Способ дифференциации энтеровирусов

 

Использование: вирусология, медицина . Сущность изобретения: к культуре клеток амниона человека добавляют отдельно нифан, бслфтазид, их смесь и гуапидин гидрохлорид . Затем добавляют исследуемый материал. После инкубации определяют цитопатичсское действие, Балфтазид устанавливает наличие вирусов Коксаки В и ECHO, нифан-Ешрусы полиомиелита, смесь нифана и белфтазида и отдельно гузнидин гидрохлоридвирусы Коксаки А. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕНбОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ б (21) 4877385/13 (22) 23.10.90 (46) 30.06.93. Бюл. М 24 (71) Молдавский научно-исследовательский институт профилактической и клинической медицины (72) К.И.Спыну и В.П.Вуткарев (56) Инструкция по применению нифана и белфтазида для идентификации энтеровирусов полиомиелита. Коксаки В и ЕНСО.

Утв. 18.11.86. (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭНТЕРОВИРУСОВ

Изобретение относится к медицинской вирусологии и люжет быть использовано для дифференциации энтеровирусов: полиомиелита, Коксаки А, Коксаки В и ECHO.

Целью изобретения является повышение точности дифференциации энтеровирусов, Для реализации этой цели используют гидрохлорид гуанидина. способного подавлять репродукцию пикорновирусов, в т.ч. и вирусов группы Коксаки А. Отсугствие репродукции цитопатогенных изолятов в культуре клеток. поддерживающая среда которых содержит гидрохлорид гаунидина в концентрации 200 мкгlмл и наличие одновременно в культуре клеток, поддерживающая среда которых содержит рабочую концентрацию нифана белфтазида и ихсмеси 10 мкг/мл (при учете контрольных проб), позволяет отнести исследуемый изолят к вирусам Коксаки А.

Способ иллюстрирует следующий пример: проводили дифференциацию 36 изолятов, выделенных от больных,, Ы„„1824441 А1 (57) Использование: вирусология, медицина. Сущность изобретенил: к культуре клеТоК амниона человека добавляют отдельно нифан, белфтазид. l1x смесь ll гуанидин гидрохлорид. Затем добавляют исследуемый материал, После инкубации определяют цитопатическое действие, Балфтэзид устанавливает наличие вирусов Коксаки В и ЕСКО, нифап-вирусы полиомиелита, смесь нифана

L1 белфтазида и отдельно гуанидин гидрохлорид — вирусы Коксаки А. 2 табл. полиомиелитом, серозным л1е ингитом, герпангиной отдельно и в ассоциации, а также из образцов проб окружающей среды (сточные соды, вода открытых водоемов), Приготовление перевнваемой культуры амниона человека Fl .

Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженныл1и границами между клетками.

Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-лерсеном. Длл этого приготавливают смесь равных объемов 0,25, раствора трипсина и раствора иерсена, подогревают ее в водяной бане до 30 — 350C. Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальцил и магнил. Затем теплой смесью (трипсин-версен) заливают монослой культуры клеток так, чтс бы все участки были покрыты жидкостью, В матрасы обьемом 100, 250 и 1000 мл раствор добавляют, 1024441 соответственно, по 10, 15 и 30 мл, Матрасы вгтряхивают и помещают в тйрмостат (37,0 С) на 15--20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Крупные конгломераты клеток дисптргируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин. при

2000 об/мин., смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клегок подсчитывают в счетной камере Го- ряева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток, В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла; среду 199, Игла-МЕМ, 0,57; гидролизат лактальбумина и др., с добавлением телячьей сыворотки или cblворотки крупного рогатого скота (10;ь-ной) и антибиотиков. Перевиваемые клетки (FL) разливают в пробирки по 1,0 мл. Для поддер>кивания роста клеток используют те же вышеприведенные питательные среды беэ добавления сыворотки. В ппобирках среду меняют через 4-ро суток культивирования клеток, Обновление спло,иного монослоя клеток новой генерации наблюдали через

5-6 суток, Приготовление рабочей концентрации растворов ниофана, белфтазида и их рабочей смеси, Обьемы рабочих растворов готовят в зависимости от количества типируемых изолятов. Препараты при разведении трижды перемешивают пипеткой, объемом 10,0 мл.

