Способ получения производных пептидов ws-9326 а

 

Использование: в фармакологии, поскольку получаемые пептиды-антагонисты к веществу Р, антагонисты к нейрокинину А (вещество К), пригодны для профилактики и лечения астмы. Сущность изобретения: способ получения производных пептидов WS- 9326А формулы 1 снсвшои, R-Thr-N((0)-Leu-DPhe-QU0Thr(R AsnSer(R ) где Р1-ар(низший) алканоил с Cs-алкилом в орто-положении; R2-H, низший алканоил, путем восстановления соединений общей формулы I, где R -ар(низший}алкеноил с Cs- алкенилом в ортоположении; Р2-значения указаны выше. 7 табл.. 10 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Способ.

Π— R

2

НС 0

A,— — Т а (21) 4613896/04 (22) 04.04.89 (46) 07.07.93. Бюл, М 25 (31) 8807921.5 (32) 05.04,88 (33) 6В (71) Фудзисава Фармасьютикал Ко., Лтд. (1 1 ) (72) Тохру Кино, Мотоаки Нисикава, Масами

Изаки и Сумио Кийото (JP) (56) Шредер Э., Любке К. Пептиды. М,: 1у1ир, ч.1, 1967, с. 116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ПЕПТИДОВ WS-9326A (57) Использование: в фармакологии, поскольку получаемые пептиды-.антагонисты к

И зобретение касается способа получения пептидных производных WS-9326 А, которые обладают фармакологической активностью, такой как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (вещество К). или тому подобным.

Целевые производные пептида WS9326 А согласно изобретению могут быть представлены следующей формулой l

Й -ТЬ-й-С-C-Leu-D-Phe-аИо-ть -Ash-$сг Ol ь Н3 где R ь представляет собой ар(низкий)алканоил, имеющий С5-алкил в орто-положении и R -водород или низкий алканоил.

Согласно изобретению пептидные производные WS-9326A формулы 1 могут быть получены следующим способом... Ж 1826970 А3 (я)з С 07 К 7/06, 7/52//А 61 К 37/02 веществу Р, антагонисты к нейрокинину А (вещество К), пригодны для профилактики и лечения астмы. Сущность изобретения: способ получения производных пептидов WS9326А формулы 1

-ьСНС6ньОВ1

Й-т г-н(снь -с-с(0)-сала-0Рье-оп >т ц,(я21дз зй ®1) где R -ар(низший) алкэноил с С5-алкилом в

1 орто-положении; R -Н, низший алканоил, 2 путем восстановления соединений общей формулы 1, где R -ар(низший) алкеноил с С51 алкенилом в ортоположении; R --значения указаны выше. 7 табл., 10 ил.

-В (1()

B0CCTAHOBAEH«Å

С)

R2 й2

1 ()

R -Tht È-С- С-Leu-D-РЬе-ОИО -ТЬ1 — АБп-Se t

Ь где R в и R имеют значения, указанные вы2 ше.

1826970 г"

R а означает ар (низкий) алкенаил с Салкенилом в арто-положении.

Способ получения целевого соединения формулы I пояснен ниже.

С п особ..

Соединение I или его соль можно получить, подвергая восстановлению соединение ll или его соль.

Подходящими катализаторами, используемыми при каталитическом восстановлении, являются традиционные восстановители„также как платиновые катализаторы (т.е, платиновая пластинка, губчатая платина, платиновая чернь, коллоидная платина, окись платины, платиновая проволока и так далее), палладиевые катализаторы (т.е, губчатый палладий, палладиевая чернь, окись палладия, палладий на угле, коллоидный палладий, палладий на сульфате бария, палладий на карбанате бария и так далее), никелевые катализаторры (т.е. измельченный никель, окись никеля, никель Ренея и так далее), кобальтовые катализаторы (т,е. измельченный кобальт, кобальт Ренея и так далее), железные катализаторы (т,е. измельченная медь, медь

Ульмана и так далее) и тому подобные, Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как ацето, диоксан, спирт, тетрагидрафуран, этилацетат, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию.

Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах ат охлаждения до нагревания.

Исходные соединения И и И! являются новыми и могут быть получены следующими способами.

Исходное соединение 1! — новое, может быть приготовлено путем следующих процессов синтеза и фермен гации. (Продукт процессов синтеза)

СпоспбА.

О-К

2 б нс о R

II II I

1-1--тЬ-И-С-С-Leu-D-1 1а;QI,I.0 Th Азн 8е ! сн, Q2

I или его реакционное производное при аминогруппе или его соль

О-R" !

Г АЦИАИРОВАНИЕ т 2 с О

R я и 1

gI — 1 hh-11-q-c-1.ЕЦ-Q-phe-QÈО Thr-Аэп Set

Q 1

СН»

Способ В.

OH

Ф

HC О R (l1 11 1

R -T hr-N- С- С-! ец-D-РЬе-а АЛЛО- -(hr — АЬп- $ет

СН, 10 (! Ia) дциАиРвВАни

НС

1 И И

R -Thr-N-С-С-Leu — D-Phe-аИ

G 1 (!! b

1 2

20 где R> и Rимеют значения,,указанные выше;

R — низший алканоил.

С и о с о б А.

Соединения Il могут быть получены пу25 тем реакции ацилиравания соединения !!! или его реакционноспособного производного при аминогруппе или ега соли.

Походящее реакцианноспособное производное при аминогруппе соединения !!!

ЗО может включать основание Шиффа иминного типа или его таутамерный иэомер анаминового типа, полученное при реакции соединения III с карбонильным соединением, таким как альдегид, кетон и тому подо35 бное; силильное производное, полученное взаимодействием соединений !! с силильным соединением, таким как био-(триметилсилил)ацетамид, моно-(триметилсилил)-ацетамид, био-(триметилсилил)-мочевина или тому по40 добными; производное, образованное при взаимодействии соединения II I с треххларистым фосфором или фасгеном и тому подобными.

Подходящее ацилирующее средство, 45 используемое в настоящей реакции ацилирования, может включать традиционное ацилиру ащее средство может быть выражено формулой

R а СН (Х!Ч)

5О где R а .имеет значение, определенное ра1 нее) или ега реакционноспособное производное или его соль.

Подходящее реакционноспособное производное соединения формулы (XIV) мо55 жет включать галоидангидрид, ангидрид кислоты, активированный амид. активированный сложных эфир и тому подобное, Подходящим примером может быть хлорангидрид, азид кислоты, смешанный ангидрид кислоты с кислотой, такой как замещенная

1826970 фосфорная кислота (т.е. диалкилфосфорная кислота, фенипфосфорная кислота, дифенилфосфорная.кислота, дибензилфосфорная кислота, галогенизированная фосфорная кислота и так далее), диэлкил- 5 фосфористая кислота, сернистая кислота, тиосерная кислота, сульфокислота (т,е. метансульфоксилота и так далее), алкипугле10 кислота, алифатическая карбоновая кислота (т.е. пизалиновая кислота, валериановая кислота, изовалериановая кислота, 2-этилмаслянэя кислота или трихлоруксусная кислота и так далее) или ароматическая карбоновая кислота (т;е. бензойная кислота и так далее); симметрический ангидрид кислоты, активированный амид с имидазолом, 4-замещенный имидазол, диметилпиразол, триезол ипи тетрэзол; или активированный сложный эфир (т.е. цианометиловый сложный эфир, метаксиметиловый эфир, диметилиминометиловый эфир ((CH>AN =СН-) пропаргиловый эфир, пэранитрофениповый эфир, 2,4-динитрофениловый эфир, трихлорфениловый эфир, пентахлорфениловый эфир, метилсульфонилфениловый эфир, фенилазофениловый эфир, фениповый тиоэфир, и-нитрофениловый тиоэфир, и-трезиловый тиоэфир, карбоксиметиповый тиоэфир,пираниловый эфир,пиридиловый эфир, пиперидиловый эфир, 8-хинолиловый тиоэфир и так далее) или сложный эфир с N-оксисоединением (т,е. N,N-диметил гидроксилами н, 1-окси-2(1 Н)-пи ридо н, N-оксисукцинимид, N-оксифталимид, 1-окси-6-хлор-1Н-бензотиазоп и так далее) и тому подобны). Эти реакционноспособные производные могут быть необязательно выбраны из них в соответствии с видом используемого соединения формулы (XIV).

Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком кэк спирт (т.е. метанол, этанол и так далее), ацетон, диоксан, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N,N-диметилформамид, пиридин или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию. Этот традиционный растворитель может быть также использован в смеси с водой, Если соединение (XIV) используют в форме свободной кислоты ипи в форме ее соли в этой реакции, то реакцию предпочтительно проводят в присутствии традиционного конденсирующего средства, такого как

N,N -дицикпогексипкарбодиимид, N-цикло1 гексил-N -морфопиноэтилкарбодиимид, N1 циклогексип-N (4-диэтиламиноциклогексил)1 карбодиимид, N,N -диэтилкарбодиимид, 1

N.N -диизопропилкарбодиимид, N-этил-N1 1 (З-диметиламинопропип)-карбодиимид, N, N-ка рбон ил бис-(2-метили мида зол), пен15

55 таметилен кетен-N-циклогексиламин, дифенилкетен-N-циклогексилимин, этоксиацетилен, 1-алкокси-1-хлорэтилен, триалкилфосфит, этипполифосфат, изопропиловый эфир полифосфорной кислоты, оксихлорид фосфора (хлористый фосфарин), треххлористый фосфор, хлористый оксалкил, трифенипфосфин, хлористый тионип, соль 2-атил-7-оксибенэилоксазолил, гидроокись 2-этил-5-(мета-сульфофения}-изоксазолил, внутримолекулярная соль, 1-(и-хлорбензопсупьфонилокси)-6-хлор-1 Н

-бензотриазол, так называемый реактив

Вильсмайера, полученный взаимодействиeM N,N-диметилформамида с хлористым тионилом, фосгеном, трихлорметиловым эфиром хлормуравьиной кислоты, оксихпоридом фосфора, и подобные.

Реакция может быть также проведена в присутствии неорганического или органического основания, такого как бикэрбонат щелочного металла, три(низший)алкиламин, пиридин, N-(низший)алкилморфолин, N,Nди(низший)элкилбензиламин. Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до комнатной температуры.

С и особ В.

Соединение !! или его соль могут быть получены путем реакции ацилирования соединения !!э или его соли.

На эту реакцию имеется ссылка в Получениях 29 31, описанных позднее. (Получение ферментацией)

WS-9326А можно получить ферментацией WS-9326A продуцирующих штамма, принадлежащего к роду Streptomyces, такому как Streptomyces Violaceoniger N 9326 в и итател ь н ой с р еде.

Специфические микроорганизмы, использованные дпя получения WS-9326A, будут описаны в дальнейшем.

Микроорганизм.

