Способ определения гликопротеидов и белков сыворотки крови

 

Использование: медицина, клиническая и экспериментальная биохимия. Цель - ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: берут пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл, наносят ее на разделяющий гель, при этом разделение проводят с помощью 0,05 М трис-глицинового буфера, предварительно разбавленного депонизированной водой в 3 раза, электрофорез проводят при постоянном охлаждении при напряжении 200 В и силетока 3 мА, подаваемым на трубку. Использование способа в 2 раза ускоряет время исследования . 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

s G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

\»

5с

СО

Ю

lo

Cd

Ql (21) 4810702/14 (22) 05.04.90 (46) 15.07.93. Бюл. М 26 (71) Научно-исследовательский институт гигиены и профзаболеваний Министерства здравоохранения КазССР (72) Л.Н.Пруцкова (56) Лаб,дело, 1979, N. 4, с. 212-214. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИДОВ И БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ (57) Использование: медицина, клиническая и экспериментальная биохимия. Цель — усИзобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано при клинико-биохимическом обследовании больных и экспериментальных исследованиях.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа определения гликопротеидов и белков сыворотки крови, Способ осуществляется следующим образом.

Растворы реактивов готовят заранее, согласно прописи (табл. 1) и хранят в холодильнике. Все реактивы приготавливают на деионизированной воде.

Готовят раствор разделяющего геля, хорошо смешивая 1 ч. раствора М 1, 2 ч. раствора М 2, 1 ч. деионизированной воды, 4 ч. раствора М 3, Под контролем рН-метра доводили рН раствора до 8,6 с помощью HCI.

Электродный буфер готовят из расчета на 1000 мл раствора по прописи. Перед употреблением исходный раствор буфера разводят всего в три раза.

Стеклянные трубочки (100 мл х 6 мм) фиксируют в штативе, обеспечивающим

„„. „„1827635 А1 корение и упрощение способа, Сущность изобретения: берут пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл, наносят ее на разделяющий гель, при этом разделение проводят с помощью 0,05 М трис-глицинового буфера, предварительно разбавленного депонизированной водой в 3 раза, электрофорез проводят при постоянном ох.лаждении при напряжении 200 В и силе тока

3 мА, подаваемым на трубку. Использование способа в 2 раза ускоряет время исследования. 1 табл. строго горизонтальный уровень и заполняют раствором разделяющего геля с помощью шприца до 2/3 объема. Оставшийся объем заполняют водой. Наслаивание воды проводят осторожно с помощью шприца с катетером. Конец полимеризации отмечается по истечении 20-40 мин по образованию четкой горизонтальной границы между водой и гелем. Наслоенную жидкость отсасывают с помощью шприца с катетером, Непосредственно на гель наносят 5 мкл нативной сыворотки автоматической микропипеткой. Сверху наслаивают раствор электродного буфера, разбавленного в три раза, поскольку эта часть гелевой колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером. Добавляют 3 — 5 мкл метчика - бромфенолового синего.

Время электрофоретического разделения 50 — 60 минут, сила тока 3 MA на одну трубочку. В течение всего периода электрофореза создают дополнительное охлаждение с помощью термостатического циркулятора "Malti Temp" системы "Multi

Pgor" IKB, Швеция,для исключения влияния

182 /635 образующего тепла на ход электрофореза в

ПААГ.

Окончание электрофореза констатируется при достижении метчика — бромфенолового синего анодного конца гелевой колонки, После проведения электрофореза гелевые трубочки удаляют обводкой стальной иглы под слоем деионизированной воды, Фиксацию белков в гелевой колонке проводят 10 -ным раствором трихлоруксусной кислоты в течение 30 мин и окрашивают 0,2 -ным раствором Coomassi

Brilliant Blu R — 250, лишнюю краску отмывали смесью этанол-вода-уксусная кислота, Для выявления гликопротеинов использовали методику Колдуэлла и Пигмана (Маурер). Гели выдерживают в 7,5 уксусной кислоте в течение часа, затем 1 ч в 0,2 раствора йодной кислоты при 0 — 4 С, После многократного отмывания 15 -ной уксусной кислотой гели инкубируют с реактивом

Шиффа при 0 — 4 С и промывают в 7,5 уксусной кислоте до полного удаления красителя из геля. С помощью применения таких методических приемов, упрощающих процесс электрофореза, получают стандартные фореграммы с 17 — 21 Шифф-позитивными и белковыми фракциями, Качестве н ную характеристику гл и коп ротеиновых и белковых фракций проводят по их электрофоретической подвижности относительно движения трансферина. Идентификация отдельных белковых фракций производится на нефиксированных гелях путем их погружения в соответствующие красители. Церулоплазмин устанавливается окраской парафинелендиамином, полосы гаптоглобинов выявляются по пероксидазной активности, скрашиванием бензидином с перекисью водорода, трансферин по методике Clark, Annals (Маурер), у-глобулины, по окраске с лактофлавином.

Использовали такие стандарты белков, Таким образом, комплекс примененных методов идентификации позволяет выделить зоны и фракции представленные в таблице.

Учитывая разную частоту встречаемости отдельных фракций и их электрофоретическую подвижность, мы сочли возможным разделения гликопротеинов и белков по зонам.

