин в течение

10 минут осадок растворяют в 500 мкл ацетона, содержащего диметилсульфат. Пробирки встряхивают несколько раз, центрифугируют при l2000 об/мин 80 мин.

Осадки промывают 2 раза 80 раствором этилового спирта, добавляют по 50 мкл 1М пипередина, инкубируют 40 мин при 90 С, осаждают 2 раствором LICI04 в ацетоне, промывают ацетоном и 80 этиловым спиртом. Осадок растворяют в таком количестве буфера нанесения, чтобы в 1 мкл содержалась ДНК с активностью 20000 имп/сек.

Разделение нуклеотидов проводили в 8 растворе ПААГ. Радиавтографию гелей проводят в кассетах в стандартных условиях.

Полученная карта плазмиды сравнена с картой онкогена HRAS1, выделенного из рака мочевого пузыря человека (Shih С„

Weinberg R. Isolation of à transforming

sequence from a human bladder carcinoma сеИ line. Cell, 1982, К 29, P. 161 — 169), Оказалось, что клонированная в pHRASTh-3 последовательность HRAS1 имеет ту же замену 6 на Т в 12 кодоне онкогена, что и в гене HRAS1 рака мочевого пузыря.

На фиг.1 показан электрофоретический анализ рекомбинантной плазмидной ДНК

pHRASTh-3. 1, 4 — ДНК фага Л, рестрицированные эндонуклеазами EcoR1 и Hindlll, соответственно; 2 — ДНК pHRASTh-3, рестрицированная эндонуклеазой BamH1: верхний фрагмент — онкоген HRAS1, нижний фрагмент — вектор pSP64; 3 — вектор

pSP64; на фиг.2 — схема плазмидной ДНК

pHRASTh-3 с рестрикционной и генетической картами.

Плазмида pHRASTh-3 содержит вставку онкогена HRAS1 карциномы щитовидной железы человека (незаштрихованная область), в которой цифрами НЧ обозначены экзоны онкогена и указано положение области вариабелных тандемных повторов (ВТП), полилинкер фага М13 (заштрихованные области), промотор фага SP6 (темная область), ген устойчивости к ампициллину (светлая область) с указанием в нем сайтов узнавания различных рестриктаз. На фиг.3 — первичная последовательность нуклеотидов, окружающих 12 кодон фрагмента онкогена HRAS1 в плазмиде pHRASTh-3, полученная по методу Максама и Гилберта

1815273

Z 3

Л. 10

9. 40

5. 55

4.37

2. 30

2, 05

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pHRASTh-3, кодирующая онкоген HRAS-1 карциномы щитовидной железы человека, размером 9,7 т.п.н., содержащая:

BamH1 — BamH1-фрагмент ДНК карциномы щитовидной железы человека в антисмысловой ориентации, размером 6,7 т.п.н.;

BamH1 — BamH1 — ДНК вектора pSP64, размером 3,0 т,п.н.; уникальные сайты рестрикции;

Бч 1, Крп 1, Pvk 11, Xho 1, Bam Н1, и ромотор фага SP 6 и полилинкер фага

М13, генетические маркеры: ен AP — ген устойчивости к ампицил2 лину.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pHRAST-3, заключающийся в том, что ДНК карциномы щитовидной железы человека и бактериофа5 га il47,1 расщепляют рестриктазой BamH1, обрабатывают ДН К-лигазой, упаковывают в фаг и инфицируют им клетки бактерий

Escherichla соИ Q 359, затем путем гибридизационного анализа отбирают рекомбинан10 тные фаги, содержащие онкоген, ДНК гидролизуют рестриктазой BamH1 и лигируют с ДНК вектора pSP64 по сайту

BamH1, полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli, 15 отбирают клоны, гибридизующиеся с онкогеном HRAS1 человека, и выделяют целевую плазмиду.

1815273 Р6 лРв чбю

XmaI

Редактор В. Трубченко Техред М, Моргентал Корректор M. Ткач

Заказ 1618 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101