Способ экспрессии dacs/daocs активности в клетках еsснеriснiа coli
Использование: /енетич еская инженерия , рекомбинантная технология получения ферментов. Сущность изобретения: способ экспрессии DACS/DAOCS активности в клетках E.coli предполагает трансформацию штамма E.coli K12 Im109 плазмидой с последующим отбором клонов, экспрессирующих данную активность. 12 ил.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/52
ГОСУДАРСТВЕННОЕ. ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 4613456/13 (62) 4355306/13 (22)17.02,89 (23) 03.03.88 (46) 30.08.93. Бюл. N 32 (31) 021836 (32) 04.03;87 (33) US (71) Эли Лилли энд Компани (0Я) (72) Томас Доминик Инголиа, Стефен Виатт
Квинер, Сьюллен Мэри Сэмсон и Пол Латер Скэтрад (! !3) Изобретение касается способа экс- прессии ДНК последовательностей, которые кодируют активности деацетоксицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспорин С синтетазы, (DAOCS) катализируют реакцию, в которой из пенициллина N образуется деацетоксицефалоспорин С (DACC), и очень часто рассматривается как экспандаза (увеличитель объема). Деацетилцефалоспорин С синтетаза (DACS) катализирует образование деацетилцефалоспорина (DAC) из
DACC, реакция гидроксилирования. Эти реакции являются критическими этапами в биосинтезе очень важных антибиотиков, таких, как цефалоспорины, из
Cephalosporium acremonium и 7с-метоксицефалоспорины из Streptomyces clavuiigerus.
Соединения ДНК, используемые в способе данного изобретения, кодируют 0АОС и DACS в одиночной открытой рамке считывания. Транскрипция этой открытой рамки считывания с последующей трансляцией полученной информационной PHК (mPI-IК) приводит к получению одиночной полипей« . Ы 1838413 А3 (54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ DACS/DAOCS
АКТИВНОСТИ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA
СО!! (57) Использование: Генетическая инженерия, рекомбинантная технология получения ферментов. Сущность изобретения: способ экспрессии DACS/DAOCS активности в клетках Е.coli предполагает трансформацию штамма Е.coli К12 Im109 плазмидой р!Т507 с последующим отбором клонов, экспрессирующих данную активность. 12 ил. тидной цепи, которая обладает как DAOC-, так и DACS-активностями.
Соединения ДНК, которые кодируют активности DACS/DAOCS, были выделены из геномной ДНК Cephalosporium acremonium.
Продуцирование Е.coli активности
0АОСИОАСЯ катализируют образование
DAOC из пенициллина Nu DAC и DAOC, Сырые клеточные экстракты этих трансформантных Е.со!! по настоящему изобретению проявляют активности DAOCS/DACS без какой-либо предварительной активационной обработки. Заявленный способ экспрессии в Е.coli обеспечивает эффективное средство получения больших количеств активного фермента DAOCS/DACS. Этот фермент DAOCS/DACS полезен не только для продуцирования DAOCS и DAC, но также и для расширения спектра пенициллинов иных чем пенициллин N и для гидроксилирования цефалоспоринов иных чем DAOC для образования новых.
ДНК соединения. отвечающие настоящему изобретению, образованные от геномной ДН К Cephaios porium ac rem onium, 1838413 в высокой степени гомологичны в своей нук- На фиг,1 показана рестрикционная и леотидной DAOCS последовательности сое- функциональная карта плазмиды р1Т503; на динениям ДНК, кодирующим активность фиг,2 — рестрикционная и функциональные
DAOC и/или DACS в других продуцирующих карты, производные и взаимосвязь плаэмид цефелоспорин организмах. таких как 5 pKENUJ (101), рВ R322(102) и 103, промежуStreptomycesclavuligeries. Ввиду этой гомо- точных плаэмид в построении плазмиды логии отвечающие настоящему изобрете- pCZR336; на фиг.3 — рестрикционная и фуннию соединения ДНК, кодирующие кциональные карты, производные и взаимоОАС$/DAOCS, могут быть мечены и исполь- связь плазмид 103, 104 и 105, зованы для отбора геномных библиотек ор- 10 промежуточных плаэмид в построении ганизмов, которые продуцируют плазмиды pCZR336; на фиг.4 — рестрикционцефалоспорин С или аналогичные соедине- ная и функциональные карты, производные ния на присутствие либо ДНК, кодирующей и взаимосвязь плазмид pKEN021 (106 и 107)
DACS, либо ДНК, кодирующей ОА0С. Мно- и рКЕ (101), промежуточных плазмид в погие организмы включают ДНК,.кодирующую 15 строении плаэмиды pCZR336; на фиг.5 — реактивность ОАС$ DAOCS, которая может стрикционная и функциональные карты, быть идентифицирована и выделена с ис- производные и взаимосвязь плаэмид ptrp пользованием соединений ДНК, отвечаю- ЕО 50ch GH800 (108), pBR 322 (102 и щих настоящему изобретению. PNM575), (109), промежуточных плазмид в
Отвеча(ощие настоящему изобретению 20 построении плазмиды pCZR 336: на фиг.6— соединения ДНК, кодирующие рестрикционная и функциональные карты, ОАС$/DAOCS, были выделены в сочетании производные и взаимосвязь плазмид срегуляторнымипоследовательностями,ко- pNM 575 (109), pKEN021 (107) и pNM702 торые контролируют транскрипцию и в ко- (p1101), промежуточных плаэмид в понечном итоге выражение активностей 25 строении плазмиды pCZR336; на фиг.7 — peDAOCS/DACS. стрикционная и функциональная карта
Настоящее изобретение включает так- плазмиды p1i08, промежуточной плазмиже регуляторные сигналы гена ды в построении плаэмиды pCZR336; на
DACS/DAOCS, расположенного у 3 -конца фиг. 8 — рестрикционная и функциональкодирующей области гена DACS/DAOCS 30 ные карты, производные деривитизации и
Cephalosporium aeremonium, Эти 3 -g,регу- взаимосвязь плазмид рЕ110, р1110А, и ляторные последовательности кодируют pL110C и бактериофагов m13 и пр18, транскрипционную терминацию и полиаде- m13T с3 и pL 1108, промежуточных векнилированиетРНК,исигналы процессинга, торов в построении плаэмиды pCZR336; гена DACS/DAOCS. 35 на фиг. 9 — рестрикционная и функциональОАС-диацетилцеф(1лоспорин С ная карта плазмиды р1Т160; на фиг.
10 — рестрикционная и функциональ 1 1 ная карта плазмиды pCZRLU; на фиг. 11 — рестрикционная и функциоDACS-деацитилцефалоспорин С синте- 40 нальная карта плазмиды pCZR336; на таза, ферментная активность, которая ката- фиг.12 -- рестрикционная и функциолизирует конверсию DAOC в DAC. нальная карта плазмиды plT507.
