Штамм метилотрофных дрожжей hansenula роlyмоrрна-продуцент алкогольоксидазы на среде с глюкозой

 

Использование: в биотехнологий, а именно в микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольоксидэзы с конститутивным типом синтеза этого фермента. Сущность изобретения: получен штамм Hansenula polymorpha BKI1MY1345 нечувствительный к глюкозной катаболитной репрессии и не требующий для экспрессии гена алкогольоксидазы индуктора (т.е. обладающего свойством конститутивного синтеза .фермента при росте на среде с глюкозой). Штамм продуцирует при росте на среде с глюкозой алкогольоксидазу с активностью около 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухой массы клеток или 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 кг белка в бесклеточном экстракте.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я)5 С 12 N 9/04, 1/16

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4865451/13 (22) 24.07.90 (46) 07.08.93. Бюл. N. 29 (71) Львовское отделение Института биохимии им. А,B.Ïaëëàäèíà АН Украины (72) А.А.Сибирный, Г.П.Кшеминская, М,В.Гончар и Н.Н.Гладаревская (56) Авторское свидетельство СССР

М 1770357, кл. С 12 N 9/04, 1989.

Сибирный А.A. и др. Генетика, 1986, т.

22, М 4, 584-592. (54) ШТАММ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha — ПРОДУЦЕНТ

АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ НА СРЕДЕ С ГЛЮКОЗОЙ.Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольоксидазы с конститутивным синтезом этого фермента;

Цель изобретения — получение штамма, обеспечивающего синтез алкогольоксидазы в средах. содержащих глюкозу, т.е, нечувствительного к глюкоэной катаболитной репрессии и обладающего конститутивным типом синтеза фермента.

Штамм Hansenula polymorpha КСА-33 получен из штамма 22 (leu-10) генетической линии (Шеффилдский университет, Англия), который хранится в музее Львовского отделения Института биохимии им. А.В.Палладина, путем направленного мутагенеза под воздействием УФ-лучей. При мутагенезе ис„„5U „„1 832128 А1 (57) Использование: в биотехнологии, а именно в микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольокси. дазы с конститутивным типом синтеза этого фермента. Сущность изобретения: получен штамм НапзепЫа polymorpha ВКПМУ1345 нечувствительный к глюкозной катаболитной репрессии и не требующий для экспрессии гена алкогольоксидаэы индуктора (T,å. обладающего свойством конститутивного синтеза фермента при росте на среде с глюкозой).

Штамм продуцирует при росте на среде с глюкозой алкогольоксидаэу с активностью около 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухой массы клеток или 1,5 — 1,8 мкмоль/мин на 1 кг белка в бесклеточном экстракте, пользуют дозу, обеспечивающую 10 -ное выживание клеток. Отбирают мутанты исходного штамма, резистентные при росте в среде с 1%-ным метанолом к 2-дезоксиглюкозе (20 мг/л) и дающие б лее высокий уровень алкогольоксидазы при росте в среде с

1 -ной глюкозой.

Полученный штамм дрожжей Напзепи(а

polymorpha КСА-33 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов при ВНИИГенетика под номером;

В КП МУ-1345.

Штамм Hansenula polymorpha КСА-33 (ВКПМУ-1345) характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

1832128

4./ 0284 п

0,15 t С

Вегетативные клетки при выращивании на сусло-агаре плотность»о 8 Б при 37 С в течение 2 — 3 сут имеют круглую форму или овальную размером (1,5 — 4,6) х (1,9 — 5,3) мкм, Клетки одиночные, редко встречаются небольшие скопления иэ 2 — 3 клеток. Размножение почкован»лем. В основном расположение почек апикальное. Мицелий или псевдомицелий культура не образует, капсула отсутствует. Вкл»очения при просмотре в световом микроскопе выражены слабо. Реакция с диазонлем слним отрицательная.

На сусло-агаре после 2 — 4 сут культивирОвэния при 27, 30 и 37 С колонии и штрих светлО кремовые, выпуклые блестящие с ров»4ыми краями,. сметзнообразной консистенции, легко снимается пе1лсй, В жидкой среде при выра»цлвании нэ солодовом сусле плотностью 8 Б при 37 С в статических условиях на 2 — 3 сут образуется кольцо и островки очень тонкой пленки, а затем осадок клеток слегка кремового цвеТа При выращивании культуры в указанных условиях на качалке рост отмечается в виде помутнения среды, Культура способна к спаривани»о л спорул я ции.

Физиолого-биохимические признаки, Аэроб.

Температурный диапазон роста 10—

42ОС, оптимальная температура 37 С, Оптимум рН для роста 5,5. Культура растет в присутствии 1 М сорбита, В среде с

10 NaC! рост слабый.

Чувствителен K циклогексимиду, антимицину А, нистатину. Резистентен к ампицилл»лну, тетрациклину.