Микроорганизм, который может быть использован для продуцирования WS9326А, является штаммом-продуцентом

WS-9326A, принадлежащим к роду

Streptomyces. из которого Streptomyces ч!о!асеоп!цег N. 9326 недавно был выделен из твердого образца. находящегося в коллекции Suwa City, Nagano Prefecture, Japan, Лиофипизированный образец вновь выделенного Streptomyces vlolaceoniger N

9326 депонирован в Научно-исследовательском институте агенства промышленных знаний и технологии (1-3, Higshi !-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken 305, Japan) под номером ЕРМ ВР-1667 (дата депонирования:

20 января 1988 r.).

1826970

Понятно, что продуцирование новых

WS-9326А не ограничивается описываемым здесь конкретным организмом, который приведен лишь в целях иллюстрации, Это изобретение включает также использование любых мутантов, которые способны продуцировать NfS-9326А, включая природные мутанты, а также искусственные мутанты, которые могут быть получены от описанного здесь организма традиционными средствами, такими как облучение рентгеновскими лучами, ультрафиолетовым излучением, обработка N-метил-N -нитро1

M-нитрозогуанидином, 2-аминопурином и тому подобными. Streptornyces

vioiaceonlger № 9326 имеет следующие морфологические, культуральные, биологические и физиологические характеристики, (1) Морфологические характеристики, Были использованы методы, описанные

Ширлингом и Готлибом (Shlrling Е. В. and

ОопПеЬ О). Методы для характеристики видов Streptomyces. — International Journal of

Sistemate Bacteriology, 16, 313-340, 1966) для этого таксономического исследования.

Морфологические наблюдения были выполнены на оптическом и электронном микросхемах на культуре, выращенной при

30 С в течение 14 дней на агаре с дрожжево-солодовым экстрактом, на агаре из овсяной муки, на агаре из крахмала и неорганических солей.

Вегетативный мицелий развит хорошо без фрагментации. Воздушный мицелий разветвлен моноподиально и образует спиральные цепи спор с 10 — 30 спорами на день.

Споры имеют гладкую поверхность и овзль ную форму с размерами (0,6 — 0,8)х(0,8 — 1,3) мкм, Отвердевших гранул, спорангия и зооспор не наблюдали. (2) Культуральные характеристики

Культуральные характеристики наблюдали на десяти видах сред, описанных Ширлингом и Готлибом в упомянутом выше источнике и Ваксманом (Nfaksman S. А„ The

actinomycetes vol, 2: Classification, identiaication and description of genera and

species. The Nfilliams and Nfiinins G., Baitimore, 1961).

Выращивание проводили при 30 С в течение 21 дня. Названия цвета, использованные в этом исследовании, взяты из колориметрического руководства Метуэна (Когпегар А. and I. H. Nfanscher: Methuen

Handboon of colour, methuen, London, 1978), Результаты представлены в табл. 1, Воздушный мицелий имел окраску от серого до коричневато-серого цвета. Часть колонии становилась черной и влажной и

10 гидролизатов штамма N 9326 показал при20 сутствие LL-диаминомимелизовой кислоты.

Следовательно, клеточная стенка этого — штамма, по-видимому, типа 1. (3) Биологические и физиологические свойства.

25 Физиологические свойства и усвоение источников углерода показаны в табл, 2 и 3 соответственно.

Использование источников углерода определяли методами Придхема и Готлиба (Pridham

30 T. G. and Gotlieb. Использование углеродных соединений некоторыми актиномицетами как вспомогательное средство определения видов. — I, Bacteriol„56, 107-114, 1948).

Морфология и химические характери35 стики штамма ¹ 9326 позволяют четко отнести организм к роду Streptomyces. Штамм №

9326 сравнивали с видами Streptomyces, 40

55 показывала гигроскопические свойства на большинстве агаровых сред. Обратная сторона культуры была желтовато-коричневая, коричневая и темно-коричневая. Пигмент мицелия обратной стороны не чувствителен к рН среды. Меленоидные пигменты и другие растворимые пигменты не продуцируют, Анализ клеточных стенок был выполнен по методам Беккера и соавторов (Beeker В, М,Р. 1echevalier, R. Е, Gordon and

H.À.Lechevalier. Быстрая дифференциация между Nocardio u Streptomyces хроматографией на бумаге цельного клеточного гидролизата. Appl. Microbiol, 12, 421-423, 1964 и

Ямагуши Janaguchl, T. Сравнение состава клеточных мембран морфологически различных актиномицетов. — I. Bacteriol, 89, 444-455, 1965). Анализ цельных клеточных описанными в 8-м издании руководства Бергея (Buchanan R, Е. and N, Е. Gibbons

Bergey s manual of determinative

bacteriology/,сщЫ edition, The Wililams and

NfIIkIns Со, Baltimore, 1974), с видами

Streptomyces, описанными в докладах Ширлинга(Shirling, E. В. and 0. 6опИеЬ 1. Совместное описание типичной культуры

Streptomyces. 2, Описания видов по результатам первого исследования. Intern, 1, Syst.

Bacteriol., 18, 69-189, I968). ($ЫгИпц Е. В.

and Р. Gcttlleb: 1.Совместное описание типичной культуры Streptomyces). 2. Описания видов по результатам первого исследования, Intern, I, Syst. Bacterial. 18; 69-189, 1968). (3ЫгНп9 Е,B, and D.Gott8eb: Совместное описание типичной культуры

Streptomyces), 3, Дополнительные описания видов по результатам первого и второго исследований. Intern. 1. Syst. Bacteriol. 18: 279392, 1968 и ($ЫгИп9 Е. В. and О, Gottlieb:

Совместное описание типичной культуры

$хгертотусез).

1826970

5

35

4. Описания видов по результатам второго, третьего и четвертого исследований

Intern. I. Sy t. Bacteriol, 19; 391 — 512, 1969, с видами, внесенными в "Уточненные перечни названий бактерий: (Skerman, Ч. В. 0; V.

MeGowan 8 P.Н.А. Sneath: Уточненный список бактериальных названий. Intern. I. Syst.

BacterioI: 30, 225-420, 180), и с видами, описанными в других источниках (Wil(lams S. T., М. Goodfellow, G. Alderson, Е. M. Н. Wellington, P. Н. А, Sneath and M. I. Sackln; Численная классификация Streptomyces и родственных родов. 1. Gen. IVlicrobloI, 129: 1743 — 1813, 1983) и /DIetz, А: Критерии для характеристики гигроскопических штаммов, опубликованы в

Actinomycetes; The Boundary Microorganisms с. 183 — 191, изданный в 1976).

В результата сравнений было установлено, что штамм ¹ 9326 имеет близкое сходство со Streptomyces violaceoniger, Поэтому штамм N 9326 был идентифицирован как

Streptomyces violaceoniger и назван

Streptomyces violaceoniger № 9326.

Получение WS-9326А.

Новые WS-9326A согласно изобретению могут быть получены выращиванием штамма-продуцента О/5-9326А, принадлежащего к роду Streptomyces (т.е. Streptomyces

violactoniger N 9326, EPM ВР— 1667) 8 питательной среде.

В общем WS-9326А могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS9326А в водной питательной среде, содержащей источник усвояемого углерода и азота, предпочтительно в аэробных условиях (т,е. встряхиваемая культура, погруженная культура и так далее).

Предпочтительными источниками углерода в питательной среде являются углеводы, такие как глюкоза, ксилоза, галактоза, глиперин, крахмал, декстрин и тому подобные.

Другими источниками, которые могут быть использованы являются мальтоза, рамноза, рафиноза, арабиноза, манноза, селицин, сукцинат натрия и тому подобные.

Предпочтительными источниками азота являются дрожжевой экстракт, пептон, клейковина, хлопковая мука, соевая мука, экстракт от замачивания кукурузы, пшеничные проростки, высушенные дрожжи, молотое перо, порошок земляного ореха и так далее, а также неорганические и органические соединения азота, такие как соли аммония (т.е. нитрат аммония, сульфат аммония, фосфат аммония и так далее), мочевина, аминокислоты и тому подобные, Источники углерода и азота, хотя и преимущественно используемые в сочетании, не обязательно используются в чистой форме, поскольку менее чистые материалы, которые содержат следы ростовых факторов и значительные количества минеральных питательных веществ, также пригодны для использования. Они могут быть добавлены к минеральным солям среды, таким как карбонат натрия или кальция, фосфат натрия или калия, хлористый натрий или калий, иодистый натрий или калий, соли магния, соли меди, соли кобальта и тому подобные. Если необходимо, особенно когда культуральная среда сильно вспенивается, могут быть добавлены антивспениватели, такие как жидкий парафин, жировое масло, растительное масло, минеральное масло или силикон.

Как условия для получения WS-9326A в. больших количествах предпочтительны аэробные условия погруженной культуры.

Для получения небольших количеств используют встряхиваемые или поверхностные культуры в колбах или бутылях. Кроме того, если выращивание проводят в больших резервуарах, то предпочтительно использование вегетативной формы организма для инокулирования в ферментационные емкости, чтобы избежать латентный период развития культуры в процессе получения

N/S-9326A. Таким образом, желательно сначала получить посевную культуру организма инокулированием относительно малого количества культуральной среды спорами или мицеллэми микроорганизма и выращиванием этой инокулированной среды и затем перенести выращенный вегетэтивный инокулят в асептических условиях в большие резервуары, Среда, в которой получен вегетативный инокулят, аналогична или отличается от среды, используемой для получения WS-9326À.

Перемещение и аэрация культуральной смеси могут быть осуществлены различными путями, Перемешивание может быть проведено лопастями винта или аналогичными механическими мешалками, вращением или встряхиванием бродильного чана, различными нагнетающими устройствами или пропусканием стерильного воздуха через среду

Аэрация может быть осуществлена путем пропускания стерильного воздуха через ферментационную среду.

Брожение обычно проводят при температуре от 20 до 40 С, предпочтительно при

25 — 35 С, в течение времени примерно от 50 о 150 ч, которые могут варьировать в соответствии с условиями брожения и масштабами производства.

Полученные WS-9326А могут быть затем выделены из культуральной среды традиционными средствами, которые обычно используются для выделения других известных биологически активных веществ, Полученные N/S-9326A были найдены в культурэль1826970

Стационарная фаза

Пластина силикагеля (Merck art

5715) Пастина RP18 (Merck) Проявляю- Значение йг щий раство- 0,38 ритель

Хлороформметанол (в отношении 5:1 по объему)

Метанол-вода (в отношении 8 2 по 046 обьему) ном фильтрате и мицелии, таким образом

WS-9326А могут быть выделены и очищены из фильтрата и мицелия, которые получены при фильтрации или центрифугировании культуральной жидкости традиционным методом, таким как концентрирование при пониженном давлении, лиофилизация, экстракция традиционным растворителем, регулирование рН, обработка обычной смолой (т.е, анионо- или катионообменная смола, неионогенная абсорбирующая смола итакдалее), обработка традиционным абсорбентом (т.е. активированным углем, кремниевой кислотой, силикагельцеллюлозой, глиноземом и тому подобными), кристаллизация, перекристаллизация и тому подобные.