ОАОС-деацетоксицефалоспорин С нн, 0 Последовательность ДНК гена
45 DACS/DAOCS (гена зкспандаза/гидро1 1 н ивов к; ! лиза)
ОН а
co,Он 20 30 .. (40
5 A(C 1"ГС ТЛС ГГЛ ГЛА ТТА ЛСГ (Т! GCA (:ГЛ 1ТС (-AT ССС С(Г! (1 С (,О 70 Яа 90 (ЛС (ЛТ СЛС;GA ССЛ T((; ЛГС AT> CAT ATT. СТС (ТС ГГЛ A(:С ЛЛ(1 AAC
100 Т(й 20 130 !40
СЛС ЛЛС Л(!A ЛСТ СGiA Г(С (ТТ CTT Л!С ATT CGT TGA ГАЛ &AC ТТС ЛГЛ
10 1э0 1(0 170 180 li30
AGA СЛС ТСС TGG (ГГГ ТЛ(: /(AT ГС 1 ЛСЛ Т С Л(:С ТС (С(:С ГСС AAG (;CT
200 210 220 230
GAG ((G AA(CAG ((C (ТС ЛСТ TAC ((С TAA СTA GCA (;ТТ СТГ ГАЛ AAA
2 0 2. >(! 260 270 280
15 (1(1Л (ГГТ С (; Г (:(1 С (. (Г1 Л Л(1 CTA С СЛ С СТ (i G G С ГТ Т(1Л ((Л Г A 1 Л ГХ! ЛТЛ
1838413
320
АТС ГТС з тсс тот
3lO
СТC А(:Т (;« Ь
36о (.«.Л С(;С ГАС. 410
ACT ТСC AAG
ТН31 5! .((LYS
Т(А ЛТС
7О (.ЛА (! I (4 2() ((т(. ттт
ЧЛ1. РНЕ с! с ссс
VAI. PRO
5 о
rAG crc с1Ц !.EU
470 (i(.(«iA(i
A l.A Ь IЛ!
450 46 3 AG СТС CTC А(С !.Х5 VAE. 1.ЕЦ ТНИ
440 слс слс Гтс ААГ«
ASP ASP r.EU I.YS
ГСС Ь"! С
ALA VAL
25 о
СЛС САС
ASP ASP. и;с «.,«;c ." Ей «" !.Х
«5
А1С ГТС ! 1.Е РИЕ
ACC АСС тнк тнв
49
Алс с(т
IYS GLY зо
510 52
САС АСС ССС СТС GTC
GLU SER С1Х I.EV VAL
5оо
ТЛС ТТС А С
1 YR I EU TllR
55О (:. С ACG TGC (;ш тнк cYs
560 ьтт сАс ттт
VA L AS P P l lF
«сс ат
AI.А AI(C
57(3 .МС ГГА
ASH GLY
ТТС ААС
ГНЕ I.YS
1О
CGT ААС
ARG А511
590 600 6
Алс Асс ссс стс AcG cTc Gcc GAc
1.Х5 Л«1С А!.À VAI. Т!П(1.Е0 AI.A ASP
65 70
640 650 («(.С CTC СЛС TGG GAG AGC ACC GCC
ALA 1.Е0 GI.U TRP 01.Ц SER ПИ ALA
80 .85
690 700 тсс слс fAc AcG TGc ГАС тсс
5ей Asp тхй 5ек TllR cYs тхк sER
95 100
620
Ccc crc
А1,А .ЕС (3n ттс тст
РНЕ SER
660 670
G1C «;TC ACC ГАС
ЧА!. VAL ТНН С.Ы )О
ССГ. GGC
AIeG с1л
680
АРС ТАС
LYs тхи
71о
АТС,GGC АТС GGC
1(ЕТ GLY II.Å GLY
105
АСС GGC тнк GLY
?90 ссж стт тол слл
340 ттс (:тс ТГс слс
CAA AAC (..AC AG(:
5Зо
САС CAC АСС TCG
ASP i!IS TlIR HER
Асс GAG GAG GAG
SER GLlJ GLU GLU бо
3А0 с(, лч: г.гт
Алс ттг ГГТ
4««О
АТС A/(: Л«С
"Ет ззо стт ААА
3ЯО
Азс сст
430 сст стс
AIeG 1Ец
1О х-лаяв
720 730, .740 /50 . 760
GGC АЛ(. CTG 1 ГС СС(i ЛЛ(. Ссс Г1(С 1 ТС (AG сЛС G l C TG(; CAG GЛС.. АС
GLY ASH LElJ РНЕ Р%) ASI! ДК ((1.Х PRE С!ЛЯ ASP VAI. 1Й1 GEM ASI TYR
110 : 115 (20
- 770 . 780 . /90 800 810 ттс GAc и с А Г тА. GG«: ccA (.(. с AAG САт (.Тс Г(G сс«: ссс (и стс
Р((е л >1 ARri иЕт l fR, ((LY А! А л!.A !.Х5 А5Р vhl. AI.A АНГ .I л и1. I.! .ц
125 130 . 135
820 83О R40 850 860
AAC ТСТ (iT(i (3СС .И .С СС(1 Ст« . (3СС Ь(зG « АС (3ЛС ATT СЛТ (АС ТТС (i"! C
AsM sER чл1; (1х ALA PRQ (еО АI.À G!.Y С1.ц А5Р 11.е /««51 AgP Рне vAI.
1/ 0 145 ., 150"
870 88Î 890 900 910
GAG (c GAT сГс с «. стс (:я; с А c(iG ГАс ттс ссс CAA С G ccG Гль
GLV YS A5Р Р!(О f.EII I.ЕИ ARG I.I;U АИС TYR РИЕ РВО GLU ЧМ 1 !(О СI.U
155 160 р,. 165 1 /0
920 930 940 950
GAC CGC ЬТС Gf C GAA GAG GAA ССС С1 C CGC А1 (1 GGA ССС САС 1 AC «1AC
Л5Р А(((ю ЧА1 Л!.Л Gl.«! GI.U С!.Н I leO 1.!;Ц ARG (!ЕТ GLY PRO Н S ТYR
20 17 j . 180 185
960 . 970 980 990 .1000
СТЛ СС АСС АТС ACG СТС GTC LAC САС.ACA GCC тсс (iCc AAc (ьС TTC
1.ЕЦ SFR TIIR fI.E THR LEU НАС HIS (I.N Т1(К Af.À CYS А(.Л АЯ С!Л РНЕ
190, 195 200
1838413
1010 1020 1030 1040 1050
G f G AGC CTG CAG ТСГ СЛС СТС GA(((Л ((AA 1 ТС СТС GAC CÒÑ CCG АСС
VAL SER LEU (ЬЛ CYS (11Л2 VA(. ASP (ЬЛ СIЛ2 I lll; VAE. ASI 1.EU Pl(O ПИ
205 210 215 .. 1060 1070 1080 1090 1100
СТС С(С GGC GCC АТ(1 GTC GT(: Т(С TGC GGC GCG GTC GGC ACC CTG GCC .LEU PRO GLY ALA НЕТ VAI. VAI. PIIE CYS GI,Y ALA VAL GLY 1 НИ ЬЕ(1 ALA
220 225 230
1110 1120 1130 1140 1150
ACG GGC GGC AAG С 1 (: AAG ((!С ССС AAG CAC ГСС GTC AAG ТОТ ССС GGG
TliR GLY GLY !ЛБ VAI. ЬЛБ ЛЬА 1 ВО 1.YS IIIS ARG VAL LYS . IER PRO GI.Y
235 240 245 250
1160 1170, 1180 1190
ССС САС СЛС (:GC GT(: GGC AG(. ACC CGC ACG fCG AGC Gfc ТТС ТТС СТС
ARG ASP С1Л1 ARG VAI. СЬ1 . - ЕIt SER ARG ТНИ SER ЗЕВ VAI. Р11Е РНЕ E-EU
255 ?60 265
1200 1210 1220 1230 1240
CGG CCG AAG ССС СА(; ТТС Л((: TC AAC СТС CAG CAG TCG AGG GAG TGG
ARG PRO ЬЯЯ PRO ASI PIIE ЫЕ11 1ПЕ ASH VAL ЯЛ СЬ11 SER AltG GLU 1В1
270 275 280
1250 1260 1270 1280 1290
GGT ТТС AAC (1С СЫ: ATC (.(:(; TCG GAG CGC ACG ACG TTC AGG GAG TGG
GLY РНЕ ASH VAL AR(; I LE РИ() БЕЕ CLU ARC ТНН TIIR РНЕ Л1(С GLU TRP
285 290 . 295
40
Х-7108
1300 l 110 " 1320 1330
CTT (;CC ССС ААС ТАТ СТГ АЛО. ЛТС (СС АСС (ЛТ ААС СГС ССС Г>СА
1.Е(1 (!Я С1Л ЛБ11 TYR VÀI. ЮБ ИЕf Alt(Al(G AS! 1ЛБ PRO АЬА ALA
300 305 . 310
1350 . 1:3(0 1370 1380 сАс (сс (Гт G rc ccc яс сс1 ссс (ст стс тст Acr. CCA сст сст
С!ЛЭ AI.А ЛЬА VAL РК(2 А1.A AE.Ë ALA РКО УА1. Sl;R IHR hl.A АI.A 1 ВО
315 320 . 325
14(20 1410 1420 1430
10 ССC ACT ТАС (СЛ АГ(. ССГ. CGA TC(АСТ ЯАТ ААА Т(:Т AC(С(1Л GTT
ALA 1 НИ
1440 1450.. 1460 14 70 1480
GAA САЛ AAA ТТС CCC TAT ААЛ TTG.СТЛ AA 1 TTT TAA AAC AÑË AAG
1490 1500 1510
1 5 (AG TGT САА GAG ТТТ САА СТТ TCA A-3.