При разграничении денситограммы на эоны используются в качестве визуальных ориентиров пики, которые отчетливо выявляются как на протеинограмме, так и на гликоп ротеинограмме.

Графическая запись полученных фореграмм проводилась на денситометре фирмы

"instrumental laboratory" США. Гели сканируют при длине волны 575 нм для гликопро5

55 теинов и 600 нм для бел ков. Количественное содержание белковых и гликопротеиновых фракций выражали в относительных процентах, вычисляя путем просчета площади треугольника, поскольку он дает более правильные результаты.

Пример. У крысы линии "В/ад", находящейся на сбалансированном полусинтетическом рационе, взята декапитацией кровь и по указанной методике из сыворотки крови выделены гликопротеины и белки и определены количественно в относительных процентах. Содержание гликопротеинов в сыворотке крови у данного животного составило: а -макроглобулиновая I эона—

4,70, гаптоглобиновая II зона — 17,65 <„ гаптоглобиновая III зона — 7,06, гаптоглобиновая IV зона — 9,41, гаптоглобиновая V — 14,12 ; зона VI az — HS-гликопротеина—

5,88 церулоплазминовая Vll — 3,53, трансфериновая Vill — 4,70 Д; а > -кислого глобулина IX зона — 3,53 а>- антитрипсиновая X — 7,06, альбуминовая XI — 17,64 и реал ьбуми новая XI I — 1,18 /,.

Содержание белков электрофоретических зон составило: as-макроглобуиновая I — 5,70, гаптоглобиновая II — 13,79, гаптоглобиновая III — 6,90, И вЂ” 9,10, V зоны

10,3, преальбуминовая — 2,30, Снизив рН гелевого буфера до 8,6 и используя концентрированный (в 3 раза) раствор электродного буфера с рН 8,6, мы достигли того, что микроколичество 5 мкл белков нативной сыворотки концентрируется в тонкую стартовую зону, которая принимает форму диска, т.е, отпадает необходимость дополнительной концентрации образца в отличие от прототипа. Это дает возможность снизить расход времени электрофореза, исключая таким образом, отрицательное влияние диффузии, возникающем при длительном электрофорезе. При этом дополнительное постоянное непосредственноее охлаждение электрофоретической системы с помощью термостатического циркулятора позволяет исключить перегревание геля в ходе электрофореза и помогает качественному разделению фракций. При помощи концентрированного в три раза буфера удается получить более четкое разделение и большее число фракций, чем используя способ прототипа, что имеет принципиальное значение, а также возможность получить стандартные электрофореграммы.

Таким образом, способ определения гликопротеинов и белков в сыворотке крови позволяет получить стандартные фореграммы с неперекрывающими фракциями.

1827635

ТРИС вЂ” 6,0 г

Глицин — 28,8 г рН 8,6

Перед употреблением разводится в 3 раза.

П редложенн ый способ дает точное, упрощенное и быстрое электрофоретическое разделение гликопротеинов и белков и требует микроколичеств биоматериала (нативной сыворотки) по сравнению с известным способом.

Способ технически прост в использовании и позволяет в 2 раза сократить рабочее время, основан на использовании доступных химреактивов в меньших количествах, что удешевляет его по сравнению с прототипом.

Реактивы для электрофореза гликопротеинов и белков в полиакриламидном геле и ри веден ы ниже.

Растворы разделяющего геля на 100 мл

N.11 н. .НС! — 48,00 мл

ТРИС вЂ” 36,6 г рК 8,6

N 2 Акриламид — 0,23 г

М3 МБА — 0,8г

ПСА — 0,14 г

Растворы электродного буфера на 1000 мл

Формула изобретения

Способ определения гликопротеидов и белков сыворотки крови, включающий получение сыворотки крови с последующим про10 ведением электрофореза в ПААГ с использованием концентрирующего и разделяющего гелей, при этом электрофорез проводят при постоянном охлаждении при напряжении 200 В и силе тока 3 мА, подава15 емых на трубку, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл наносят на разделяющий гель, а разделение проводят с помощью 0,05 M трис-гли20 цинового буфера, предварительно разбавленного деионизированной водой в 3 раза.

Зона фореграммы

Р> белковых фракции М+- м

0,033 0,005

0,067 0,006

0,071

0,009

0,008

0,13

0,39 0,008

0,45 0,008

0,58 0,01

0,64 0,01

0,77 0,015

0,71 0,009

0,77 0,005

0,82 0,01

0,88 0,03 церулоплазминовая УП

0,90 0,015

0,89 0,008 трансфериновая УШ

1,08 0,012

1,15 0,015

1,05 0,002

1,15 0,002

1,19 0,019 а1 — антитрипсиновая Х

1,24 0,02 альбуминовая XI

1,38 0,03

1,37 0 03

1,44 0,063

1,65 0,051

1,60 0 06

1,67 0,04 преальбуминовая ХП а -макроглобулиновая 1 а — HS гликопротеина Yl а1 — кислого глобулина IX

Р> гликопроновых фракций

М м

0,035 0,005

0,071 0,006

0,14 0 007

0,39 0,009

0,45 0,008

0,57 0,001

0,64 0,001

0,65 0,001