WS-9326A, полученный описанным вы-, ше способом, обладает следующими физическими и химическими свойствами, (1) форма и цвет; бесцветный порошок 20 (2) цветная реакция: положительная: на сульфат церия, реакция на пары иода, реакция на хлористое железо (3) — железо (3) цианистый калий; отрицательная: реакция на анигидрин, реак- 25 ция Молима, реакция на хлористое железо (3), реакция Эрлиха, реакция Паули, (3) растворимость: растворим: метанол, этанол,слабо растворим: ацетон, этилацетат нерастворим. 30 вода, хлороформ (4) точка плавления; 187 — 190 С (5) удельное вращение: (а)Я:-84 (С=1,0, метанол) (6) спектр ультрафиолетового поглоще- 35 ния (метанол): Я к =280 пикометров (a=34,700) (7) спектр поглощения инфракрасного излучения (КВг); йиакс=3300, 3050, 2950<

2920, 2860, 1730, 1650, 1610, 1560, 1540, 1530, 40

1510, 1440, 1380, 1340, 1280, 1240, 1170, 1110, 1080. 1060, 1040, 970, 880, 860, 830 см, график которого представлен на фиг, 1. (8) элементный анализ для.

С 54Н68К а О 13 2 Н20, 45

Вычислено : С 60,43; Н 6,76; N 10,44.

Найдено 7 o: С 60,18; Н 6,61; N 10,32. (9) тонкослойная хроматография (10) молекулярная формула: СгдНгяй801з (11) молекулярный вес; АВ-масс-спектр:

mй 1037 (М+Н) (12) свойства вещества: кислое вещество (13) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 130: (100 МГц, СДзОД) д:

175,69 (с), 174,70 (с), 173,73 (с), 173,38 (с}, 172,89 (с), 171,04 (c), 170,45 (с), 167;79 (с), 167,15 (с), 159,20 (с). 140,05 (д), 139.12 (с), 138,71 (c), 135,27 (д), 134,85 (с), 132,11 (д), 132,08 (с), 131,69 (д)х2, 130,70 (д), 129,90 (д), 130,70 (д), 129,90 (д), 129,61 (д)х2, 128,55 (д), 128,04 (д), 127,99 (д), 127,38 (д), 126,09 (с), 123,70 (д), 115,63 (д), 73,46 (д), 71,34 (д), 62,80 (т), 59,53 (д), 56.91 (д), 56,76 (д), 55,55 (д), 53,64 (д), 52,10 (д), 39,85 (т), 37, 18 (т}, 37,09 (т), 34,58 (кв), 31,37 (т), 24,56 (д), 23,63 (т), 22,71 (кв), 22,52 (кв), 21,17 (кв), 17,19 (кв), 14,13 (кв), график которого представлен на фиг.

2. (14) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 1Н, (400 МГц, СДзОД) д:

7,80 (1Н, д, 1=8 Гц), 7,67 (1H, д, 1=16 Гц};

7,45 — 7,14 (9Н, м), 7,06 (2Н, д, 1=8 Гц), (1Н, с), 6,65 (2Н, д, 1=8 Гц), 6,59 (1Н, д, 1=12 Гц), 5,88 (1Н, дт, 1=-12 и 7 Гц), 5,55 (1Н, м, 5,35) (1Н, широкий сигнал}, 5,10 (1H, дд, 1=3 и 9,5 Гц), 4,68 (1Н, д, 1=10 Гц), 4,55 (1Н, т, 1=6 Гц), 4,48 (1 Г, дд, 1=3 и 12.Гц), 3,92 (3,92 (2Н, д, 1=6 Гц).

3,70 (1 Н, т, 1=7,5 Гц), 3,62 (1 Н, м), 3,46 (1 Н, дд, 1=3 и 14 Гц), 2,94 (1Н, дд, 1=3 и 16 Гц), 2,89 (ЗН, с), 2,74 (1Н, дд, 1=9,5 и 16 Гц), 2,69 (1Н, дд, 1=12 и 14 Гц), 2, 14 (2Н, м), 1,5 — 1,4(2Н, м), 1,20 (ЗН, д, 1-6 Гц), 1,08 (3H, д, 1=6 Гц), 1,0 — 0,8 (2Н, м), 0,91 (3Н, т, 1=7 Гц), 0,6 (1Н, м), 0,53 (ЗН, д, 1=6 Гц}, 0,51 (ЗН, д, 1-6 Гц), график которого представлен на фиг. 3. (15) аминокислотный анализ:

WS-9326(5 мг) гидролизовали при 110 С в течение 20 ч с хлористоводородной кислотой (2 мл) в запаянной пробирке. Смесь выпаривали досуха и получали продукты гидролиза, которые затем анализировали на автоматическом анализаторе аминокислот

Хитами 835.

Результаты аминокислотного анализа: треонин (2), лейцин (1), фенилаланин (1), аспарагиновая кислота (1), серии (1), металимин (1) и аммиак (1).

Что касается WS-9326A, то следует заметить, что спектры ядерного магнитного резонанса на ядрах 13С и 1Н, представленные на фиг. 2 и 3, показали, что WS-9326A сущевтвует по меньшей мере в двух стабильных конформациях в растворе СДзОД, и химические сдвиги, описанные в приведенных выше пунктах (13} и (14), является сдвигами основного конформера WS-9326A.

1826970

Из анализа представленных выше физических и химических свойств и по результатам дальнейших исследований по идентификации химической структуры химическое строение WS-9326A идентифици- 5 рована и интерпретировано следующим образом;

WS-932 6A: н О

О и !!

R Thr-!ч-С- С-Leu-D-phe-М1.Оl5

H,ССНН2ССНН2ССНН3 =С н.. и

/(Е)-3-(2-(ф1-пентенил)-фенил)-пропен- 25 аил/

B изложенном и последующем описании настоящей заявки подходящие примеры и иллюстрации различных определений, которые изобретение включает в свай обь- 30 ем, поясняются детально следующим образом.

Термин "низший" означает 1 — 6 углеродных атомов, если не оговорено особо.

Подходящий пример низшего алканои- 35 ла включает формил, ацетил, пропаноил, бутаноил, 2-метилпропаноил; пентаноил, 2,2-диметилпропаноил, гексаноил и т.п.

Подходящий ар(низший)алканоил может включать фенилпропаноил, фенилбута- 40 ноил, фенилиэобутилил, фенилпентаноил, фенилгексаноил и так далее), нафтил(низший)алканоил (т.е. нафтилпропаноил, нафтилбутаноил, нафтилпентаноил и тому подобные). 45

Подходящий ар(низший)алкеноил может включать: фенил(низший)алкеноил (т.е. фенилпропаноил, фенилбутаноил, фенилметакрилоил, фенилпентеноил, фенилгексеноил и так далее), нафтил (низший)алкеноил 50 (т.е. нафтилпропеноил, нафтилбутеноил, нафтилпентеноил и так далее) и тому подобные.

Подходящий Сь алкил может включать пентил и т.п. 55

Подходящий С алкенил может включить 1-. или 2-, или 3-, или 4-пентенил и т.п.

Биологические свойства пептидных производных WS-9326A.

Пептидные производные WS-9326А формулы I и их фармацевтически приемлемые соли обладают фармакологической активностью, такой как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (веществу K), или тому подобными, поэтому они полезны для профилактики и лечения астмы и тому подобного, В качестве примера демонстрации такой фармакологической активности приводятся ниже данные фармакологических исследований. (1) Испытуемые соединения: (а) 0-PrO-G ln-6 ln-0-Trp-Phe-D-Trp-0Тгр-Phe-NHz HCl (ниже называемое октапептидом) (Указанное соединение раскрыто в

European Journal of Pharnacology, 99 (1984)

193 †2). (1) Тетрагидро-WS-9326A (2) Тетрагидротриацетил WS-9326А (11) Методы испытания и результаты: (1) Анализ по степени связывания с радиоактивно меченным лигандом. (а) Изготовление сырой мембраны.

Легкое.

Самцов морских свинок (альбиносов штамма Хартли, 600 г) умерщвляли путем обезглавливания, Затем удаляли трахеи и легкие и хранили их при -80 С вплоть до использования. Перед использованием указанные ткани оттаивали и гомогенизировали в 500 мл буфера (0,25 М сахарозы. 50 MM трис-HCI, pH 7,5; 0.1 мМ ЭДТК) с помощью компактного смесителя (MatsudenMl-761).

Затем ткань гомогенизировали с помощью ультрадиспергатора (Yamato Model LK — 21) с интервалами охлаждения между гомогениэациями. составляющими 10 с(полное время гомогенизации составляло 60 с). После этого гомагенат центрифугировали (900xg за 10 мин) в целях удаления сгустков ткани, а надосадачную жидкость центрифугировали при

14000xg 20 мин, в результате чего получали осадки центрифугирования, так называемые неочищенные мембранные фракции. Эти осадки ресуспендировали в Среде 1, гомогенизированной с помощью тефлонового гомогениэатора, и центрифугировали при

14000xg в течение 20 мин. Полученные осадки хранили при температуре -20 С. (в) Связывание ЗН-вещества Р с подготовленными мембранами. э

Н-вещество (1 нМ, NeW England

Nuclear) инкубировали с 50 мкл мембранного препарата в Среде 1 при 4 С в течение 30 мин в конечном объеме 250 мкл. По окончании периода инкубирования смесь быстро титровали через ватман CF/В стекловолоконный фильтр (предварительно обработан15

1826970 ный О, )%-ным полиэтиленимином в течение

3 ч до его применения), используя сбор клеток (BrandeI M-24S), Затем фильтры промывали 10 раз 3 мл промывочного буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,5) при 0 С. Радиоактивность рассчитывали в 3 мл Аквозола-2 в сцинтилляционном счетчике (Pacxard TRI-CARB

4530). (2) Действие WS-9326А или тетрагидроW$-9326A на трахею морских свинок.

Спиральные полоски трахеи получали от взрослых самцов белых морских свинок линии Хартлен (600 г) стандартным методом и помещали в заключенную в футляр 30 мп стеклянную тканевую ванну. Растяжение трахеальных полос измеряли изометрически посредством преобразования усилия сдвига, соединенного с полиграфом (биопсиограф — 180 система San-Е1 Instrument).

Трахеальные полосы (2 мм шириной и 50 мм длиной) суспендировали при остаточном растягивающем напряжении 500 мг в 30 мл банях, содержащих теплый (37 С) насыщенной кислородом (95% кислорода; 5% углекислого газа} раствор Тирода следующего состава: йаС! 137 ммолей (8 г/л) HCI 2,7 ммоля (0,2 г/л) CaClz 2Н О I,8 ммоля (0,264

r/ë), Mg CIz 6Hz0 1,02 ммоля (0,208 г/л), йаНСОз 11,9 ммоля (2 г/л), NaHzHgP042HzQ

0,42 ммоля (0,066 г/л) и глюкозы 5,5 ммоля (1 г/л). Ткани приводили в состояние равновесия в течение 90 мин и затем испытывали

WS-9326A против различных бронхоконстрикторов (вещество Р 10 M), Растяжение регистрировали записывающим устройством San-Е1 Rectigraph-8 S, San-Е1 instrument), Действие испытуемого соединения на сократительные реакции трахеи морских свинок, вызванные вещества Р приведено в табл. 5, (3) действие тетрагидро-WS-9326A на сужение бронхов, вызванное нейрохинином А.