GCG
AIA
ЛТЛ
I l.Е
330 (.AT где А — деоксиаденил; G — деоксигуанил;
С вЂ” деоксицитидил: Т вЂ” тимидил; ALA— группа аланина; AGR — группа аргинина, ASM — группа аспарагина; ASP — группа аспарагиновой кислоты; CyS — группа цистеина; GLN — группа глутамина; GLU— группа глутаминовой кислоты; GLY— группа глицина; HIS — группа гистидина;
lLE — группа изолейцина; LEU — группа лейцина; LYS — группа лизина; МЕТ—
18384!3
1О
20
40
55 группа метионина; РНŠ— группа фенилаланина; PRO — группа пролина: SER — группа серина; THR — группа треонина; TRP — группа триптофана; TYR — группа тироэина; VAL — группа валина.
Показанная последовательность ДНК содержит примерно 63 G и С и кодирует полип с рассчитанным молекулярным весом 36, 462 дальтон и измеренным молекулярным весом -40.000 дальтон, . Указанная последовательность может быть синтезирована обычным образом путем модифицированнго фосфоротриэфир. ного способа с использованием полностью защищенных деоксирибонуклеотидных блоков. Такие способы синтеза хорошо из. вестны и логут осуществляться в соответствиИ -с методикой Stakura и др, .1977ã.
Science 198:1056 и с методикой и др., 1978 г., Proc. Nat. Acad. Scl„USA, США, 75, 5765.
Кроме того, особенно предпочтительный способ описан в работе Hsiung и др., 1963 г., hiucleic Acid Research 11, 3227 и в работе
Narang и др., 1980 r., Methods in Enzymology .68, 90. Кроме способов, описанных в справочных руководствах данная последовательность ДНК может быль синтеэирована в автоматизированном синтезаторе ДНК, так6м как Sfstec 1450А или ABS (Appiied
Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster
Citv, ХА 94404) 380А, синтезаторы ДНК.
Ввиду вырожденности генетического кода, который является результатом нали- чия более чем одного кодона для большинства аминокислотных групп и трансляционного стоп-сигнала, последовательность аминокислот указанного фермента DACS/DAOCS может быть кодирована множеством других последовательностей ДНК. Так как эти альтернативные последовательности ДНК будут кодировать ту же поСледовательность аминокислот, отвечающую настоящему изобретению, то данное изобретение будет охватывать также и эти альтернативные последовательности и способы, в которых используются эти альтернативные последовательности.
Ввиду различного числа видов
Cephalosporium и даже различных штаммов в пределах одного вида существуют генетические .варианты ДНК, кодирующей
DACS/DAOCS, отвечающей настоящему изобретению. Эти генетические варианты включают основные последовательности
ДН К и аминокисЛоты, гомологичные соединениям, отвечающим данному изобретению, и кодируют белки с аналогичной, если не полностью идентичной, активностью, но несколько отличаются от фактических соединений, отвечающих данному изобретению. Эти генетические варианты эквиваленты также соединениям, отвечающим настоящему изобретению, и могут использоваться в способах данного изобретения.
Отвечающие настоящему изобретению соединения ДНК, кодирующие активность
DACS/DAOCS, выделены из штамма
Cephalosporlum acremonlum, общеизвестного как штамм Brotzu, который имеется в коллекции культур американского типа, Роквилл. Мерилэнд, где он хранится под номером АТС 11550. Геномная библиотека общей геномной ДНК штамма Brot;u была построена в бифункциональном космидном векторе pKCz462A (существующим в Е.coll
К12 под номером ййй1 В-15973) и была исследована на наличие последовагельностей, гомологичных ряду иэ 32 рл".лич11ых деоксирибоолигонуклеотидов, Этот ряд раэличных деоксирибоолигонуклеотидов был построен сотласно информации. полученной от частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonlum
ОАС$/DAOCS и на основе знания этого генетического кода, Были идентифицированы различные векторы, которые гомологич11ы одному или нескольким из 32 различных деаксирибоолигонуклеотидов. Пас "e,n:пательность ДНК раскрывает, какие векторы кодируют фермент С. acielilon fur
DAC$/DAOCS, После идентификации векторов, которые кодируют фермент DACS/DAOCS, был выделен рестрикционный фрагмент 7 кб
BamHl, включающий ген DACS/DAOCS и он был вставлен в коммерчески доступную плазмиду риС8, образуя плаэмиду р!Т503, которая затем трачсформируется в клетки хозяева К12 lA221. Эти трансформанты
Е.coli К12 lA221/plT503 были депонированы и составили часть коллекции культуры Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (NRRL) Пеория, IL
61604, под номером NRRL В-18170. Рестрикционная и функциональная карта плазмиды
plT503 представлены на фиг.1.
Плазмида р!Т503 может быть выделена из Е.coll К12 lA221 способом, описанным в примере 1, и используется в качестве исходного материала для построения плазмиды
plT507, которая обеспечивает высокую степень выражений активности 0АС$ DAOCS в Е.со!!. Порядок проведения операции для построения плазмиды plT507 представлен в примере 2 (смотри 2К), и включает сшивку кодирующего 2,2 кв Sstl-BamHI
DACS/DAOCS рестрикционного фрагмента плаэмиды р!Т503 с 5,8 кв NDel-BamHl фраг1838413
40
5 -C ATATG-3
1111 )
55 кентом плазмида pCZR336 и синтезированным фрагментом 60 Ьр SstT-Ndel.
Плазмида pCZR336 включаетЛр1 промотор, трансляционную активирующую последовательность, оператор с 1857, первую функциональную единицу наследственности (."пистрон"), кодирующую- небольшой пептид, который предшествует представляющему интерес гену, и последовательность
ДНК, кодирующую производное LGH (гормон роста человека). При низкой температуре, составляющей примерно 30 С, белок, экспрессируемый с использованием плазмид pCZR336 и р1Т507, является активным и способен подавлять активность промотора
Лр1, но при повышении температуры примерно до 42 С белок с 1857 инактивируется, промотор иницйирует транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей LGH (pCZR336) или DACS/0AOCS (plT507). Рестрикционная и функциональная карта плазмиды pCZR336 представлены на фиг,2.
Плазмида plT507 включает тот же первый цистрон с.1857 ген; промотор Лр1 и трансляционную активирующую последовательность, что и плазмида pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена DACSg)AOCS от плазмиды р!Т503 вместо кодирующей последовательности
1GH, Рестрикционный фрагмент — 2,2 кв ,Sstl-BamHl плазмиды р1Т503 включает .большую часть кодирую1цей последовател ьности DACS/DAOCS; ос>тальная часть этой кодирующей последовательности соде1>жится в синтезированном фрагменте 60
bp Ndel-Sstl с йебольшой модификацией последовательности ДНК дикого типа, что облегчает последующук> работу, Распознавательная последовательность рестрикционного фрагмента Ndel, которая представляет собой
3 -GTATAС-5 включает 5 -АТС-3
1It .
