Способ получения энтеротоксина еsснеriснiа coli

 

Использование: биотехнология, получение пенициллоил-термостабильного энтеротоксина Е.coil-вакцины против колибактериоза и смешанной инфекции, колибактериоз, рота-, коронавирусная инфекция. Сущность изобретения; культуру E.coll, продуцирующую термостабильный энтеротоксин, культивируют на среде А льде рете, Далее отделяют бакмассу, а энтеротоксин осаждают из жидкой фазы культуральной жидкости метанолом . Полученный осадок концентрируют и очищают. Очищенный энтеротоксин конъюгируют с бёнзилпенициллин -К-солью. Энтеротоксин защищает животных как от гомологичного так и гетерологичных штаммов E.coli, продуцирующих термостабильный знтеротоксин. 1 пр. 2 табл.

СОКЗЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (54)5 А 61 К 39/108

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ буфера. содержащего 5 ДСН.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4896276/13 (22) 25,12.90 (46) 23.08.93, Бюл. М 31 (71) Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (72) Г.В.Гнатенко и Ю.С.Сухарев (56) Патент США N 4411888, кл. А 61 К 39/108, .1988.

Патент CLUA N 4314993, кл, А61 К39!108, 1987. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТЕРОТОКСИНА ESCHERICHIA COLI (57) Использование: биотехнология, получе ние пенициллоил-термостабильного энтеИзобретение относится к биотехнологии и касается способа получения конюъгированного термостабильного знтеротоксина кишечной палочки и может быть использован в производстве вакцинных препаратов против колибактериоза и смешанной инфекции (колибактериоз, рота-, коронавирусная инфекция).

Целью изобретения является значительное упрощение, ускорение способа получения конъюгированного иммуногенноактивного термостабильного энтеротоксина Е.coll, а также повышение его биологической активности.

Поставленная цель достигается тем, что культуру Е.coll, продуцирующую термостабильный энтеротоксин, высевают на среду

Альдерете, инкубируют в течение 20 — 24 часов при 37 С в условиях аэрации, Отделяют бакмассу центрифугированием при 60008000 об/мин в течение 30-40 мин при 2 — 40С, Надосадочную жидкость. содержащую нативный энтеротоксин. сливают в стерильнуюю посуду и подвергают концентрированию и очистке. Ы, 1835294 А1 ротоксина Е.coll-вакцины против колибактериоза и смешанной инфекции, колибактериоз, рота-, коронавирусная инфекция.

Сущность изобретения; культуру Е.coll, продуцирующую термостабильный энтеротоксин, культивируют на среде Альдерете, Далее отделяют бакмассу, а энтеротоксин осаждают иэ жидкой фазы культуральной жидкости метанолом. Полученный осадок концентрируют и очищают. Очищенный энтеротоксин конъюгируют с бензилпенициллин -К-солью. Энтеоотоксин защищает животных как от гомологичного так и гетерологичных штаммов Е.coll, продуцирующих термостабильный энтеротоксин. 1 пр. 2 табл.

К 1 мл раствора нативного термостабильного энтеротоксина приливают 4 мл метанола, перемешивают и центрифугируют

30 — 40 мин при 600О-8000 об/мин на холоду.

Добавляют 1 мл хлороформа. Верхний слой отбрасывают, а к нижней хлороформсодер.жащей фазе приливают 0,3 мл метанола. перемешают и центрифугируют 30-40 мин при 6000 — 8000 об/мин, при 2 — 4 С, Отделяют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.

Проводят фракционирование суммарной белковой фракции термостабильного энтаротоксина Е.coll на хроматографичВеских колонках с сефадексом 6-25. Элюцию проводят 0 15 í NaCl. Концентрацию белка в выделенных фракциях определяли с помощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и

280 нм по методу Варбурга и Христиана, Для электрофоретического контроля гомогенности выделенного материала его растворяют в 50 мкл фосфатно-солевого

183529

10

Биологическую активность выделенных фракций определяют путем постановки проб на мышатах-сосунах по методу Дина. Белковую фракцию обладающую максимальной биологической активностью концентрируют против ПЭГ, высушивают в потоке воздуха и используют для конъюгации.