Самцов морских свинок линии Хартлей, весивших 300-500 r, обездвиживали пентобарбиталом натрия (10 мг/животное, вводимым внутрибрюшинно), Брюшную вену канилировали для введения нейрокинина А и лекарства. Катетер был также интубирован в трахею для искусственной вентиляции легких. Животное получало вдыхаемый воздух посредством миниатюрного дыхательного. насоса (Harvard В-34, производительность 5 мл/толчок, 60 толчков в 1 мин}. Устойчивость к раздуванию легких измерили модифицированным методом обильного излияния Концентта-Ресспера.

Агонист вводили внутривенно и антагонистическое лекарство вводили, как показано на фиг. 10 (приготовлено в смеси 0,1.%

50 пептидные производные формулы I в качестве активного ингредиента в смеси с органическими или неорганическим носителем или напопнителем, пригодным для внешнего, внутривенного или парэнтерального применения. Активный ингредиент может быть смешан, например, с обычным нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем (ями) или изготовления таблеток, гранул, капсул, раствором, эмульсий, суспензий и других форм, пригодных для использования.

Носители, которые могут быть использованы, включают воду, глюкозу, лактозу, аравийскую камедь, желатин, маннит, крахмальную пасту, трисиликат магния, тальк, кукурузный крахмал, кератин, коллоидную двуокись кремния, картофельный крахмал, мочевину и другие носители, пригодные для использования при производстве препаратов в твердом, полутвердом или жидком состоянии, и в дополнение могут быть использованы вспомогательные средства, стабилизаторы, осушители, красители и ароматические средства. Активное целевое соединение включают в фармацевтическую композицию в количестве, достаточном для получения желаемого действия в зависимости от течения процесса и условий заболеваний.

Поскольку дозирование терапевтически эффективного количества пептидных производных формулы I варьируется в зависимости от возраста и состояния каждого отдельного больного, подлежащего лечению, то в общем вводят для лечения болезни л,невную дозу 0.01 — 1000 мг, предпочтительметил-целлюлозы и физиологического раствора):

Ингибирование вызванного нейрокинином А сужения бронхов с помощью тетрагидро-WS-9326A видно из приведенного в табл, 6, (4) Влияние внутритрахеапьного введения тетрагидро-WS9326A на индуцированное нейрокинином А сужение бронхов у

10 морских свинок.

Для испытания действия ингаляции тетрагидро -WS-9326A на сужение бронхов тетрагидро-WS-9326А растворили в диметилсульфоксиде и вводили внутритра"5 хеально. Метод почти не отличался от описанного выше.

Как показано в табл. 7, тетрагидро-М/Я9326А оказался сильнодействующим средством.

20 Фармацевнтическая композиция согласно изобретению может быть использована в форме фармацевтического препарата, например в твердой, полутвердой или жидкой форме, которая содержит

1826970

Thr-L-треонин

z-бензилоксикарбонил

Рас- фенацил

Bzl- бензил

Вострет-бутоксикарбонил

Ме-метил

Sev-L- серин

Nye-L- ти розин

asn-L- аспарагин аИо-The-1 -аллотреонин

0-Phe-D-фенилаланин

Leu-1=лейцин

TCl-2,2,2-трихлорзтил

Mrup-4-метоксиметоксифенил

S -трет-бутилметилси

it лил ас-ацетил и-Нех-н-гексан

Et-этил

Следующие примеры и получения даны для иллюстрации изобретения в деталях.

Получение 1, К раствору гидраокиси калия (26,8 г) в этаноле (500 мл) добавляли глицин (14,6 r) и

4-метоксиметаксибензальдегид (48,5 r) при комнатной температуре. После перемешивания при комнатной температуре в течение l9 ч растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в воде и подкисляли хларистоводородной кислотой. Раствор промывали этилацетэтом и устанавливали рН 6,0 бикарбонатом натрия. В осадок выпадало белое твердое вещество, которое собирали и получали С-метоксиметил 9-окситирозин (9,2 г), точка плавления 164—

166 С, MK-спектр (Квг):1610 см

Получение 2.

К раствору О-метаксиметил- /3 — окситирозина (21,0 г) в 1 н, гидроакиси натрия (250 мл) добавляли диметилсульфат (16,5 r). Поспе перемешивания в течение 20 мин при

90 С раствор подкисляли разбавленной хлориставодородной кислотой на ледяной бано 0,1 — 500 мг, наиболее предпочтительно

0,5-100 мг активного ингредиента и однократную дозу примерно 0,5 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 250 мг и 500 мr.

В этом описании аминокислоты, пептиды, защитные группы и так далее указаны сокращениями, принятыми lUPFC-1UB (комиссией по биологической номенклатуре), которые являются обычными в данной области.

Кроме того, в последующих примерах и получениях использованы и другие сокращения в дополнение к сокращениям, принятым Комиссией по биологической номенклатуре, Следующие сокращения использованы в настоящем описании: не. Кислый раствор промывали диэтиловым эфиром и устанавливали рН 6,0 1 н. гидроокисью натрия. После выпаривания твердое вещество собирали фильтрацией и получали

5 О-метоксиметил-N-метился- -окситирозин (5,2 г), точка плавления 59-60ОС.

ИК-спектр (КВг): 3400, 1700 см

Получение 3.

К раствору 0-метоксиметил-N-метил Р

10 -окситировина (1501 г) и био-(триметилсилил)-ацетамида (25 мл) в дихлорметана (150 мл) добавляли раствор 2-нитрофенилсульфонилхларида (11,2 г) в дихлорметане (50 мл).

После перемешивания в течение 2 ч при О С

15 к раствору добавляли био-(триметилсилил)ацетамид (10 мл) и хлористый 2-нитрофенилсульфонил (5,6 г). Смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре и добавляли 1 н. гидроокись натрия (200 мл), Органический

2р слой промывали водой (ЗОО мл) и водные растворы абьединяли. После подкисления водного раствора разбавленной хлористоводородной кислотой продукт экстрагировали этилацетэтом (300 мл) и экстракт промывали

25 водой (по 100 мл три раза). После просушивания раствора над сульфатом магния растворитель удаляли в вакууме и получали

О-метокси метил-N-метил-М-(2-нитрофенилтиа)Р--акситирозин (20,5 r), точка плавления 59—

ЗО 60 С. МК-спектр (КВг): 3400, 1700 см .

Получение 4

К раствору 0-метоксиметил-N-метил-N(2-нитрафенилтио)-окситирозина (20,0 r) в этилацетате (100 мл) добавляли диазометан

35 s диэтилавом эфире (80 мл). После перемешивания в течение 10 мин растворитель удаляли в вакууме. Остаток вводили в колонку силикагеля (Merck 7734, 500 r) и элюировали хлороформом, Получали метиловый эфир 040 метоксиметил-N-(2-нитрофенилтио)-Р-окситирозина (трео-иэомер: 8,82 r) (эритро-изомер: 6,63 r).

Трео-пармер:

ИК-спектр (пленка): 3500, 2950, 1735 см

45 Танкослойная хроматография: Rf=0,31 (Merck art 5715. смесь этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Эритро-параметр:

ИК-спектр (пленка): 3500, 2550, 1735 см .

50 Тонкослойная хроматография: Яг=0,40 (Merck art 5715, этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Получение 5.

К раствору метилового эфира 0-меток55 симетил-N-метил-N-(2-нитрофенилтио)- р окситирозина (эритро-изомер) (3,85 r) в дихлорметане (30 мл) добавляли триэтилемин (1,38 г), 4-диметиламинопропилемин (0,45 г) и хлористый бензоил (1,52 г). После перемешивания в течение 16 ч при комнат1826970

20 ной температуре к смеси добавляли 3-диметиламинопропиламин (3,3 г) и растворитель удаляли в вакууме, Остаток растворяли в этилацетате(30 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным раствором бикарбоната натрия и водой, После выпаривания остаток помещали в колонку силикагеля (Merck 7734, 150 г) и элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 5;2 по объему и получали метиловый эфир О-метосиметил-N-метил-N-(2нитрофенилтио)ф-бензоилокситирозина (эритро-изомер, 4,49 г).

ИК-спектр (пленка): 2950, 1974 см

Тонкослойная хроматография: Вг0,23 (Merck art 5715, смесь этилацетал-н-гексан в отношении 1,2).

Получение 6.

Следующее соединение было получено способом. аналогичным описанному в получении 5: метиловый эфир О-метоксиметил-N-метилЩ2-нитрофенилтио)-, — бензоилокситирозина (трео-изо мер), точка плавления 114-111 С.

ИК-спектр (СНС!з); 2950, 1740 см

Тон кослойная хроматография: Rr--0,26 (Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан в отношении 1:2).

Получение 7

К раствору метилового эфира О-метоксиметил-N-метил-N-(2-нитрофенилтио)- Рбензоилокситирозина (4,94 г) в дихлорметане (50 мл) добавляли тиофенол (4,8 мл) и трифторуксусную кислоту при ООС (2,5 мл). После перемешивания в течение 30 мин к смеси добавляли водный раствор бикарбоната натрия. Органический слой промывали водным раствором бикарбоната натрия и рассолом, После выпаривания остаток помещали на колонку с силикагелем (Merck 7734) (100 г) и элюировали 5,-ным метанолом в хлороформе. Получали метиловый эфир О-метоксиметил-й-метил-/3- -бензоилокситирозина (трео-изомер 0,32 г).

Тонкослойная хроматография: Rf=0,31 (Merck an 5714, смесь этилацетат-н-гексэн в отношении 1;1), Получение 8

Следующее соединение получали способом, аналогичным описанному в получении 7: метиловый эфир 0-метоксиметил-N-метил Р- -бензоилокситирозина (эритро-изомер).

Тонкослойная хроматография Rr=0,25 (Merck art 5715. смесь этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Получение 9

К раствору N-бензилоксикарбонил-I треонинэ (3,7 r) и метилового эфира О-метоксиметил-N-метил- Р-бензоилокситирозина (трео-изомер) (3,11 r) в дихлорметэне (50 мл) добавляли этиловый эфир 1,2 -дигидро-2этокси-1-кинолиакарбоновой кислоты (2,9 г).

После перемешивания в течение 20 мин при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этила10 цетате (50 мл} и промывали дистиллированной хлористоводородной кислотой, водным раствором бикарбоната натрия и водой. После выпаривания остаток вводили в колонку силикагеля (МегсК 7734, 15 100 r) и элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 1:1 по объему и получали метиловый эфир N-(N-бензилоксикарбонил-1 -треонил)-О-метоксиметил-N-метил-Pбензоилокситирозина (трео-изомер} (2,04 г).