Исходные растворы из вскрытых ампул хранятся в стеклянных емкостях с притертыми пробками при 4+:2 С до 60 суток. а рабочие растворы не хранятся.

Для приготовления рабочего раствора нифана. используемого в опыте, во флакон с 49,9 +0,1 мл поддерживающей среды добавляют 0,1+0,01 мл содержимого ампулы, Аналогичным образом готовят рабочий раствор белфтазида. Это пример приготовления 50,0 мл рабочего раствора с концентрацией 10,0 мкгlмл. Смесь соединений получают путем объединения равных . обьемов нифана и белфтазида в рабочих концентрациях 20 мкг/мл, Приготовление рабочей концентрации гидрохлорида-гуанидина.

Объем рабочего раствора готовят в зависимости от количества типируемых изолятов. Отвешивают 20,0 мг гидрохлорида гуанидина, высыпают 0 стерильный флакон и добавляют поддержи вющу о среду да

100,0 мл. Раствор стерилизук1т через асбестовый фильтр. Это пример приготовления

100,0 мл рабочего раствора гидрохлорид-гуанидина с концентрацией 200,0 мкг/мл.

Титрование вируссодержащего материала.

Титрование изолятов, подлежащих дифференциации, проводят в культуре клеток

FL методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражали в Ig

ЦПДщ. Для титрования изолятов вначале готовят различные их разведения, обычно десятикратные от 10 до 10 . Bo все про-1 бирки вносят по 9,0 мл стерильного физио15 логического раствора или раствора Хэнкса.

Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вируссодержащего материала и получают разведение 10 (1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тща20 тельно перемешивают и 1,0 мл переносят в вторую пробирку, получая разведение 10 (1:100) и т,д. Перед заражением монослоя культуру FL иэолятами, предварительно производят 3 раза отмывание культур клеток от сыворотки раствором Хэнкса, рН 7,5 или раствором Эрла, рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал

30 вносят на монослой клеток в объеме 0,1 мл, а затем клетки инкубировали при 37,0й

+О,1 С в течение 60 минут, после чего вносят поддерживающую среду беэ сыворотки.

Инкубирование зараженной культуры производят при 37,0+0.1 С. Состояние эара>кенной культуры периодически проверяют под микроскопом в течение 7 дней, Результат цитопатического действия ЦПДю изолята считают положительным, если не менее

40 половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации. Титр (50,0 эффективной дозы) вычисляют по методу

Рида-Менуа.

Дифференциацию вирусов проводят по

45 следующей схеме; в пробирку с культурой клеток, освобожденных от ростовой среды, заливают по 1 мл поддерживающей среды, содержащей отдельно нифан, белфтазид и их смеси и гидрохлорид гуанидина в рабочей концентрации (по 4 пробирки), Затем вносят в каждую пробирку исследуемый материал в объеме 0,1 мл с активностью 100

ЦПД5о.

В опыте ставят следующие контрольные

55 пробы

1. Неинфицированную культуру клеток с раствором нифана.

2. Неинфицированную культуру клеток с рвствором белфтвэидв.

1824441

3. Неинфицированную культуру клеток со смесью растворов нифана и белфтазида, 4. Неинфицированную культуру клеток с раствором гидрохлорида гуанидина.

5. Неинфицированную культуру клеток с поддерживающей средой.

6. Культуру клеток, инфицированную исследуемым материалом в обьеме 0.1 мл, активностью 100 ЦПД5о с поддерживающей, средой.

Для каждой контрольной пробы используют по 2 пробирки с культурой клеток.

Учет результатов.