3-ТАС-5, которая кодирует аминотерминальную метионильную группу
DACS/DAOCS. Плазмида р1Т507 построена таким образом, что промо-.-opkpL и трансляционные активирующие последовательности располо>кены так, что вызывают э кспрессию ДН К, кодирующую
DACS/DAOCS. Рестрикционная и функциональная карта плаэмиды р1Т507 представлены на фиг.12. В примере 2 описывается построение плазмиды plT507 более подробно, 5
При температуре примерно 42ОC Е.coll
К12 1М109/рlТ507 выражает высокий уровень активности 0ACS/DAOCS, приближающийся к 15 $ от общего клеточного белка. Сырые клеточные экстракты от этих трансформантов Е,со11 К12 IM109/plT507 способны катализировать конверсию пенициллина N в 0АОС и 0АС, в то время как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток Е.coli К12 IM109 не могут катализировать эту конверсию, Данный способ анализа и результаты анализа реакции конверсии представлены в примере 3.
Многие штаммы Е,соН К12 включают активность эндогенной цефалоспориназы, вероятно, кодированной локусом ampC. По этой причине желательно осуществлять частичную очистку полипептида
OAOCS/0ACS таким образом, чтобы достигалась оптимальная активность
OA0CS/DACS, Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕ-тривакрила для отделения активности эндогенной Е.co i цефалоспориназы от желаемой активности 0AOCS/DACS. Пример такого типа частичной очистки описан в примере 3.
Другой возможностью использования частичной очистки для исключения вредных влияний цефалоспориназы является использование штамма, дефектного в продуцировании данной активности. Один такой штамм Е,coli К12 А85892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером
ИЛИ В-18096, Плазмида р1Т507 является эффективньил средством продуцирования больших количеств DACS/DAOCS в Е,со11. Ввидутого что Е.coli р1Т507 продуцирует
DACS/DAOCS в количествах, прибли>кающихся к 15% от общего клеточного белка, и ввиду того что культивация Е.coli менее сложIlà, чем культивация организмов, которые естественно продуцируют DAOCS и/или DACS, трансформанты Е.cali plT507 могут быть использованы в способе продуцирования DACS/DAOCS после эффективно и более экономично, чем "естественные" продуценты 0АСЯ DAOCS.
0AOCS может быть использована для продуцирования DAOC из пенициллина N в свободной от клеток системе, как описано в примере 3. 0АОС является не только полезным антибиотиком, но также может быть использована в качестве исходного материала для продуцирования таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспоринь! (см. патент США
4307192). Другим очень важным использованием DACS/DAOCS является использова1838413 ние фермента для трансформации пеници.;линов иных чем пенициллин N в новые цефалоспориновые производные, Плаэмида р!Т507 особенно предпочтительна для обеспечения экспресии
DACS/DOCS в Е.со!! не только ввиду высоких уровней этой экспресии, достигаемых при использовании данной плазмиды, но и ввиду отобранного маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы рекомбинантной ДНК кодируют Р-лактамазу таким образом, что клетки, содержащйе . этот вектор, могут расти в присутствии не. которых /3-лактамовых антибиотиков, таких как ампициллин. Однако если желательно использовать свободный от клеток экстракт, содержащий 0АС$ DAOCS для целей построения Р-лактамов, то нежелателен экстракт, который содержит активность
Р-лактамаэы. Так, плазмида р!Т507 не кодирует P-лактамазу в качестве маркера, и использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, который не реагирует с Р-лактамами.
Способ экспрессии DACS/DAOCS и относящийся к нему вектор, отвечающий настоящему изобретению, не ограничиваются определенным отобранным маркером. Специалисты в данной области знают, что многие маркеры пригодны для использования . на векторах экспрессии DACS/DOCS, Такие маркеры представляют гены, которые придают резистентность к канамицину, хлорамфениколу или к другим антибиотикам.
Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Культура Е.coll K12 !
А221/рт503 и выделение плазмиды р!Т503.
Лиофил Е.coli K12 !А221/р!Т508 был получен из Северных региональных научноисследовательских лабораторий, Неория, шт.Иллинойс, который имеет порядковый номер NRRL В-13170. Этот лиофил был непосредственно использован как "культура" в описанной ниже процедуре.
1 л питательного бульона L (10 г триптона, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащего 50 мкгlмл ампициллина, инокулировали культурой Е.со!!.
Клеточные осколки удаляли иэ раствора путем центрифугирования при вращении центрифуги со скоростью 25000 об/мин в течение 40 мин в роторе SW27 (Beckman, 7360 N, Lincoln Ave. Lincolnwood, J I., 60646).
Поверхностный слой зкстрагировали буферным фенолом. В этот раствор вводили примерно 30,44 г CSCI и 1 мл раствора этилбромида концентрацией 5 кг/мл, затем этот раствор доводили до объема 40 мл и
: 1981, I. Bact. 145:654 — 656), Плазмида
pKENLU могла быть получена из Северного
45 регионального научно-исследовательского
50 ет ген Е,coli Ipp см. Nakamura and Jnouye 1979 r., Celi 18. 1109-1117).
В плазмиде pKEN021 рестрикционный
5
30 декантировали в ультрацентробежную трубку (Бекмана) VTi50. Эту трубку герметически запаивали. раствор центрифугировался s роторной центрифуге VTi 50 при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч, Полученная плазмида, визуализированная ультрафиолетовым светом, была выделена и затем помещена в трубку Ti75 и роторную центрифугу (Бекмана), где осуществлялось центрифугирование со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч. Любое необходимое регулирование объема осуществлялось с использованием раствора TES. содержащего
0,761 гlмл CSCI, Затем плазмидная полоса снова выделялась, экстрагировалась насыщенным солью изопропанолом с целью удаления этилбромида и разбавлялась (1;3) буферным раствором ТЕЬ. Q рас вор вьодили 2 объема зтанола и затем е о ич;у" г" вали при -20 С в течение ночи. !!лазмида
ДН К, гранулировалась путем цен грифу ирования данного раствора в роторнои центрифуге SS34 (Servall) n течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 о /мин.
ДНК плазмиды pit503, полученная :. ким образом, 1 мг суспензировалась в i л. буферного раствора TE (10 ммоль Трис-НС1, рН 8 и ммоль ЕДТА) и хранилась при-20"С.
Рестрикционная функциональнч -лп,г:плазмиды piT503 представлены на qn r. i.
П р и м е.р 2. Построение плазмиды р!Т507.
А. Построение плазмиды pKEN021 и выделение ее рестрикционного фрагмента
-5,1 кв Xbal-Вап1Н!.
В данном разделе примера описывается выделение рестрикционного фрагмента
5,1 кв Xbal-BamHI ïëàçìèäû pKEN021(I06 на фиг.4). Ллазмида pKEN021 получена от плазмиды рКЕМШ (101 на фиг.2 и дополнительное описание приведено в работе Lee u др., 1981 г„146, 861-866. и bviebel и др„ центра (NRRL), служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Иллинойс, 61604, Е.coli СС620, порядковый номер NRRI 15011.
Плазмидл pKENUJ имеет рестрикционный фрагмент 2,8 кб EcoRI, который включафрагмент 650 п.о. EcoRI-Sall плазмиды рВ
322 был заменен генной последовательностью Е.coll Ipp, Эти генные последовательности Ipp включают фрагмент 462 (Aiu), расположенный перед первым триплетом кодирующей последовательнссти !рр. Этот
1838413
35
50 фрагмент 462 п.а.. содержит промотор, 5 нетранслируемую зону и сайт, связанный с рибосомой.