1,0 г термостабильного энтеротоксина

E.coll разводят в 4 — 6 мл дистиллированной воды. (рН 7,0-7,2), Добавляют 10 мл 1 M йаСОз (рН 10,2-10,4) и 10 г бензилпенициллина-К-соли. Доводят рН до 9,6 5 М NaOH u если необходимо, добавляют дистиллированную воду для полного растворения пенициллина. По 5 — 6 r бензилпенициллина добавляют через 12- и 24 часа. После каждого добавления рН доводят до 11,0, Через

5-6 часов после последнего внесения пенициллина проводят диализ против 0,002 М

"фосфатно-солевого буфера с рН 8,0-8,2 в течение 20 — 24 часов, в 20 — 100 кратном объеме при 2/3 кратной смене буфера, Концентрацию белка устанавливают с помощью спектрофотометра СФ-26 при 280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Процент термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате определяют по разнице концентраций белка до и после диализа. Полученный материал при необходимости концентрируют до 1/10 объема против ПЭГ, Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает,-что заявляемый способ отличается от известногд тем, что культивирование токсигенного штамма Е.coll проводят на одной питательной среде. а не на трех, как в прототипе, Это существенно не влияет на активность термостабильного энтеротоксина Е.соИ, но значительно сокращает время его получения, Термостабильный энтеротоксин концентрируют и очищают быстрым и легкодоступным способом, в отличие от громоздкого трех-этапного процесса, что позволяет максимально сохранить его активность и специфичность.

Термостабильный энтеротоксин после концентрирования и очистки сохраняет свою целостность, в отличие от его производных впрототипе,,что позволяет полностью сохранить активность и специфичность его антигенных детерминант. При увеличении времени и усложнении методов очистки активность и специфичность термостабильного энтеротоксина значительно снижается, или требуется создание дополнительных условий для их стабилизации. В предлагаемом способе разработаны условия и подобраны оптимальные условия для конъюгации термостабильного энтеротоксина с бенэилпенициллин — К вЂ” солью, 15

Однородность полученного коньюгата подтверждают результатами диск-электрофореза в полиакриламидном геле, Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволило установить соответствие его критерию "новизна".

При изучении других известных технических решений вданной области признаки, отличающие заявленное изобретение от прототипа, не были выявлены и потому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию "существенные отличия", 4

Способ осуществляется следующим образом.

Пример, Культуру кишечной палочки выделенную от павшего животного, продуцирующую термостабильный энтеротоксин высевают на питательную среду Альдерете и культивируют в течение 24 часов при 37 С в условиях аэрации. Жидкую культуру центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при 2 С и получают надосадочную жидкость содержащую энтеротоксин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду и подвергают концентрации и очистке.

К 1 мл раствора нативного термостабильного энтеротоксина приливают 4 мл метанола, перемешивают и центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин яа холоду (2 С), добавляют 1 мл хлороформа. Верхний слой отбрасывают, а к нижней хлороформсодержащей фазе приливают 0,3 мл метанола, перемешивают и цинтрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при 2 С. Отделяют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.

Проводят фракционирование суммарной белковой фракции термостабильного энтеротоксина Е.coll на хроматографических колонках с сефадексом G-25, Элюцию проводят 0 15 í NaCI. Концентрацию белка в выделенных фракциях определяют с помощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и

280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Для электрофоретического контроля гомогенности выделенных фракций их разводят в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5 ДСН.

Биологическую активность выделенных белковых фракций определяют путем постановки проб на мышатах-сосунах по методу

Дина.

Белковую фракцию обладающую максимальной биологической активностью концентрируют против ПЭГ и высушивают в потоке воздуха.