20 M К-спектр (пленка): 3400. 2950, 1740 (изгиб пика), 1720 см.

Тонкослойная хроматография: 6 =0,36 (Merck art 5715, смесь метанол-хлороформ в отношении 3:97).

25 Получение 10

Следующее соединение получали способом, аналогичным описанному в получении 9: метиловый эфир N-(N-бензилоксикарбо30 нил-L-треонил}-О-метоксиметил-N-метил-рбензоилокситирозина (эритро-изомер), М К-спекто1 (пленка): 2950. 1740, 1730 (изгиб пика) см

Тонкослойная хроматография: Rv0,23

35 (Merck art 5715; смесь этилацетат-н-гексан в отношении 1;2).

Получение 11. 1„, H (целевое

Z-Th1-N — С-C-.(щр соединение l)

Ие

К раствору метилового эфира Р-бензо45 илокси-N-(N-бензилоксикарбонил-L-треон ил)-0-метоксиметил-N-метилтирозина (треоизомер) (1,20 r) в толуоле (20 мл) добавляли

1,8-диазабицикле (5.4.0)-ундецен-7-ен (0,30

r), После перемешивания в течение получаса

50 при комнатной температуре к смеси добавляли 7 -ную хлористоводородную кислоту (10 мл). Органический слой промывали водой и водным раствором бикарбоната натрия. После сушки органического слоя над

55 сульфатом магния рэстворитель удаляли в .вакууме и получали целевое соединение t (0,95 г), МК-спектр (пленка): 3400, 2930, 1720 см, fa)P: -7.7 (с=0.64. метанол}.

1826970 исходное соединение а!

"!тр H

С 0 !! и

2 1!1г М вЂ” С-С-ОМе

Ие

Ивр н

Si С 0

I и в

z Thr -N — g-g p целевое соединение

Ив

К раствору исходного соединения а (1,0 г) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли трет-бутилдиметиллилхлорид (0,75 г) и имидазол (0,34 г). После перемешивания в течение 16 ч при комнатной температуре к смеси добавляли этилацетат (30 мл) и лед(50 г). Органический слой промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным раствором бикарбоната натрия и водой.

Растворитель удаляли в вакууме. Остаток вводили в колонку силикагеля (МегсЕ 7734, 30 г). элюировали хлороформом и получали целевое соединение (1,21 г), ИК-спектр (пленка): 2950, 1720 см

fry)P: -55,9 (с=0,56, метанол).

Получение 13

Мер H !! !!

Z Tbr-N— - С вЂ” С-ОМе

Ме!

"!пiр H

S» С О !! и

Z ТИ1" — N — С- С- QP !

Ме 1 исходное соединение а целевое соединение

К раствору исходного соединения а (0.95 г) добавляли 1,н. водный раствор гидроокиси натрия (4,8 мл}. После перемешивания в течение двух дней при 30 С растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (20 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой.

После выпаривания получали целевое соединение t (0,81 г).

MK-смектр (пленка): 3300, 2950, 1720, 1700 (изгиб пика) см

Целевое соединение I было также получено взаимодействием метилового эфира бензоилокси-N-(N-бензилоксикарбонил-!треонил)-О-метоксиметил-N-метилтирозина (эритро-изомер) вместо метилового эфира

P — бензоилокси-ЩИ-бензилоксикарбонил-Lтреонил)-О-метоксиметил-N-метилтирозина (трео-изомер).

Получение 12 (а)!;г: -82,9 (с-1,06, метанол), Получение 14

И Н

@ С О ! и

Z-™ - I-С- С-ОН Ф- НС! Н-Leu-D-ph Отсе

Ие исходное соединение а исходное соединение Ь

Ищр H

- Z.— — ТЬ1"-М-С-С-Lee — 0-РЬе-ОТсе !

Ие целевое соединение

К смеси исходного соединения а (1,60 г) и исходного соединения b (5,50 г) в дихлорметане (50 мл) добавляли триэтиламин )1,25 г) и этиловый эфир 1,2-дигидро-2-этокси-1хинолинкарбоновой кислоты (3,04 r). После

25 перемешивания в течение 15 ч при комнатной температуре белое твердое вещество отфильтровывали и к фильтрату добавляли исходное соединение b (2,23 г), триэтиламин (0,50 г} и этиловый эфир 1,2-дигидро-2-эток30 си-1-хинолинкарбоновой кислоты (1,24 г), Смесь перемешивали 18 ч и растворитель удаляли s вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (50 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным рас35 твором бикарбоната натрия и водой. После выпаривания в вакууме остаток помещали в колонку силикагеля (Merck 7734, 100 г), элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 2 7 по объему и получали целевое

40 соединение I (0,87 г).

ИК-спектр (пленка): 2950, 1760, 1740 (изгиб пика), 1720, 1660 см

fa)6: -31,5 (c=1,07, метанол).

Получение 15

Итпр Н ! I! !!

Z-ТМ-N— - С вЂ” С-Leu-0-Phe-OTCe

50 исходное соединение а

H Nmp .(! I!

Е-! Ь -N,-С вЂ” C — Zeu — D— - Phe — ОТСе

Ие целевое соединение I

23

Раствор исходного соединения а (0,85 г) в толуоле (100 мл) и ацетоне (10 мл) облучали ультрафиолетовой лампой (100 В) в течение

1,5 ч при 0 С. После выпаривания остаток помещали в колонку силикагеля (Merck 5

77340, 50 r), элюировали смесью н-гексанэтилацетат в отношении 2:1 rIo объему и получали целевое соединение 1 (0,18 г).

Тонкослойная хроматография; Rt. 0,22 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в 10 отношении 2:1).

M К-спектр (KB r): 3300, 1740 (изгиб пика), 1640 см

Получение 16

Ntnp Н

Ы С 0 ! li u

Z-Тп1 — N — С вЂ” C — Le,u-D-Phe-РТСЕ

Ме 20 исходное соединение а

Н Мгпр ,+

С О 25 ! И Ц

Š— ТЬ1 - -C-С-Zeu-р-р Е-ОТСЕ

Ме целевое соединение i 30

Исходное соединение а (0,17 r) растворяли в 67%-ном водном растворе уксусной кислоты (10 мл). После перемешивания e течение 28 ч при 25 С растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этилацета- 35 те (20 мл) и промывали водным раствором бикарбоната натрия и водой. После концентрирования остаток промывали н-гексаном и растворитель удаляли в вакууме. Получали целевое соедлинение i (0,15 r).. 40

MK-спектр (KBr): 3250, 1740 (изгиба пика), 1635 см ".

Тон кослойная хроматография, Яг 0,18 (Мегс1 art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 1:1). 45

Получение 17

Н Nmp

С 0 QRI, я 11 + I

Z TbI--N-С-С-Leu-Р Phe-OTce Boc ел

11В а исходное соединение а исходное coe.Bzt динение Ь 55 — Вос-Ьет н 1 р а

Г СО

1! Ц

Z-тат-И вЂ” С- С-1.ек-р-phe Oòce

I ие целевое соединение I

К раствору исходного соединения а (0,14 г) в дихлорметане (5 мл) добавляли исходное соединение Ь (0,10 г), водорастворимый гидрохлорид карбодиимида (65 мг) и 4- диметиламинопиридина (4 мг). Затем после

12-часового перемешивания при комнатной температуре к смеси добавляли N,N-диметиламинопропиламин (50 мг) и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (20 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой. После выпаривания остаток вводили в колонку силикагеля (Merck 7734, 10 г), элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 1:1 по объему и получали целевое соединение i (0,16 r).

МК-спектр (KBr); 3300, 1700, 1640, 1495 см

Тонкослойная хроматография: йг=0,38 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 1:1).

Получение 18 .Н

1 NIP

Вос-Se — 1 с О

11 Ц ™ -С-С Ьец-0-рЬе-Отсе

Ne, исходное соединение а

Вос-Аал-Зе1- С- О

И 11 -Т 1.-И-С-С 1.е„. 1, рче-ОТСе

Ме целевое соединение 1

Исходное соединение а (145 мг) растворяли в смеси 4 н. хлористого водорода в диоксане (3 мл) и анизоле (0,1 мл). После

ЗО-минутного перемешивания при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане (3 мл), К раствору добавляли N-трет-бутоксикарбонил-L-аспарагин (35 мг), триэтиламин (13 мг), 1-оксибензотриазол (18 мг) и растворимый в воде гидрохлорид карбодиимида (29 мг). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляли 7%-ную хлористоводородную кислоту (5 мл). Органический слой промывали водой, После выпаривания остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5744 и проявляли 6%-ным метанолом в хлороформе и получали целевое соединение l (110 мг).

МК-спектр (К8г): ЗЗОО, 1650, 1505 см .

Тонкослойная хроматография: Яг= 0,44 (Merck art 5715, смесь хлороформ-метанол в отношении 1,0:1).

1826970

Получение 19

10

30

Ме

Bzt Н т".уО»1

Boc-ASw-Set С о

Z-ТЬт -N-С -С-Leu-D-Phe — Îòñe

Ме исходное соединение а он

II.t l

8ос-алло-Th1 -АВ11-Sе1. С О

1 и

z-Тьт -N-С-С-Leu-0-PI1e — ÎÒñe

Ме целевое соединение!

Исходное соединение а (105 мг) растворяли в смеси 4 н. хлористого водорода в диоксане (3 мл) и анизоле (0,1 мл), После перемешивания в течение 0,5 ч при комнатной температуре растворитель удаляли а вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане (3 мл). К раствору добавляли N-трет-бутоксикарбонил-L-аллотреонин (22 мг), триэтиламин (9 мг), 1-оксибензотриазол (12 мг) и растворимый в воде гидрохлорид карбодиимида (19 мг). После перемешивания в течение 8 ч при комнатной температуре к смеси добавляли 77;-ную хлористоводородную кислоту(5 мл). Органический слой промывали водой, После выпаривали остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5744) и проявляли

67-ным метанолом в хлороформе и получали целевое соединение I.

Тонкослойная хроматография: Rf=-0,73 (Merck art 5715, смесь хлороформ-метанол в отношении 5: I), МК-спектр KBr): 3300, 1740 (плечо), 1650, 1500 см

Получение 20

-он

Bzi

ВОс-аИО-Тьг-А ь-Ве .

11 и 1 1 -Н-С-С-«u-D-Phe.-OTt" q

Ме исходное соединение а

1 он н О

Вос-алло-тм-Аз -Sev-) С О

II I1

z — т1 .- и — с- с-!.eu-0-Phe-OH целевое соединение I

К раствору исходного соединения а (58,5 мг), в 90;ь-ном водном растворе уксусной кислоты (1 мл) добавляли порошок цинка (30

55 мг). После перемешивания в течение 9 ч при комнатной температуре порошок цинка (30 мг) добавляли к смеси с интервалами в 1 ч до исчезновения исходного соединения а. После фильтрации растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (10 мл), промывали водой и выпаривали в вакууме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (IVlerek 5744), проявляли смесью этилацетат-ацетон-уксусная кислота-вода в отношении 6. 3;1;1 по объему и получали целевое соединение I (43.5 мг).