Уникальный рестрикционный сайт ХЬа! расположен в пределах сайта связывания с рибосомой в 16 пл, передтрансляционныминициирующи л метиониновым кодоном.
Сайт рестрикции РЧОП, находящийся.на
105 п.о. выше от трансляционного концевого кодона кодирующей последовательности
ipp, заменен на сайт рестрикции BamHI пу. тем ввода синтеэирбванной связующей лолекулы ДН К (5 -CCGGATCCGG-3
Collaborative Research inc., 128 Spring
Street, Lexington, Maccaryceme 02173). Кодирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность, соответствующая 3 нетран" слируемой зоне информационной РНК, следует за сайтом BamHI, Плаэмида pEN021 включает также некоторые независимые последовательности на 850 п.о., расположенные ниже гена !рр в хромосоме E.coli.
Как показано на фиг.2-4, плазмида
pKEN021 образована от плазмиды pKENlH следующим образом. Примерно 50 мкг плазмиды pKEN (101 на фиг,2) рестрицировалась
25 единицами фермента H pall (если нет других оговорок, рестрикционные ферменты и определения единиц соответствуют New
England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, Maccarycemc 01915) в 300 мкл буферного раствора IX Hpal (10 ммоль, Трис, HCI, рН
7,4; 10 ммоль MgCI ммоль КС!; и 6 ммоль
Р-меркаптоэтанола) при 37 С в течение 2 ч.
Смесь экстрагировалась двукратно 300 мкл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50, извлеченная водная фаза повторно осаждалась 2.5 обьемами этанола и 0,1 объемом 3 моль, адектата натрия (NaOAc).
Гранула ДНК растворялась в 100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционировалась на 57 полиакриламидном геле (соотношение акриламид:бис составляло
29:1 во всех полиакриламидных гелях за исключением тех случаев, где оговорено oco6o). Этот гель окрашивался в растворе, содержащем 0,5 лкгlмл этилбромида, и виэуализировалась ДНК полоса в длинноволновом ультрафиолетовом свете.
Ограничительный фрагмент 950 ор Hpall был изолирован и извлечен из геля путем электроэлюирования в диализный мешок, После экстракции смесью фенол /СНС!з и осаждения этанолом извлеченная ДНК (2,5 мкг) растворялась в 25 мкл TEN (10 ммоль
NaCI; 10 ммоль трис. HCI, рН 7,4 и л ммоль натрийэтилендинитролететраацетат (ЕДТА).
Г!римерно 2 мкг фрагмента 950 п,о.
Нра!! переваривалось рестрикционным ферментом Alul в 200 мкл буферного раствора iXAiul (50 мМоль NaCI; 6 мМоль Трис. HCt, рН 7,6; 6 мМмоль MgCI>; 6 мМоль Р-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционировалась 6 k-oM полиакриламидном геле и фрагмент 462 Alul извлекался и очищался как описано выше.
Фрагмент 462 bpAtul (1 мкг) растворялся в
10 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы (66мМольТрис, HCI, рН7,6; 10мМоль MgClg
10 мМоль дитиотрентол и 0,4 мМоль ATP), содержащего 150 пикомолей фосфорилированного связующего звена EcoRt (5 -GGAATTCC-3 иэ Cotlaborattve Research) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы. Посла инкубации при 4 С в течение 16 ч смесь нагревалась при 65 С в течение 10 лин и затем разбавлялась до 100 мкл таким образом, что имела состав буферного раствора IX icoRI (100 мМоль трис. HCI, рН 7,2; 50 мМоль NaCI; 10 мМоль М9С!2 и 6,ммоль Р-меркаптоэтанол), содержащего 40 ед, фермента EcoRi, По прошествии 2 ч выдержки при 37 С образец экстрагировался смесью фенол/СНС!з и осаждался этанолом. Затем ДНК растворялась в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы, содержащего Т4 ДНК лигазу и 0,1
t4Kã обработанной щелочной фосфатазой, вываренной с EcoRI плазмйды рВВ322 (102 на фиг.2), llocne сшивки при 4ОС в течение
16 ч полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом (Е, Coli К12 НВ101 КВВ1 -15626).
Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержаы их 12 мкг/ лл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции, как описано в работе Birnboim and
0oty, 1979 год, Nucleic Acids Research 7;
1513-1523, Была выбрана плазмида (103 иа фиг.2), содержащая фрагмент 466 Ьр XbalBarn Hl и использование в качестве исходного материала для следующего описанного этапа.
Примерно 2 мкг этой плазмиды (103 на фиг.3) расщеплялось 2 единицами фермента
HInd Ill в 50 мкл буферного раствора IX Hind
III (60 мМоль NaCI; 10 мМоль Трис. HCI, рН
7,4; 10 мМоль МоС! и 6 мМоль /3-меркептоэтанол) в течение 1 ч при 37 С. После того как реакционная смесь экстрагировалась смесью фенол/СНС!з и осаждалась зтанолом, ДНК растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеазы iX (300 мМоль NaCI; 30 мМоль NaOAc, рН 4,25; и 3 мМоль ZnCI2), содержащего 200 единиц нуклеазы Sl (Miles
Laboratories 30 W. 475, N.Aurora Road, NaperviIle, Jtl. 60566). По прошествии 1 ч
1836413 выдержки при 15 С реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС!э и
ДНК осаждалась этанолом. Вываренная с
Hirid ill, обработанная нуклеазой ДНК растворялась в 10 мкл буферного раствора Т4
ДНК лигазы, содержащего 20 пикомолей фоСфорилированных связующих звеньев
Harn Hl (5 -CCGGATCCGG-3 из Collaborative
Research) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы. После 16 ч выдержки при 4 С реакционная смесь нагревалась при 65 С в течение 10 мин с
10 целью инактивации лигазы и затем разбавлялась до 100 мкл с целью получения буферного раствора IX Bam HI (150 мМоль NaCI;
20мМоль Трис, HCI, pH 8,0; 10мМоль МдС(2 15 и 6 MMoflb меркаптоэтанол). содержащего
20 единиц фермента Баm Нi. Посл 2 1 выдержки rfpf! 37 С смесь подвергалась,очистке на 1",ь-ом агарозно, f enе, Это. Ге.,;, окрашивался этилбромидом, и более круп- 20 ный фраг1лент (- 4,5 кв) извлекался путем вырезания полосы этого фрагмента из Геля, эл10ирования этОГО фраг1лента после замораживания агароэного кре1лнезема и последующей очистки путем экстракции с1лесью 25 фенол/СНС(з и Осаждения этанолом. Желаемый фрагмент может быть также выделен из агарозного геля с использованием мемб- . раны NA45(Schleicherand Schuell) согласно рекомендации изготовителя. 30
Извлеченный фрагмент имеет липкие концы и его растворяли в 20 мкл буферного раствора лигазы Т4 ДНК, содержащего лигаэу Т4 ДНК. По прошествии 16 ч выдержки
4ОС ДНК использовалась для трансформа- 35 ции Е. coli K12 HB101 (NRR (.Б-15626).
Трансформанты отбирались на стойкость к ампициллину (Арй1 при 100 мкг!мл и на чувствительность к тетрациклину (TeS) при 10 . мкг/мл, Некоторые плазмидь1, полученные 40 согласно описанию Birnboim из колоний
ApR TcS, исследовались на отсутствие сайта
Hind llI и на присутствие единственного сайта Ва т1 Hl. Последовательное расщепление EcoRI, Sall приводило к образованию 45 двух меньших фрагментов, размером 466 п.о. и 305 п.о. и значительно более широкого фрагмента, Была выбрана плазмида (104 на фиг.3) с.этими характеристиками, затем она была модифицирована для превращения 50 сайта EcoRI, расположенного выше промотора Ipp, в сайт Hand lli.