Растворяют 1 г термостабильного энтеротоксина Е.coll в 5 мл ди<:тиллиро,-.анной

1835294

Таблица 1

Влияние соотношения бензилпенициллин/термостабильный энтеротоксин на процент термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате и его иммуногенная активность

-т--—

М п/п Соотношение

Имм ногенная активность и отив

% термоста бильного токси(на в конечном коньюгате

Л щк льт пенициллин/ термостаби lbный токсин

2 ЛМ TC-тбксина гомологич- гетеролоного штам- гичного ма штамма гетерологичного штамма гомологич ного штамма (5,5

2 10:1, :29,5

30

25 воды рН 7,0. Добавляют 10 мл 1 M МаСОз рН

10,4 и 10 г бензилпенициллина-К-соли. Доводят рН до 9.6 5 M NaOH и если необходимо, добавляют дистиллированную воду для полного растворения пенициллина, Через 6 5 часов проводят диализ против 0,002 М фосфатно-солевого буфера с р H 8,0 в течение 20 часов в 60 кратном объеме при 2-х кратной смене буфера.

Концентрацию белка в конъюгате устанавливают по методу Варбурга и Христиана.

Процент термостабильного энтеротоксМна в конечном конъюгате определяют по разнице концентраций белка до и после диализа, Полученный препарат при необходимости кон- 15 центрируют до 1/10 объема против ПЭГ.

Однородность полученного конъюгата подтверждают результатами диск-электрофореза в полиакриламидном геле.

Контроль стерильности и безвредности 20 полученного препарата осуществляют по общепринятой методике.

Иммуногенность препарата вместе с адъювантом (раствор гидроокиси алюминия) проверяют на белых мышах. Вакцинирующий препарат вводятдвукратно, подкожно, вдозе

0,3 и 0,5 мл с интервалом в 7 дней. Через 20 дней после второй прививки животных заражают летальными дозами термостабильного энтеротоксйна и культурами гомологичного и 30 гетерологичных штаммов Е.coll.

Вакцинированные животные в 95% случае проявляют устойчивость против 2 ДЛМ токсинов и ЛД50 культур гомологичного штамма и в 80% случае защита составила против 2 ДЛМ токсинов и ЛДщ культур гетерологичных штаммов Е,coll.

В контрольных группах мыши, кбторых заражают 2 ДЛМ токсинов и ЛД о культур, пали в 90% случаев. 40

Сенсибилизирующую активность препарата исследуют в тесте активной системной анафилаксии на морских свинках по методу Немова.

Предложенный способ получения энтеротоксина Е,coll проще известного способа более чем в 20 раз сокращает время получения иммуногена, значительно уменьшает необходимые объемы реактивов и оборудования для получения препарата и существенно увеличивает биологическую активность термостабильного энтеротоксина Е.coll.

Полученный препарат обладает хорошо выраженными защитными свойствами против летальных доз термостабильного энтеротоксина как гомологичного так и гетерологичных штаммов Е,coll, Препарат безвреден и нетоксичен для лабораторных животных, не анафилактогенен, Технология его приготовления сравнительно проста и значительно коротка по времени, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Формула изобретения

Способ получения энтеротоксина

Escherichia coll, включающий культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде Альдерете, отделение токсиносодержащего суперматанта от бакмассы центрифугированием, концентрирование и очистку энтеротоксина обработкой супернатанта метанолом и хлороформом, высушивание очищенного энтеротоксина, растворение его в воде, конъюгациюидиализ, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и увеличения биологической активности целевого продукта, центрифугирование проводят при 6000-8000 об/мин в течение 30 —,40 мин, обработку осуществляют путем последовательного добавления метанола, хлороформа и затем повторно метанола с центрифугированием при 2-4 С в течение 30 — 40 мин после каждого добавления, конъюгацию ведут калиевой солью бензилпенициллина при соотношении 1:10 — 1:30 при рН 9,6 в течение

20-24 ч, диализуют против О,002 М фосфатно-солевого буфера с рН 8,0-8,2 и концентрируют до 1/10 объема против полиэтиленгликоля.

1835294

Продолжение табл, . 1

Таблица 2

Иммуногенная активность знтеротоксина БсоИ Ь сравнении с очищочм термостабильным энтеротоксином Е.coll и прототипом, Составитель Г. Гнатенко

Редактор Н. Козлова Техред М,Моргентэл Корректор М. Самборская

Заказ 2970 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям nðè ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101