ИК-спектр (КВг): 3300, 1650, 1505 см

Тонкослойная хроматография: йг0,16 (Merck art 5715, смесь хлороформ-тетанолацетол в отношении 10:1:0,1).

Получение 21

К раствору фталальдегида (6,7 г) в дихлорметане (30 мл) добавляли этоксикарбонилметилентрифенилфосфоран (17,42 г) и смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре. Растворитель выпаривали и остаток растворяли в диэтиловом эфире. После фильтрования смеси фильтрат выпаривали.

Остаток отгоняли под вакуумом (125 С, 0,6 мм рт. ст.) и получали этиловый эфир (Е)-3-(2-формилфенил)-акриловой кислоты (6 r).

Спектр ЯМР (СДС1з, д ): 1,24 (ЗН, т, 1=6,5

Гц), 4,19 (2 Н, кв, 1=6,5 Гц), 6,28 (1 Н, д, 1=15 Гц), (1H, д, 1=15 Гц), 7,5 (3H, м), 6,77 (1Н, м), 8,43 (1Н, д, 1=15 Гц). 10.18 (1Н. с).

Получение 22

К раствору бромистого бутилтрифенилфосфония (3,2 г) в тетрагидрофуране (50 мл) добавляли трет-бутилат калия (900 мг) в атмосфере азота и смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли раствор этилового эфира (Е)-3-(2-формилфенил)-акриловой кислоты (30 мл). Смесь перемешивали 1 ч. После выпаривания растворителя остаток растворяли в диэтиловом эфире и промывали рассолом и водой, Раствор сушили над сульфатом магния, фильтровали и выпаливали. Остаток подвергали хроматографии на колонке силикагеля (1 00 г) и элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 3:1. Фракции, содержащие целевое соединение, выпаривали и получали этиловый эфир (Е)-3-(2 (г)-1-пентенил-фенил)-акриловой кислоты (2,00 г).

ЯМР-спектр (СДС1з. д ): 0,38 (ЗН, т, 1=7

Гц), 1,34 (ЗН, т, 1=6,5 Гц), 1,42 (2Н, н), 2,05 (2H, м), 4,27 (2Н, нв, 1=6,5 Гц), 5,85 (1Н, дт, 1=7 и

11 Гц), 6,39 (1Н, д, 1=16 Гц), 6.56 (1Н, д, 1=11

Гц), 7,3 (3Н, м}, 7,61 (1H, м), 7,92 (1Н, д, 1=16

Гц).

Получение 23

К раствору этилового эфира(Е)-3-(2-((z)-1пентенил)-фенил}-акриловой кислоты (2,0 г) в

1826970

Растворитель удаляли в вакууме, Остаток растворяли в этилацетате (10 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой.

После просушивания над сульфатом магния растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в трифторуксусной кислоте (1 мл) и анизоле (0,1 мл).

После перемешивания в течение 30 мин

10 при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме, Остаток растворили в

N,N-диметилформамиде (2 мл) и смесь добавляли к пиридину (40 мл).

После перемешивания в течение 16 ч

"5 при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck. 5744) и проявляли смесью хлороформ-метанола в отношении 10:1 и получали

20 целевое соединение I (15,2 мг).

ИК-спектр (KBr), 1963, 1510 см .

ЯМР-спектр {СДзОД) д: 6,24 (1Н, c), (a)5 :+13,0 (c=0,1; метанол).

Получение 26

30 исходное соединение а

35 исходное соединение а

50 целевое соединение

К раствору исходного соединения а (42 мг) в дихлорметане (4 мл) и N,N-диметилформамиде (0,1 мл) добавляли N-оксисукципимид (20,4 мг) и водорастворимый 55 солянокислый карбодиимид (8,2 мг), После перемешивания в течение 15 ч при комнатной температуре к смеси добавляли водорастворимый гидрохлорид карбодиимида (4 мг) с интервалами 1,5 ч до исчезновения исходного соединения а, 20%-ном водном метаноле добавляли гидроокись калия (2,3 г), Смесь перемешивали 2 ч при 60 С, устанавливали рН 1,0хлористоводородной кислотой и экстрагировали этилацетатом, После просушивания экстрагировали этилацетатом. После просушивания экстракта над сульфатом магния и фильтрации растворитель -удаляли выпариванием. Остаток растворяли в смеси гексан-этилацетат в отношении 4:1. Этот раствор добавляли к дициклогексиламину(1,63 мл) и получали кристаллы. Кристаллы растворяли в этилацетате и промывали 1 н. серной кислотой. Растворсушили над сульфатом магния, фильтровали, выпаливали и получали (E)-3-(2-((z)-пентенил}-фенил)-акриловую кислоту (0,92 r).

ИК-спектр (нуйол): 1690, 1680, 1620 см

Получение 24 (Е)-3-(2-((z)-1-Пе нтенил)-фен ил)-а криловую кислоту (1,08 r) растворяли в смеси дихлорметана (10 мл), хлористого оксалила (0,5 мл) и N,N-диметилформамида (0,05 мл). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота растворитель выпаривали. Остаток растворяли в н-гексане и смеси фильтровали. Фильтрат выпаривали и получали хлористый (Е}-3-(2((г)1пентенил}-фенил)-пропеонил (1,15 г), ИК-спектр (чистый): 1750, 1730, 1605, 1585 см ".

ЯМР-спектр (СДС!з, д }; 0,88 (ЗН, т, 1=6,5

Гц), 1,45 (2Н, м), 2,06 (2Н,м), 5,95 (1Н, дт, 1=11 и 7 Гц),0 6,58 (1H, д,!=11 Гц), 6,66 (1Н, д, 1=16

Гц), 7,4 (ЗН, м), 7,69 (1Н, м), 8,12 {1Н, д, t=16

Гц), Получение 25 ÎH

Hoc-aLIO-тЬ ASn-BE

Z-Thr Н вЂ” С-С-Leu-D-Рье-OH не он н О

„„o

Z Thr Н-С-С-Leu-D-РЬе-ALLO-тьг -Asm- Set

Ме он н .0

АеОн-í-Thf--hl-С вЂ” С-1ец-D-Phe-QLLO-тЬ,-Аз$е целевое соединение I

Исходное соединение а (22 мг) растворя> в растворе фтористый ВОдОрОд пиридин (0,8 мл) и в анизоле (0,2 мл) в наполненном азотом мешке. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляли несколько кусочков льда и устанавливали рН раствора 8,0 водным раствором бикарбоната натрия. Смесь помещали в ионообменную колонку с дианоном

HP-20 (10 мл) и промывали водой. Продукт элюировали метанолом и очищали ToHKocjloеной хроматографией (Merck 5715, смесь хлороформ-метанол-вода в отношении

3:1:0,1 по обьему) и получали целевое соединение! (13,0 мг).

ИК-спектр (КВг): 1635, 1510 см

ЯМР-спектр (СДзОД д ): 7,05 (1Н, с), (а), -90,6 (c=0.1, метанол).

Тонкослойная хроматография: Яг=0,35 (Merck ап 5715, смесь хлороформ-метанолвода и отношении 3:1:0,1), 29

1826970

Получение 27 хх он леон н-ть.-н-с — 3

- — — С-Leu — D-Phe-abbO-Thr

Ме дное соединение а он н О о

И и

g-тът-N-c — с-1-ец!

1— иснодное соединение b целевое соединение I

R(E)-3-(2((Z)-1-пентенил)-фенил)-пропеноил.

К раствору исходного соединения а, (6,0

Mr) в дихлорметане (1,5 мл), бис-(диметилоилил)-цетамиде(30 мкл) и N,N-диметилформамиде {0,3 мл) добавляли 0,02 в раствор исходного соединения в (0,4 мл). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляли 4-диметиламинопиридин (0,1 мг). Исходное соединение добавляли к смеси с 30-минутными интервалами до исчезновения исходного соединения а. К смеси добавляли разбавленную хлористоводородную кислоту и органический слой промывали водой. После выпаривания в вакууме остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5715) и проявляли смесью хлороформ метанол-вода в отношении 65:25:4 по обьему, Получали целевое соединение 1 (0,2 мг), Это соединение было идентично соединению WS-9326А, полученному в Получении 28.

Получение 28.

Водная посевная среда (160 мл), содер.— жащая растворимый крахмал (1 ), сахарозу

1 ), глюкозу (1 ), хлопковую муку (1 ), пептон (0,5 ), соевую муку (0,5 ) и карбонат кальция (0,2 ) (рН устанавливали 7,0 посредством 6н. гидроокиси натрия) была налита в каждую из двадцати 500 мл колб, Эрленмейера и стерилиэована при 120 С в течение 30 мин.

Петлю кул ьтуры Streptomyces

vio1aceoniger N 9326 на скошенном агаре инокулировали в каждую из сред и выращивали на роторном вибраторе (220 об/мин, дуга качения 5,1 см) при 30 С в течение трех дней. Полученная посевная культура была внесена в 160 л стерильной ферментационной среды, содержащей глицерин (3 ), соевую муку (0,5%), порошок сои (1,5о ), карбонат кальция (0,2%) и иодистый натрий (Nal) (0,001 ) в 200-литровом встряхиваемом бродильном баке из нержавеющей стали. Брожение проводили при 30 С три дня при аэрации 160 л/мин и перемешивании при 200 об/мин. Количество WS-9326A е бродильном бульоне оценивали количест5 венно методом высокопроизводительной жидкостной хроматографии с использованием насоса Hitachl модель 6555. Испольэовали колонку из стали (4,6 мм внутренний диаметр, высота 250 мм), упакованную R10 0DS-S (УМС-упакованная колонка) при скорости тока 1,0 мл/мин.

В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола и воды в отношении

3:2. Пробу для высокопроизводительной

15 жидкостной хроматографии готовили следующим образом: равный объем ацетона добавляли к бульону при энергичном перемешивании и выдерживали 1 ч и затем центрифугировали, 5 мл надосадочного слоя

20 иньецировали в инжектор проб Hitachi модель 655.

Выделение и очистка

Равное количество ацетона добавляли к культуральному бульону (150 л) при переме25 шивании. Смесь выдерживали при комнатной температуре 1 ч и затем фильтровали.