Эта модификация сопровождалась первым частичным расщеплением 2 мкг плазмиды (104 на фиг.3) в 100 мкл буферного 55 раствора IX EcoRI с ферментом EcoRI, Реакция прекращалась при инактивации нагреванием при 65 С и экстра ции смесь фвнол/СНС з реакционной смеси, Осуществлялось осаждение ДНК этанолом. Гранула
ДН К растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеаэы IX, содержащего 1000 ед/мл нуклеазы Sl, и инкубировалась при 12"C f3 течение часа, Реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС!з и ДНК осаждалась этанолом. Гранула ДНК снова суспензировалась в 10 мкл буферного раствора Т4 ДН К лигазы, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного связующего звена Hind И (5 -ССААССТТСС-5, (иэ
СОИаЬогабче Research) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы.
После 16 ч выдержки при 4 С смесь нагревалась в течение 10 мин при 65 С, раэбавлялась до 150 мкл с получением композиции буфера IX Hind Ill,ñîäåðæàùåãî
10 единиц фермента Hind iii, инкубиравалась в течение 2 ч при 37"С и затем фрaêöè1 огГР В. 16C.
Самая крупная полоса (зквивале111ная линейной полной длины плазмиде) извлекалась обычным образом, оч11щалась, растворялась в 20 мкл буферного раствора
Т4 лигазы, содержащего Т1 лигазу, инкyб11ровалась в течение 16 ч при 4 С и испол1-зовалась для трансформации Е. co!i IB i 01 (ЧЯР Ы-15626). Трансформант ApR, со;..ижащий плазмидную ДНК, анализира1а: ".ë
flocp дством рестрикц1лонного а11ал1 »" БРла отобрана плазмида (105 на фиг.3) с фрагментом 500 вр EcoRI-Н ".d III. Э1а плазмида затем была использова11а как вектор клонирования зоны 3 гена 1рр.
Примерно 2 мкг этой плазмиды (105 ffa фиг.4) вываривалось в 50 мкл буферного раствора IX Sall (150 мМоль NaCI; 6 мМоль Трис
HCI, рН 7,9; 6 мМоль Mg Clz и 6 мМоль Р-меркаптоэтанола) с 2 единицами фермента Sail в течение 1 ч при 37 С. Затем реакцио;1ная смесь разбавлялась до 150 мкл с получе1fèем композиции буферного раствора Багл I ll, содержащего 2 единицы фермента Багп Н1, После 1 ч выдержки при 37"С добавляли пр1.1лерно 2,5 единицы щелочной фосфатазы, смесь инкубироваггась при 65 С в течение 1 ч. Данны: продукт экстрагировался смесью фенол/СНС!з, осаждался этанолом, растворялся в TEN и использовался как вектор клонирования для фрагмента Ipp 3.
Для. получения фрагмента 1рр3 10 мкг плазмиды рКЕ (101 на фиг.21 расщеплялись в 200 мкл буферного раствора IX нРа!, содержащего 10 единиц фермента Нра!, в течение 2 ч при 37 С, После экстракции смесью фенол/СНС!з и осаждения этанолом
ДНК растворялась в 10 мкл буферного р,.створа лигазы 74 ДНК, содержащего 20 п«комолая фосфорилированнofo свяэу1оща1о звена Sall(5 -GGTCGACC-3 из Соиаboratlve
Research и Т4 ДНК лигазу, затем инкубиро1838413
2О ваг<ась в течение 16 ч при 4 С. Лигаза инак- тивировалась путем нагревания при 65ОC в течение 10 мин. Полученный материал раэбавлялся до объема 100 мкл и в результате получалась композиция буферного раствора IX, содержащего 10 единиц фермента Sall и и кубировался в течение 1 ч при 37 С, Реакционнагг смесь разбавлялась до
300 мкл, в результате получалась композиция буферного раствора IX Pvull (60 мМоль 10
NaCl; 6 мМаль Трис. HCI, рН 7,5,6 мМоль
MgClz; 6 мМоль )3-меркаптоэтанол), содержащего 10 единиц фермента Pyull. По прошествии 1 ч выдержки при 37 С ДНК фракционировалась на 5 /-ом полиакрила- 15 мидном геле, Примерно 0,5 мкг фрагмента
950 п.о. извлекалась, очищалось и растворялась в+EN, 0,2 микрограмма этого фрагмента раз.. бавлялись в 20 мкл буферного раствора 74 20
ДНК лигазы, содержащего 20 никомалей фосфорилированного связующего звена
Вam Н! (5 -CCGGATCCGG-3, иэ
Collaborative Research) и,2 единицы Т4 ДН К лигазы, затем инкубировапись в течение 25
16 ч при 4 С. Полученная ДНК затем нагревалась в течение 10 мин при 65 С, разбавлялась да абьема .100 мкл с образованием композиции буферного раствора iX Bam Н!, содержащего 20 единиц фермента Bam Hl, 30 инкубированнаго при 37 С в течение 2 ч, затем фракцианиравалась на 5 -ом полиэкрипамиднам геле с целью удаления избытка связующих молекул.
Полученный в результате фрагмент 950 35 п.о. с липкими концами Bam Hl u Sall очи-" щался обычным образом и растворялся в 20 мкл, буферного раствора Т4 ДН К лигаэы, содержащего 0,2 мкг обработанной BamlllSall плазмиды 105 и Т4 ДНК лигазы, После 40 инкубации в течение 16 ч при 4 С ДНК использовалась для трансформации E.coli К12
Н В 01 (К В Е В-15626).
Были получены плазмиды из трансформанта Арй и зти плазмиды анализировались 45 на наличие фрагмента Sall-Bam Hl. Желаемая плазмида (5,2 кв) была обозначена
pKF N 021 (106 на фиг.4).
10 мкг плазмиды pKEN021 расщеплялись при 37 С в 200 мкл буферного раствора 50
Bam Hl, содержащего 10 единиц каждого из ферментов Вагп: п1,и Xbal, в течение часа при 37 С. Желаемая ДНК, обработанная
Xbal-Bam Hl, затем обрабатывалась 2,5 единицами щелочной фос: ратазы в течение 1,5 55 ч при 65 С, экстрагировалась смесь фенал/СНС!з, извлекалась путем осаждения этанолам и растворялась в 50 мкл TEN для последующего использования (107 на фиг.4).
В. Построение плазмиды pNM575, Плазмида ptrp ED50 chGH800 (108 на фиг,5), описанная Martial и др., 1979 г., Science 205:602-607, использовалась в качестве источника ДНК, содержащей часть кодирующей последовательности nGH.
Этот фрагмент мог быть построен методом синтеза или Mor быть получен путем использования метода распознавания, описанного
Goodman и др„1979 г. "Методы в "-нзимологии, 68, 75 — 90,путем изоляции мРНК, кодирующей LGH, из слизистых оболочек человека. Часть LGH плазмиды ptrp ED50ch
GH800 содержит уникальный сайт рестрикции на 6 п,о. ниже трансляционного концевого кодона данной кодир/ющей последовательности. Этатсайт был заменен на сайт Bam III как описано ниже., Примерно 6 мкг плазмиды ptrp ED50
chGHB00 обрабатывалась 6 единицами
Smal в 200 мкл буферного раствора IX Sma (15 мМаль Трис. HCI, pH 3,0; 6 мМоль МЦС!2, 16 мМоль KCI; 6 мМоль / меркаптоэтанол) в течение 1,5 ч при 37"С. После полного вываривания осуществлялась экстракция смесвью фенал/СНС!з, ДНК извлекалась путем осаждения этаналам и затем растворялась в 24 мкл TEN 40 пикомалей фасфорилираваннога связующего звена Bam Hl (Collaborative Research), вводили в 0,5 мкг (0,2 микомаля кон цав) обработан най как указано выше плазмиды в 16 мкл буферного раствора лигазы, содержащего Т4 ДНК лигазу. Смесь инкубировапась в течение 2 ч при 22 С, в течение 16 ч при 4 С и затем в течение 10*мин при 65 С. Липкие концы
Bam Hl образовывались путем обычной обработки ферме«тав Bam Hi, Данный фермент расщеплял последовательность линкера, а также сайт Bam Hl. расположенный в начале;;лонираваннай LGH ДНК последовательности. Данное расщепление приводила к абразовани а фрагмента 691 п,о, с липкими концами Bam Hl, который отделялся на 6%-ом полилакрипамидном геле и затем извлекался обычным образом.