Определяют степень защиты культуры клеток нифаном, белфтазидом и гидрохлоридом гуанидина от цитопатического дейст10

20 вия (ЦПД) исследуемого материала по сравнению с таковым в контрольных пробах, в присутствии поддерживающей среды без нифана, белфтаэида и гидрохлорид-гуанидина. Просмотры культуры клеток проводят через 24, 48 и 72 часа под соетооым микроскопом. Результаты учитывают при регистрации в контрольной пробе исследуемого материала ЦПД на 3-4 креста. В неинфицированных контрольных пробах клеток ЦПД должно отсутствовать, При наличии токсических изменений в культуре клеток в вышеперечисленных контрольных пробах со стороны нифана, белфтазида и их смеси результаты не учитывают и опыт повторяют с дозой, равной 1/2 либо 1/4 рабочей концентрации. При наличии подобных изменений со стороны гидрохлорида гуанидина вместо 200,0 мкгlмл используют рабочую дозу 150.0 мкг/мл. Белфтазид устанавливает принадлежность идентифицируемых агентов к группе вирусов Коксаки

В и ЕСНО, нифан — к вирусу полиомиелита, смесь нифана и белфтазида — к вирусам полиомиелита ECHO и Коксаки В, а смесь нифана с белфтазидом и отдельно гидрохлорид гуанидин — к группе вирусов Коксаки А (табл.), В реэул ьтате дифферен циа ции 32 изолятов от больных энтеровирусными инфекциями, а также из образцов окружающей среды установлено следующее: 8 относились к вирусу полиомиелита, 18 — к группам вируса Коксаки В и ECHO. 2 — к вирусам полиомиелита, Коксаки В и ЕСНО, остальные 4 изолята относились к группе вирусов

Коксаки А.

При сопоставлении реэультатоо дифференциации энтеровирусоо с аналогичными. полученные в результате использования общеизвестных приемов идентификации(в реакции нейтрализации и встречного иммуноэлектрофореэа с типоспецифическими иммунными сыворотками к энтеровирусам, производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов), отмечалось полное совпадение.

Так, иэ 8 изолятов вируса полиомиелита два штамма относились к типу 1, остальные 2 и 4 к типам ll и И1, Из 18 изолятов, принадлежащих к вирусам Коксаки В и ЕСНО: 4 штамма относились к вирусу Коксаки

В1, 3 — Коксаки В3, 2 — Коксаки В6, 6 — к вирусу ЕСНО 6, остальные 3 штамма — к вирусу ECHO 7. Из 2 изолятоо оирусов, принадлежащих к группе вирусов полиомиелита, Коксаки В и ЕСНО, были идентифицированы доа штамма вируса полиомиелита типов fl и ill, по одному штамму

Коксаки ВЗ и ЕСНО 6. Остальные 4 иэолята. относящихся к вирусам Коксаки А,были идентифицированы как Коксаки А7 (два штамма), Коксаки А9(один штамм) и Коксаки

А11 (один штамм).

Таким образом, осуществление дифференциации энтерооирусоо по предлагаемому способу является приемлел1ым для любой оирусологической лаборатории ввиду несложности технологических приемов, не связано с дополнительны и экономическими затратами и обладаег повышенной точностью, так как помимо известных групп энтерооирусоо позволяет выявить дополнительную группу вирусов — Коксаки А.

Формула изобретения

Способ дифференциации энтеровирусов, оключающий заражение культуры клеток амниона человека, добавление в пробы нифана, белфтаэида или их смеси с последующей дифференциацией вирусов полиомилеига, Коксаки В и ECHO no цитопатическому действию, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что. с целью расширения функциональных возможностей способа путем выявления вируса Коксаки А, параллельно в до пол нител ьную пробу добавляют гидрохлорид-гуанидин и дифференцируют вирус

Коксаки Л от других вирусов по отсутствию цитопатического действия.

1824441

Таблица 1

Ин и и ованные клетки

Неин и и ованные клетки

Прибелф- гуанитаэид дин белф- гуанитаэид дин нифан нифан среда смесь нифанаи белфтээидэ смесь нифанаи белфтаэида среда. надлежность штамма к роду (группе) энтеровирусов

2.Культура клеток

2. То же самое

Варианты. воэможные при учете реэультатов опыта

П р и м е ч а н и е: — отсутствие дегенерации клеток;

+ дегенерация клеток на 3-4 креста, Таблица 2

Характеристика способа-прототипа и предлагаемого способа идентификации антеровирусов

Набор материалов и реактивов

I.Èýîëÿòû,подлежащие идентифи- I. То же самое кации. полиомиелит

ЕСНО.