Фильтрат концентрировали до 80 л при пониженном давлении, устанавливали рН 7,0 хлористоводородной кислотой и затем зкс30 трагировали 80 л этилацетата. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении и помещали на колонку силикагеля (кизельгель 60, 70 — 230 меш, 3 л). Колонку промывали н-гексеном (10 л), смесью н-гек35 сан-зтилацетат в отношении 1:1 (10 л), этилацетатом (20 л) и активное вещество элюировали из колонки ацетоном (6 л). Активные фракции сушили при пониженном давлении и подвергали колоночной хрома40 тографии на силикагеле (кизельгель 60, 70230 меш, Merc% 1,2 л). Колонку промывали смесью хлороформ-метанол в отношении

20:1 (5 с) и целевое соединение элюировали раствором хлороформ-метанол в отношении

45 10: I (6 л). Фракции сушили при пониженном давлении, получали порошок. Порошок растворяли в небольшом количестве метанола и носили на колонку NS-геля (NIhon

Seimltsu, 500 мл), Целевое соединение элю50 ировали смесью метанол-вода в отношении

8:2 (2 л) и концентрировали до 300 мл при пониженном давлении и затем экстрагировали 500 мл этилацетата. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении

55 и получали порошок (5 r). Порошок (5 г) растворяли в 10 мл метанола (500 мг/мл) и подвергали высокопроизводительной жидкостной хроматографии с использованием стальной колонки (20 мм внутренний диаметр, 250 мм длиной), упакованной 031

1826970

).„„, " "= 283 нм (e=132000);

7) молекулярная формула: СаоНтлйвОн:

8) элементный анализ для С6оН7лй80юх х2Н20:

Вычислено, %: С 60,09; Н 6,56; К 9,34.

Найдено, %. С 60,19; Н 6,42; N 9,27.

9) молекулярный вес: АВ-масс-спектр: гп!z 1163,6 (M+ Н}

10) тонкослойная хроматография;

Значение Кг

Стационарная фаза

Проявляющий растворитель

Смесь хлорофом-метанол в отношении

10:1 по обьему этилацетат

0,50

Пластинка силикагеля (Merck 5715

art) 0,12

ll} спектр инфракрасного поглощения:

005-5(YMC-упакованная колонка) и элюировали смесью метанол-вода в отношении 8;2 при скорости потока 9,9 мл/мин, Полученную таким образом активную фракцию концентрировали при пониженном давлении и затем экстрагировали этилацетатом, Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении и получали чисто-белый порошок (150 мг) WS-9326A.

Получение 29

К раствору WS-9326А (300 мг) в пиридине (4,5 мл) добавляли уксусный ангидрид(1,5 мл) и 4-диметиламинопиридин (1 мг) и реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре, Реакционную смесь выпаривали досуха и получали масло, которое очищали препаративной тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ-метанол в отношении 10:1), Полученный продукт растирали с диэтиловим эфиром и получали триацетил-WS9326А (332 мг) в виде бесцветного порошка, Физические и химические свойства триацетил-WS-9326А следующие:

1) форма и цвет: бесцветный порошок;

2) цветная реакция. реакция положительная на сульфат церия, на серную кислоту и на пары иода, отрицательная: реакция на нигидрин;

3) растворимость: растворяется в метаноле, диметилсульфоксиде; слабо растворим в хлороформе, диэтиловом эфире; нерастворим в н-гексане;

4) точка плавления: 141 — 143 С;

5) удельное вращение; (a)P -122 (c=-1,0, метанол);

6} спектр ультрафиолетового поглоще@aye=335Î, 3020, 2950, 2920, 2850, 1730, 1650, 1520, 1440, 1350, 1230, l?00, 1160.

1100: 1060: 1040: 910 см

12) ; нейтральное вещество:

13) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 130: (100 МГц, C0Clq С0зОН в отношении 10:1), д:

174,20 (с), 173,23 (с), 173,06 (с), 171,32 (с), l71,О2 (с), 170 84 (с), 169,79 (с), 169,59 (с).

169,55 (с), 168,52 (с), 167,03 (c), 166,36 (с), 151,02 (с), 140,74 (д), 138,82 (с), 138,74 (с), 137,12 (с), 135,23 (д), 133,75 (с), 131,31 (c), l30,20 (д), 129,96 (д), 129,34 (д), 129,21 (д)х2, 128.56 (д)х2, 127,24 (д), 126,96 (д), 126,74 (д), 123,63 (д), 126,50 (д), 122,10 (д)х2, 121,29 (д), 70,99 (д), 69,22 (д), 63,22 (д), 73,73 (т), 58,13 (д), 56,10 (д), 53,22 (д), 52,66 (д), 52,18 (д), 49,93 (д), 39,75 (т), 39,39 (кв) 39,05 (т), 35,75

20 (т), 30,65 (т), 24,26 (д), 23.15 (кв), 22,79 (т), 21, а (.в), 21 21 (.в), 20 99 (-), 20,83 (B), 17,05 (кв), 17;05 (кв), 16,18 (кв), 13,82 (кв) график которого представлен на фиг. 4.

14) спектр ядерного магнитного резо25 нанса на ядрах I Í: (400 МГц, С0С!з-С0зОН в отношении 10:1) д:

8,25 (1Н, д, (=8 Гц), 8,02 (1Н, д, l=8 Гц), 7,88 (1Н, д, I=16 Гц), 7,86 (llH, д, 1.=8 Гц), 7,70 (1Н, д 1=6 Гц), 7,61 (1Н, д I=-8 Гц), 7,45(1Н, д, 30 I=7 Гц) 7 32 — 7,15 (6Н м 7 ОЗ (2H д l=8 Гц)

7,00 — 6,94 (ÇH, м), 6,88 — 6,79 (4Н, м), 6,70 (1Н, с), 6,49 (1H, д, I=-12 Гц), 5,76 (1Н, дт 1=12 и 7,5

Гц), 5;54 (1Н, широкий синглет), 5,50-5,45 (2Н, м), 4,93 (1Н, м), 4,75 (1H, м), 4,65-4,56

35 (2Н, м), 4,46 (1Н, дд, I=6 и 11 Гц), 4,31 (1Н, т, 1=-6 Гц), 4.22 (1Н, м), 4,18 (1Н, дд, 1=8 и 11 Гц), 3,56 (ЗН, с), 2,90 (1Н, дд, 1=6 и 16 Гц), 2,85—

2,80 (2Н, м), 2,56 (1Н, дд, l=4 и 16 Гц), 2,26 (ЗН. с), 2,00(3H, с), 1,96 — 1,89(2Н, м), 1,85(ЗН, 40 c), 1,58 (1Н, м), 1,35 (ЗН, д, l=á Гц), 1,32 — 1,20 (3H, м), l,07 (ЗН, д, 1=б Гц), 0,84 (1H, м), 0,72 (3H,д, !=б Гц), 0,71(ЗН, т, 3=7,5 Гц), 0,65(ЗН, д, l=6 Гц), график которого представлен на фиг. 5.

Получение 30

К раствору WS-9326А (100 мг) в пиридине (1 мл) добавляли уксусный ангидрид(0,01 мл) и смесь оставляли на ночь при комнатной температуре, Смесь выпаривали досуха, 50 чтобы получить масло, которое очищали препаративной тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ-метанол в отношении

9:1), Погученный продукт растирали с диэтиловым эфиром и получали моноацетил-М/59326А (55 мг) в виде бесцветного порошка.

Физические и химические свойства моноацетил-WS-9326А следующие.

1) форма и цвет: бесцветный порошок;

2) молекулярная форма: СыН7ойвО и;

1826970

3) молекулярный вес: FAB-массспектр: m/z 1079,4 (M+H) ;

4) тон кослойная хроматография:

Стационар- Проявляю- Значение Вг ная фаза щий растворитель

Пластинка Смест хлоро- 0,17 сил и кагеля форм-мета(Merck агт нол в

5715) отношении

10:1 по объему

5) спектр инфракрасного поглощения: т4акс=3300, 2920, 1730, 1650, 1500, 1360, 1190, 1170, 910 см о

Проявляю- Значение йг щий раство-, 0,35 ритель

Смесь хлороформ-метанол в отношении

10;1 по обьему

Стационарная фаза

Пластинка силикагеля (Merek art

57 15) 5) спектр инфракрасного поглощения: мраке=3300. 3020, 2950, 1730,.1650, 1520, 1500, 1360, 1200, 1170, 1100, 1040.569, 910 см .

6) свойства вещества: нейтральное вещество;

7) спектр ядерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц, СООз-СОзОО в отношении 5:1); график которого представлен на фиг. 7.

6) свойства вещества: нейтральное вещество;

7) спектр ядерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц, СОС!з — СОзОН в отношении 5:1): график которого представлен на фиг. 6.

Получение 31

К раствору WS-9326A (100 мг) в пиридине {1 мл) добавляли уксусный ангидрид (0,03 ммл) и смесь оставляли на ночь при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха и получали масло, которое очищали тонкослойнай хроматографией (смесь хлороформ, метанол в отношение 9:1), что давало 72 мл диаметил WS-9326A в виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства диацетил-WS-9326A следующие:

1) форма и цвет; бесцветный порошок;

2) молекулярная формула: СмНтгйв0 5:

3) молекулярный вес: FAB-масс-спектр:

m/z 1121,4 {М+Н);

4) тонкослойная хроматография:

Пример 1. WS-9326A (100 мг) растворяли в метаноле (2 мл) и раствор гидрогенизировали над палладиевой чернью (25 мг) под давлением водорода в 1 атмосферу при комнатной температуре в течение 4 ч, Смесь фильтровали и фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Образовавшийся продукт растирали с диэтиловым эфиром и получали тетрагидро-WS-9326B (92 мг) в

10 виде бесцветного порошка, Физические и химические свойства тетра гидро-WS-9326А следующие:

1) форма и цвет; бесцветный порошок;

2) спектр ультрафиолетового поглоще15 ниЯ:

Айзакс" "=287 нм (е.=13000);

3) молекулярная формула: СьаН7гйв01з:

4) молекулярный вес: FAB-масс-спектр:

m/z 1041,6 (М+Н);

5) спектр ядерного магнитного резонанса на 13С(100 МГц, СОзОО), график которого представлен на фиг. 8;

6) спектр ядерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц. СОзОО). график которого

25 представлен на фиг. 9, Пример 2. Триацагил-WS-9326А (100 мг) растворяли в метаноле (3 мл) и раствор гидрогенизировали над палладиевой чернью (35 мг) под давлением водорода в 1

30 атмосферу при комнатной температуре в течение 3 ч.

Смесь фильтровали и фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Остаток растирали с диэтиловым эфиром и получали тетрагидротриацетил-WS-9326A.

Физические и химические свойства тетрагидротриацетил-WS-9326A следующие:

1) форма и цвет: бесцветный порошок;

2) спектр ультрафиолетового поглоще40 ния:

Же2"" =280 нм (е-13000);

3) молекулярная формула: СбоН7858016;

4) элементный анализ для 60F178N80ie.

45 .НгО:

Вычислено, : С 60.80; Н 6,80: N 9,45.

Найдено, Д; С 61,08; Н 6,70; N 9.41.