Выделенный фрагмент ДНК сшивался с
0,2 мкг обработанной Bam H I и щелочной фасфатазай плазмидай рВ 322 (фиг,5). По прошествии 16 ч выдержки при 4 С данный материал использовался для трансформации E.coli К12 IA221 (NRR LB-15014) в основном согласно процессу трансформации
Wensink и др., 1974 г„СМ 3: 315 — 325. Трансформанты отбирались на агаравых и lacTH нах, содержащих 100 мкг/мл ампициплина, и ппазмиды выделялись обычным образом и идентифицировапись путем анализа ограничительного фермента и методом гель электрафареза. >Кепаемые ппазмиды, обоз22
1838413 го раствора Fnu Dll (6 ммоль NaC(; 6 мМоль
Трис..HCI, рН 7,4; 6 мМоль MgCI>; 6 мМоль
Р -меркаптоэтанол) с 2,5 единицами фермента в течение 1,5 ч при 37ОС. Электрофорез на 6%-ом полиакриламидном геле и стандартные процедуры извлечения использовались для извлечения фрагмента ДНК 538 п.о., содержащего кодирующую последовательность последних 175 аминокислот LGH, после чего осуществлялась трансля ция стоп сигнала.
Двухнитевой фрагмент ДНК (1100 на фиг.б) синтезировали фосфотриэфирным способом, соединяя зону промотора Ipp c кодирующей зоной (6Н. Этот двухнитевой фрагмент ДНК (1100 на фиг.б) имел указанную ниже последовательность:
5 - С1Ф.АГ((ГЛ (/,1Л1 (. ("! ((C!t h((Л (" (((((; (! Г П (((: l ) 1 Г ((Л Л((з(. ГА I ((((0-3
В В ! В В В В! ((! (В i (((((! (((i В ((! (! i (! (((! В В (! 1 В (В ((В ((В В ((! (! (i
3 — 1Г(.ГЛ (:"Л" .: (Ë i! ((.1ËË;(:.(:. ; (! (Г(АЛ((;(;г / п i:(: (:(:(,Л Л/ Ч: l (; П (:Г(АП (:(.,Л(, (,(: -
40 обычным образом культивировались, используясь в качестве предпочтительного источника желаемой выраж нной плазмиды р«01.
Д. Построение плазмиды р1103, Последовательность гена LGH в плазмиде р1101 содержала сайт XL-1, начинающийся на 24 основания ниже трансляцианцой инициирующей точки и сайт ХЬа Hl в неко50 дирующей зоне 5, Примерно 25 мкг плазмиды р1101 вываривались в 250 мкл буферного раствора Bam Hl с 25 единицами Xbai и 25 единицами Xhol при 37 С в течение часа.
Большой фрагмент, который имел слегка более быстрый пробег, чем линейная плазми55 да, очищался от агарозного геля, как описано в примере 2А. наченные как pNM575 (109 на фиг,5). содержат.фрагмент 700 п.о, Bam Hl и их обычным образом усиливали (фиг,1) для последующего использования.
С. Построение плазмиды р1101, Кодирующая последовательность зрелого LGH содержала один сайт Fnu.PII, находящийся на расстоянии -47 п.о. от пЕрвого нуклеотида трансляционной инициирующей точки, Примерна 25 мкг плазмиды
pNM575 переваривалось в 250 мкл буфернога раствора Bam HI с 25 единицами фермента Bam Hl при 37 С в течение часа (фиг.б). Фрагмент 691 п,о. Bam Hi извлекался обычным образом из 6 $ полиакриламидного геля и очищался. После очистки одна треть этого фрагмента (эквивалентно 8 мкг плазмиды) вываривалась в 100 мкл буферноДанный фрагмент получается распознавательным фосфотриэфирным способом, посредством которого получены ниже следующие фрагменты, 1) 5 -CTAGAGGGTA-3 ;
2) 5 -TTACATATGGATTTCC-3 ;
3) 5 -CAACCATTCCCCTCTCGACGC-3 ;
4) 5 -TTTTTGACAACG-3
5) 5 -CTA i 5CTCCG3-3 ; б) 5 -СОСАССАТА(СОТТОЗ ;
7) 5 -GTCAAAAAСССТ-3
8) 5 -CGAGAGGGGAAT-3 ;
9) 5 -GG-TTGGGAAATC-3", и
10) 5 -CATATG TAATAC С СТ-3 .
Используя приготовленные указанные . сегменты, осуществлялись ступенчатым образом реакции катализированного связывания 14 лигазы, как описано ниже: а) 5 -нефосфорилированный сегмент 1 смешивался с фосфорилированными сегментами 2, 9 и 10, и подвергался воздействию Т4 лигазы с образованием дуплекса 1
P HK(Brown и др„1979 г. "Методы в энзимиологии", 63, 109-151). Этот дуплекс извлекался методам препаративного гель электрофореза на 15%-ом полиакриламиде. б) 5-нефосфорилированный сегмент 6 смешивался с фосфорилированными сегментами 3, 4, 5, 7 и 8 и подвергался воздействию Т4 ДНК лигазы к образованию
Дуплексной формы ДНК 2. Этот дуплекс очищался электрофорезом на 15%-ом полиакриламлидном геле. с) ДНК дуплексы 1 и 2 затем соединялись вместе посредствам Т4 лигазы, образуя ДНК дуплекс 1100 (фиг.б), который очищался электрофорезом на 10",, -ом п м и акриламидном геле. Этот ДНК дуплекс за тем ферментно фосфорилиравалс.я с использованием Т4 полинуклеа нд к,;л:л ы и ","32 Р-АТР посредством указаnнсл. и!ъ, процедуры.