Коксаки В полиомиелит

ЕСНО, Коксаки В

КоксакиА не антеровирус, либо смесь вирусов

1824441

Продолжение табл,2

3.Диагностические препараты . нифан, белфтаэид

3. Диагностические препараты: нифан, белфтаэищ, гццрохлорид гуанидина

4.Световой микроскоп

4. То же самое

Биологические свойства

I.Íèôàí - подавляет репродук- I. То же самое цию вируса полиомиелита

2.Белфтазид - подавляет репро- 2. То же самое дикцию вирусов Коксаки В и

ЕСТ

3.Смесь нифана и белфтаэида 3. То жв самое подавляет репродукцию вирусов полиомиелита, Коксаки В и ИХНО

4.Нифан и белфтазид (их смесь) 4.Гидрохлорид гуанидина подавляет не подавляют репро репродукцию пикорновирусор, в вирусов Коксаки А т.а. вирусов Коксаки А (4) Назначение

Дифференциальная диагностика вирусов полиомиелита, Коксаки А и В, пилеле пвх ие проб от болейпх и здоровых людей (фекалий, носоглоточные смывы, кровь, спйнио--мозговая жидкость), объекты окружающей среды (сточные воды, вода открытых водоемов и т.пе) дифференциальная диагностика вирусов полиомиелита, Коксаки

В и ECHO щщеленных из проб т больных и здоровых людей фекалии, носоглоточные смывы, кровь сйинно-мозговая жидкость| обьекты окружающей среды (сточные роды, вода открытых водоемов) и т.п.

Способ применения

Технология осуществления спо- Технология предлагаемого способа соба, учет результатов деталь- предусматриввет,помимо известных но описаны в прилагаемой ин- инградиентов, дополнительный -приструкции (I) готовление рабочего раствора гидрохлорида гуалидина

Стоимость препаратов

Кооператив "Диагиостикум" при То же самое

Львовском НИЛ гематологии и переливания крови реалиэует ,, препараты по цене: " ифан"-I руб. эе I мл O,Я Стоимость гидрохлорид г ина: раствора, I мл, содержащий 200 гидроБелфтаз ц" — I руб. эа I мл хлорйд гушщцина)0,0002l коп.

О,цй раствора; иэ расчета Х,О кг ю IO руб. бО коп.

0аесь "Нифана" и Ъелфтаэида"- Всего! 4 0 + 0,0002I коп. 4,0руб.—

2,0 руб. - 0,00021 коп. (практически не отличается от прототипа)

Bcего: 4,0 руб.

1824441

Продолжение табл.2

Точность дифференциации

Способ-прототип устанавливает прин щлежность энтвровирусов к следующим группам.

I. Полиомиелит

I, Полиомиелит

2. ЕСНО, Консаки В 2. E(HO, Коксаки В

В 3. Полиомиелит, EQi0, Коксаки В

4. Коксаки А

3. Полиомиелит, EGH0, Коксаки

4. Не энтеровирус либо смесь вирусов б. Не энтеровирус либо смесь вирусов

Дифференциация по упрощенной схеме

Если sseovo смеси "Нифан" + "Белфтаеид" испольэовать гидрохлорип гуайидина, то дифференциал антеровиигсов мокко проиавести ка уровне следуиирю групп (см.табл.):

I. Полиомиелит

Не всеночно

2. EGA, Коксадд В

3. Полиомиелит, Е(НО, Коксаки А g В

4. Нв энтеровирус, либо смесь вирус

Следовательно, смесь "Нифан" 4- "Белфтаз щ" ножыо еаменить раствором гидрохлорида гуанидина. В этом случае стоимость препаратов составляет

2 руб.; 0,0002Г вместо 4,0 руб.

Составитель К.Спыну

Техред M.Mîðãåíòàë

Корректор В.Петраш

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2216 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб„4/5