5) молекулярный вес: FAB-масс-спектр:

m/z 1167,6 (М+Н);

6) спектр ядерного магнитного резонaíса на ядрах С(100 МГц, СОС!з) д:

173,3 (c), 129,23 (д), Ò72.96 (с). 128,95 (д)х2, 172,90 (с), 129,61 (д)х2, 172.81 (с), 170,87 (с), 170,56 (с), 170,50 (с), 169,46 (с).

55 169,16 (с), 168,48 (с), 167,99 (с), 165,52 (с), 150,70 (с). 140,84 (с); 138,93 (с), 138,58 (с)„

136,83 (с), 131,04 (с), 129,71 (д)х2, 128,61 (д)х2, 128,52 (д), Т26,80 (д), 126,70 (д), 126,01 (д), 125,85 (д), 121 87 (д)х2х2, 70,49 (д). 69, Т 0 (д), 63,32 (т), 58.28 (д). 56, 19 {д), 52.63 (д), 52,07 (д), 51,63 (д), 49,23 (д), 39,30 (т), 39,17 (кв), 35

1826970

38,31 (т); 36,52 (т), 35,33 (т), 32,60 (т), 31,77 (т), 30,74 (т). 27,66 (т), 24,08 (д), 22,82 (кв), 22,50 (т), 21,46 (кв), 20,74 (кв) 20,63 (мв). 16,77 (кв), 16,77 (кв), 16,22 (кв), 13,97 (кв).

7) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 1Н (400 МГц, СОС1з), д:

8,18 (1Н, д, 1=8 Гц), 7,66 (1Н, д, 1=8 Гц), 7,65 (1Н, д. 1=8 Гц). 7,29 (2Н, д, 1=8 Гц),.7,22 (1H, д, 1-8 Гц), 7,15-7,02 (12 Н, м), 6,96 (1Н, д, 1=7 Гц), 6,67 (1Н, c), 6,21 (1Н, широкий синглет), 5,51 (1Н, широкий синглет), 5,43 (1Н, м), 5,38 (1Н, широкий дублет, 1=8 Гц), 4 — 85 — 4,75 ,(2 Н, м), 4,66-4,58 (2Н, м), 4,40 (1 Н, дд, 1=11 и б Гц), 4,34 (1 Н, м), 4,23 (1Н, дд, 1=11 и 9 Гц), 4,07 1Н, м), 3,53 (ÇH, с), 3,04 — 2,84 (5Н, м), 2,75 — 2,50 (4Н, м), 2,46 (1Н, дд, 1=16 и 5 Гц), 2,28 (ЗН, с), 1,99 (ЗН, с). 1,,85 (ЗН, с), 1,661,50 (ЗН, м), 1,37-1,27(4Н, м), 1,27(ЗН, д, 1=7 Гц);

1,19 (1Н, м), 1,08 (ЗН, д, 1=7 Гц), 0,88 (1Н, м), 0,86 (ÇH, т, 1=6 Гц), 0,72 (ЗН, д, 1=-6 Гц), 0,65 (ЗН, д, 1=6 Гц).

Из анализа указанные выше физических и химических свойств и в результате даль нейших исследований по идентификации химической структуры химические структуры триацетил-W$-9326А, моноацетил- и диацетил-WS-9326В, тетрагидро-WS-9326A и тетрагидротриацетил-WS-9326A были идентифицированы следующим образом:

Триацетил-WS-9326А:

О-АС с (=)

Рс . Ас в 1 п-™н-с-с-Leu-D-pbe-aI.cp-Thr Ае11-вет „ ! Не 3

R-(Е)-3-(2-((Z)-1-пентенил)фенил)-пропе— ноил монов цетрл,WS-9326A:

g C о

11 fl

R-Thr-н-с-с-ьeu-в-phe-atf p-Thr-As -$е1

l тд зююатноил диацетил- Я$-9326А

" -,0

fI-Tht-fu-c-c-Leu-D-Рм-е11о-тьг -Asn-Бее) (" .

R-II=p a-р-ц )- I -пентенйл}фейил)-пропеноил тетра гидро-WS-9326À

Он ,=с

Н

С 0 ! II

f(-Tl t -11-0- с-меч-D-еne 11о 11 г -nsn. 5ег (ме ) о

П

СН2СН 2- CR- 1

СН2СН2СН2СН2СН1

R-(3-(2-пентилфенил)-пропаноил) тетрагидротриацетил-WS-9326A

Ас

R-Thr-N-С-С-Leu-0-Phe-адp Thr — Ash Зе1.

) 10 R-(3-(2-пентилфенил)-и ропаноил)

Пример 3. Следующие соединения были получены в соответствии с методикой примеров 1 и 2. ,7,. о А с

15 " )1 о

II u

5 Thr — N — С-С вЂ” Leu- D — Phe-а1.1.0 Thr-ASn е„ (R (3-{2-пентилфенил)-пропаноил)

20 TCX: Rr=0.17(Merck ап 5715, СНСlзМеОН(10:1))

ИК (Нуйол): 3300, 1760, 1730, 1650, 1530, 1510, 1200, 1160, 1070, 910 см "

25 н С} c

11 О AC я-1111 -Н-С-С е„о Р„е „„т

R-3-(2-пентилфенил)-пропаноил

ТСХ: RT=0,36(Ìеrck 5715, СНСlзМеОН(10:1))

ИК (нуйол): 3300, 1760, 1740, 1650, 1540, 1510. 1300, 1220, 1200, 1170, 1050, 920 GM " но, 35 ан с о

Il ll Thr-N-С вЂ” С-Leu-D-pbe-QCIO Tbr Ash Ser

1 ме 1

40 R-3-(2-пентилфенил)-пропэноил

Н-спектр ЯМР )269,65, МГц, С0з00}, д:

9,26, 9,22, 8,77. 8,74, 8,69, 8,64, 8,61, 8,07, 8,04, 7,36, 7,33, 7,31, 7,30, 7,27, 7,26, 7,24, 7,21, 7,18, 7,16, 7,07, 7.06, 7,04, 7,03, 6,96, 45 6,82. 6,79, 5,05, 5,03, 4,96, 4,82, 4,81, 4,62, 4,58, 4,49, 4,24, 4,20, 3,95, 3,93, 3,91, 3,89, 3,73, 3,61, 3,56, 3,32, 3,31. 3,30, 3,07, 2,99, 2,94, 2Я8, 2,87, 2,79, 2,73; 2,68, 2,64, 2,63.

1,94, 1,57, 1,38, 1,36, 1,36. 1,33, 1,31, 3,23, 5Р 1 21, 0,97, 0,94, 0,92, 0,74, 0,67. 0,65, 0.61, 0,58.

Формула изобретения

Способ получения производных пепти55 дов WS-9326А общей формулы 1:

OR

Ц

n Thr N-C — C-Ьео-DPhe-aICp-Tbr -ASff-ref.

1826970

38

R2 R2

1 I

-Thr-ASn-Se

Таблица.1

Культуральные характеристики штамма 9326

С еда

Агар иэ овсяной муки

6: хороший

Тирозиновый агар где R =ар (низший) алканоил с С5-алкилом в

1 ортоположении;

R 2 — водород или низший алканоил, 2 отличающийся тем, что соединение общей формулы оя нс о

1 И ц я „-туг-N-с-с-4.еи-Dphe-0 сн, Агар с солодово-дрожжевым экстрактом

Агар из крохмала и неорганических солей

Аспарагино-глицериновый агар

Агар на железе с пептонно-дрожжевым экстрактом

Глюкозо-аспарагиновый где R > — ар (низший) алкеноил с С5-алкени1 лем в ортоположении;

R 2 — имеет указанные значения, 2 подвергают реакции восстановления, К ль альныеха акте истики

G: хороший

А: обильный, коричневато-серый (6Е2) R; темно-коричневый (7F6) S: отсутствует

G: хороший

А; умеренный, темно-коричневый (7ЕЗ) R: кочичневато-серый (7F2) S: отсутствует

G: хороший

А: обильный, коричневатый серый (7Е2) R: желтовато-коричневый (5Е6) $; отсутствует

G: хороший

А: обильный, коричнева о-фиолетовый (19ЕЗ) Я: коричневый (6Е4) $: отсутствует

А; тонкий, серовато-белый ((BI)

R: желтовато-коричневый (506)

S: отсутствует

6: хороший

А: обильный, коричневато-серый (9Е2) R: коричневый до черного (6Е5) S: отсутствует

6: хороший

А: умеренный, голубовато-серый

R: коричневый (6F4) S .отсутствует

39

1826970

Прололжение табл. 1

Сеа

К льт альные ха акте истики

Питательный агар

Агар Беннета

G: слабый

А; незначительный, темно-коричневый (6F4) R: темно-кочичневый (6F4) S: отсутствует

Сахароэо-нитратный агар

G: слабый

А: отсутствует

R: серовато-кочичневый (6Е3) S: отсутствует

П р и м е ч а н и е: G-рост: А —; R — цвет обратоной стороны; S —— растворимый пигмент.

Таблица 2

Физиологические свойства штамма hL 9326

Ха акте истика

Условия

11-47

Таблица 3

Усвоение углерода штаммом N 9326

П р и м е ч а н и е: + означает усвоение.

Температурный интервал для роста, С

Оптимальный интервал температур для роста, С

Разжижение желатина

Свертывание молока

Пентониэация молока

Гидролиэ крахмала

Продуцирование меланоидного пигмента

Разложение целлюлозы

G:óìåðåHíûé

А: умеренный, коричневато-серый (9Е2) R, серовато-коричневый (5ЕЗ) до желтоватокоричневого (5F4) S: отсутствует

29 -31

Положительно

Отрицательно

Положительно

Положительно

Отрицательно

Отрицательно

1826970

42

Таблица 4

Влияние тетрэгидро-WS-9326A или октэпептидэ на специфическое связывание (Н)- вещестз ва Р с мембраной легких морской свинки

Таблица 5

Таблица 6

Таблица 7

Ингибирование вызванного нейрокинином сужения бронхов путем внутрибронхиального введения тетрагидро-WS-9326A

11 111ЗФ1У

1 00

@uz/

* Тетрагидро-WS-9326A растворяли в диметилсульфонсиде.

** I наномоль на 1 кг внутривенно, Р5 .У 4 5 . 6 7 . Ю У

100

b0

И, ri0

f0

4300 3000 2К0 1800 1%0 11100 ф ф

1000 Ю0 б00

1&26970

33

С3

33

33 ь

33

С3 м

С3

М

33

С3 О

С3

33 Л -. 33 333 -- С. 33 I) 3 „ (3

1826970

1826970

1826970

3826970

1826970

3826970

3826970 ч м м

1826970 ,ц

Г: ИВАСЯ (НЕВРОКиНИИ A ОЛИ КаРСаиЦиН!

3: 6нп3600НУаи (тетрагидра- Я -93МД)

Составитель В,Волкова

Редактор Т,Никольская Техред М.Моргентал Корректор O.Ãóñòè

Заказ 2329 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

133035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101