Отношение к источникам углерода: xop0LU0 утилизирует глюкозу, мальтозу, рибозу, эритрол, рибитол, глицерин, этзно/1, метанол, маннит, плохо утилизирует ксилозу, сахарозу, рамнозу, лимояну»о кислоту, янтарну»о кислоту, не утилизирует галактозу, лактозу, раффиноэу, зрабинозу, крахмал.

Как источники азота хорошо усваивает соли аммония и нитраты, Рост штамма в синтетических средах абсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост, Клетки штамма не содержат плазмид.

ГЦ пар составляет 48 .

Штамм не токсичен в опытах на белых мышах.

Штамм хранится на скошенном суслоагаре при 4 С, пересевы следует производить через 3 — 4 мес.

Штамм отличается от исходного ил»л близких штаммов способностью синтезировать алкогольоксидэзу при росте на среде с

4-» гл:окозой, т.е. не чувствителен к глюкоэной кэтаболитной репрессии и не требует метанола как индуктора (другими словами, обладает способностью к конститутивному синтезу алкогольоксидазы). Продуктивность штамма на среде с глюкозой составляет 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток или 1,5 — 1,8 мкмоль/мин на 1 мг белка бесклеточного экстракта, Сущность изобретения поясняется конкретными примерами использования штамма Hansenula polymo»pha КСА-33 (ВКПМ М

Y-705).

Пример 1. Штамм выращивают до поздней зкспоненциальной или начала стационарной фазы (биомасса 1,3 — 2,0 мг/сухого веса клеток в 1 мл) в среде следующего состава (иэ расчета на 1 л среды), r: КН2Р04

1 г; (NH<)zS0< 3,5;MgS04 7Н20 0,5; СаСЬ

0,1; дрож>кевой экстракт 0.5 г; глюкоза 10 г.

Культивирован»ле ведут на качалке (200 об/мин) при 30-37 С в течение 2-3 сут.

Клетки осаждают центрифугированием, промывают водой и хранят на холоду. Биомассу (в мг сухого веса в 1 Mn) определяют фотометрически с предварительной гравиметрической калибровкой.

Активность алкогольоксидазы определяют в пермеабилиэированных дигитонином (1 мгlмл, 15 мин при 30 С) клетках следующим образом.В субстратную смесь состава 0,3 ММ о-дианиз»лдин в 100 ММ фосфатном буфере, рН 7,5 — 2,5 мл, 0,1 раствор пероксидазы хрена (RZ = 0,6 "Реанал") 0,2 мл, суспензия пермеабилизованных и отмытых клеток (с = 0,2-0,5 мг/сухого веса в 1 мл) — 0,15 мл прибавляли 0,15 мл 200 ММ метанола (запуск реакции). Смесь инкубировали при 30"С 5 — 20 мин и реакцию останавливали прибавлением 0,8 мл конц. HCI. Пробы центрифугировали (3 тыс. об/мин 5 — 10 мин) и супернатанты фотометрировали в 1 см-кюветах при 525 нм против контроля, несодержащего метанола.

Удельную активность алкогольоксидэзы в мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток рассчитывали по формуле где D — оптическая плотность пробы при 525 нм;

t — время реакции, мин;

С вЂ” исходная концентрация суспензии пермеабилизованных клеток мг/мл;

n — разведение этой суспенэии перед анализом алкогольоксидэзы;

1832128

Составитель И. Привалова

Техред М.Моргентал Корректор Л, Филь

Редактор

Заказ 2604 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101

0,15 — объем вносимой в реакционную смесь суспензии клеток, мл;

0,284 — калибровочный коэффициент.

П родукти в ность штамма (т.е, а ктивность алкогольоксидазы) в данных условиях 5 выращивания составила 0,180-0,200 мкмоль/мин на 1 мг клеток, что в 2000 раз выше, чем в случае штамма-прототипа 1031

P. plnus, выращенного на глюкозной среде.

Пример 2. Условия выращивания - как 10 в примере 1. Отмытые клетки (концентрация

50 — 100 мг/мл) дезинтегрируют при 1000 об/мин с помощью стеклянных бус Я0,450,50 мм в соотношении 1.5:1 на протяжении

5 мин при охлаждении. Бесклеточный экстракт отделяют от клеточных осколков центрифугированием при 1200 об/мин в течение 0,5 ч. Определяют содержание белка в экстракте по методу Лоури и активность алкогольоксидазы, KBK описано в примере 1, в случае пермеабилизованных клеток. Активность алкогольоксидазы 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 мг белка.

Формула изобретения

Штамм метилотрофных дрожжей

Hansenula polymorpha ВКПМ Y-1345- продуцент алкогольоксидазы на среде с глюкозой.