Способ выделения вирусов при инапарантных острых и хронических формах флавивирусных инфекций

 

Использование: медицина, в частности вирусологии. Сущность изобретения: из крови больного выделяют лейкоцитарную взвесь. Осадок из лейкоцитарной массы трижды замораживают в сухом льде или жидком азоте и трижды оттаивают. Затем разводят в среде 199. Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭА, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через 38 ч. Индикация и идентификация вируса производится по ЦПД в гемагглютинирующих и иммуноферментных тестах. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С12 и 7/ОО

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) „1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4930836/13 (22) 23.04.91 (46) 23.08.93. Бюл.. М 31 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО АМН

СССР (72) Г.Н.Леонова, C.Ï.Êðóãëÿê, Н.Б.Любимова, О.С.Майстровская и С.М.Мураткина (73).Г.H. Леонова (56) Громашевский В.Л.. Методы изоляции арбовирусов//Сборник научных трудов

"Арбовирусы", М.: 1986, с. 90-93. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ ПРИ

ИНАПАРАНТНЫХ ОСТРЫХ И ХРОНИ4ЕИзобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для диагностики вирусных инфекций.

Цель изобретения — повысить процент выделения вирусов из крови в ранние сроки инкубационного и лихорадочного периодов острых.. а также хронических форм флавивирусных инфекций для повышения качества диагностики этих инфекций.

Цель достигается путем выделения лейкоцитарной взвеси из гепаринизированной крови больного человека или животного, освобождения сконцентрированных лейкоцитов от плазмы, замораживания и оттаивания лейкоцитов для максимального выхода вируса иэ клетки.

Способ заключается в следующем.

Кровь больного забирают иэ вены в количестве не менее 5 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, с последующим... Ж „„1836422 АЗ

СКИХ ФОРМАХ ФЛАВИВИРУСНЫХ NHФЕКЦИЙ (57) Использование: медицина, в частности вирусологии. Сущность изобретения: иэ крови больного выделяют лейкоцитарную взвесь. Осадок из лейкоцитарной массы трижды замораживают в сухом льде или жидком азоте и трижды оттаивают. Затем разводят в среде 199. Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭА, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через

38 ч. Индикация и идентификация вируса производится по ЦПД в гемагглютинирующих и иммуноферментных тестах, 2 табл. отстаиванием крови в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем тонким концом пастеровской пипетки отсасываем надэритроцитариное белое облачко, состоящее из взвеси лейкоцитов, которые затем осаждаются центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Пастеровской пипеткой удаляется супернатант, в результате чего достигается освобождение от интерферона и других ингибиторов крови. Осадок иэ лейкоцитарной массы трижды замораживается в сухом льде или жидком азоте и оттаивается. Затем разводится в среде 199.

Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭВ, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через 38 ч. Индикация и идентификация вируса производится по

ЦПД, в гемагглютинирующих и иммуноферментных тестах. Период обработки материала и изоляции вируса занимает 5-6 дн. Все изолянты, полученные предлагаемым способом, подтверждены в биологическом тесте (иа моделях 2-суточных белых мышей).

Больные КЭ острой и прогредиентной форм и лица с "укусом" клеща обследовались классическим способом (78 проб) и предлагаемым способом (92 пробы). В группе больных КЭ острой формы изолировано классическим способом 2 штамма вируса

КЭ и 1 штамм вируса Повассан, что составило

6,9 - 3,8% и предлагаемым способом — 4 штамма вируса КЭ, что составило 13,8 6,1%. Несмотря на двухкратную разницу, эти показатели статистически ие различались (р > 0,05), В группе больных КЭ прогредиентной формы изолировано предлагаемым способом 3 штамма флавивируса от одного и того же больного, в то же.время на 3 сгустков крови этого больного выделить вирус не удалось. У лиц с "укусом" клеща вирус КЭ выделили только предлагаемым способом в пяти случаях, что составило 8,9 =" 38% Всего из 78 проб крови классическим способом выделено 3 штамма (3,8 + 2,1%), а из 92 проб лейкоцитарной взвеси предлагаемым способом выделено 12 штаммов (13,0

+ 3,5%). Разница этих показателей составила 3,4 раза и была статистически достоверной (р < 0.05).

 — àáë. 1 представлена сравнительная характеристика классического и предлагаемого способов вирусологической диагностики флавивирусных.инфекций.

Пример 1. Для подтверждения вышеуказанных результатов проведена работа по изучению вирусемии у морских свинок, прокармливающих сачок таежного клеща, зараженных вирусом КЭ. Заражение клещей штаммами 493 (депонент ГКВ N. 900) и

155 (депонент ГКВ М 704) вируса КЭ проведен на стадии нимфы. Слинявших молодых; самок и самцов парно тут же подсаживали в отдельные домики, наклеенные на незараженных морских свинок. Продолжительность питания клещей составила 8-10 ди.

10 вызывать длительную вирусемию от 2 до 18

15 сут, которая легко определяется с помощью предлагаемого способа.

Пример 2, Изоляция флавивирусов

Таблиц.а

Кровь для исследования бралась из сердца регулярно от каждой морской свинки в разные сроки от момента присасывания (2, 4, 6, 11, 18 сутки). Изоляцию вируса проводили вышеуказанным способом.

Результаты исследования представлеHbl в табл. 2.

Всего за 18 сут наблюдения получено 16 образцов крови, из которых в 13 случаях наблюдали изоляцию вируса КЭ из лейкоцитов. что составило 81,2%. Приведенные данные свидетельствуют о том, что заведомо зараженные питающиеся клещи способны при хлорическом персистентном течении инфекции, Больной К., 38 л, в 1988 r перенес лихорадочное состояние неясной этиологии, в серологических тестах (РТГА и ИФА) выявлены специфические антитела к флавивирусам при многократном обследовании крови больного в период от 8 до 1 г 8 мес. Классическим способом возбудитель инфекции не выявлен. Проведено обследование больного предлагаемым способом. В период клинического ухудшения состояния больного изолировано 3 штамма вируса.

Обследована группа лошадей, у которых с помощью серологических методов установлена персистирующее течение флавивирусных инфекций.

Формула изобретения

Способ выделения вирусов при wanaрантных острых и хронических формах флавивирусных инфекций, включающий отбор пробы крови и последующее накопление вируса на биологическом объекте, от л и ч а юшийся тем, что из крови получают осадок лейкоцитов, который трехкратно замораживают-оттаивают и разводят в среде 199.

1836422

Таблица 2

Составитель Л.безшлях

Тех ред M.Моргентал

Редактор

Корректор М Шароши

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3008 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5