Экспрессируемая плазмида р1 (0 с! роилась путем сшивки 0,1 пикамоля (0,4 мк() фрагмента Xbal Bam Н! Плдзмиды pI:E N021 (107 на фиг.4), 0,025 пикомолей синтезированного фрагмента ДНК (1100 на фиг.б) и
0,3 пикомоля (0,08 мкг) фрагмента.538 вр плазмиды pN М575 в 24 мкл буферного раствора сливки с использованием Т4 ДНК лигазы, После инкубации в течение 16 ч при
4ОС смесь использовалась для трансформации Е,соИ IA221 (NRR LB-15014). Трансформанты отбирались.на агаровых пласт»нах, сод ржащих 100 мкг/мл ампициллина, и
2Ъ
1838413
5 -СТЛСЛ(э66ТЛ !"! ЛЛ ЛЛТ(! ИТЛТТСЛ ГТТ ЛЛТЛЛ(< Л С(1hh . ;ЛТСЛ 1 Л !ССЛТТТСССЛI I I4 l I l l1l I l I l l I I l l l l l I k l l I l l l t I l l l l l l l l l l l l I I I l I l I Ill I I I I
3 -ТСССЛТЛЛ (ТЛТТЛСЛТЛТЛЛСТЛЛЛЛ! ЛТТ(: С (:< ТТЛ ГЛ Г hThÑ<;ThhhGGGThu;A1ÏGÑ(:ÑTÃ.-3
I f l l I l l l l l l l
TGGThhG(СГЛГЛ(СТ-5
Двухнитевой ДНК фрагмент синтезировался фосфотриэфирным способом с вводом короткой открытой рамки считки (цистрон) в переднюю часть кодиДанный фрагмент получался методом распознавательного фосфотриэфира, посредством которого получались следующие сегменты:
1) 5 - G fAGAGGGTA1TAATМТОТАТАПСАТПТЛАТЛАССЛСЗ
2) 5 -GAATAATCATATGGAÒÒÒÑÑCAÀÑÑÀ×TÑÑÑÑÒÑ-3, „. з5-) схиаассслл1сспсаслллтсслтлтслплпсс)ссп.-з ) 20
4) 5 -Л Т ЛЛЛТСЛЛТЛТЛСЛТТЛЛ ГГЛТЛСССТТ-3
Используя приготовленные, какукаэано выше, сегменты, осуществлялись катализи рованные Т4 лигазой реакции соединения путе)л смешивания 5 -нефосфорилированных сегментов 1 и 3 с 5 -фосфорилированными сегментами 2 и 4 и воздействия на данную смесь Т4 лигазы, Полученный дуплекс затем очищался путем электрофореэа на10 j, полиакриламидном гоеле, ЭтотДНК . дуплекс затем ферментно фосфорилировался с использованием Т4 полинуклеатидокилазы, и ) 3 -ИТР путем следующей процедуры. Э кс и ресси руемая плаз)лифа 35
hGH р1103 строилась путем сшивки 0,1пико-: моля (0,4 мкг) фрагмента Xbal-Xhol плазмиды р1101 с 0,025 пикомолями синтезированного ДНК фрагмента в 24 мкл буферногоо раствора сшивки с использова- 40 нием Т4 ДНК лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 40С эта смесь использовалась для трансформации Е,col! lA221 (МКИ
0-15014. Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержащих 100 45 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивировались, как предпочтительный источник желаемой выраженной плазмиды р1103 (фиг.7).
Е, Построение Е.coll К12 RN308/ð!
110А.
Плазмида р! 110 описана в примерах Н! публикации Европейского патента N
0217529, рассматриваемой здесь как ссылочный материал. Рестрикционная и функ- 55 циональная карта плазмиды р 110 представлены на фиг.8.
Примерно 1 мкг плазмиды pL110 ДНК вываривалось с ферментом Ndel в общем объеме 20 мкл, содержащем 2 мкл высокосолевого буферного раствора 10Х (1,0 моль рующей последователь ности LG H, Этот двухнитевой ДНК фрагмент имел указанную ниже последовательность:
NaCI, 0,50 моль Трис-HCl, рН 7,5, 0,10 моль
МоС!2 и 10 мМоль дитио1риито),3 единицами фермента Ndel в течение часа при 37 С.
Реакционная месь экстрагировалась смесью фенол/хлороформ и ДНК осаждалась этанолом. Вываренная с !!с!е! плазмида pL110 ДНК растворялась в 50 мкл буферного раствора Кленова !Х (40 мМоль
КР04, рН 7, 5, 6,6 мМоль MgCl; 1,0 мМоль
2-меркаптоэтанол, 33 мкмоль dATp, 33 мкМоль dCTP; 33 мкМо)!ь dGTP и 33 мкМоль
TTP). Дава микролитра (10 единиц Mew
England Hiolabs) крупного фрагмента ДНК полимеразы 1 Е.со!!, известного как фрагмент Кленова, вводили в данную ДНК и смешивали с ней, полученная реакционная смесь инкубировалась при 16 С в течение часа. Данная реакция завершалась путем экстракции фенолом и ДНК очищалась обычным образом.
Вываренная с Nde 1 и обработанная фрагментом Кленова ДНК затем сшивалась с Т4 ДНК лигазой при 4 С в течение 16 ч.
Полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом
RV308 штамма Е,col! К12 (NRRL-15624), Трансформанты отбирались на L-агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/)лл ампициллина, и плазмиды отделялись от полученных колоний путем быстрой. щелочной экстракции, описанной Birnboin и 0о!у. Была отобрана плазмида ph110A (на фиг.8) с отсутствием точки ddel, F. Построение фага ph110P путем сайтспецифическогоо мутагенеза.
Процедура удаления сайта Ham Hl в гене тетрациклин резистентной пугем сайтспецифическогоо мутагенеза показана на фиг,8.
Г, (i) Построение фага М13Тс3.
Плазмида pL110 служила в качестве источника гена тетрациклин-резестентной.
Примерно 50 мкг плазмиды р! 110 в 500 мкл буферного раствора TE вводили в 25 мкл буферного раствора 10X Hind ill и 170 мкл воды. Примерно 5 мкл (50 единиц) фермента Hind ill вводили в раствор ДНК плазмиды ph110 и образующуюся реакционную
1838413
2E смесь инкубировали при 37 С в течение 2 ч, Примерно 13 мкл 2 моль Трис. 14CI, рН 7,4, и 5 мкл (50 единиц) ограничительного фермента EcoRI вводили в вываренную с Hind
lll ДНК плазмиды pL110, данная реакционная смесь инкубировалась в течение более
2 ч при 37 С. Реакция прекращалась путем экстрагирования реакционной смеси фенолом, насыщенным ТЕ; фенол удалялся путем экстракции хлороформом. Вываренная с
ЕсоК 14ind III ДНК плазмиды рН110 затем извлекалась путем осаждения и центрифугирования, вводилась в 1%-й агарозный гель, выделялось и подвергалось очистке большое количество ограничительного фрагмента 4,3 кв EcoRI-Hind II.
Примерно 5 мкг фага m/Çmð18 (New
England Biolabs) растворялась в 50 мкл буферного раствора ТЕ, затем вываривалось с
Hind Ill и EcoRI, как описано выше. Образованная Hind III-EcoRI ДНК фага М13 mp18 очи.цалась, как описано для р(110, с той разницей, что был выделен и подвергнут очистке фаагмент -7,25 кб.
Примерно 100 нанограммов фрагмента
4,3 кб плазмиды ph110 смешивались в примерно 100 нанограммами фрагмента 7,25 кб I4ind III-Есор! фага М13. mpl18, 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 1 мкл (100 единиц) Т4 ДНК лигазы и 14 мкл Н20. Эта, реакционная смесь сшивки инкубиравалась при 15 С в течение 1,5 I, сшитая ДИК заключала в себе желаемую ДНК фага 13Тс3. Рестрикционная и функциональнал карта фага
13Тс3 представлены на фиг.8.
Один миллилитр ночной культуры Е.coli
К12 IM109 (Е,coli К12 IM101, полученная из
New England Biolabs, могла быть использована вместо Е,coli К12 IM109) использовали для инакуляции 50 мл питательного бульона, полученная в результате культура инкубировалась при 37 С с аэрацией до тех пор. пока ODrro не достигала значения от 0,3 да
0,4, Клетки повторно суспензировались в 25 мл 10 мМоль NaCI, инкубировались на льду в течение 10 мин и собирались путем центрифугирования. Эти клетки снова суспензировались в 1,25 м 75 мМоль СаС ; 200 мкл аликвоту этих клеток удаляли, вводили в 10 мкл сшитой ДН К, приготовленной как указано выше, и инкубировали на льду в течение примерно 40 мин. Смесь клетки-ДНК затем инкубировалась при 42 С в течение 2 мин, а различные аликвоты (1, 10 и 100 мкл) удалялись и вводились в 3 мл верхнего агара (L питательный бульон с 0,5% агаром, поддерживаемом s расплавленном состоянии при
45оС), который также содержал 50 мкл 2%
Х-Gal 50 мкл 100 м Моль IPTG и 200 мкл Е.coli
К12, IM109 в логарифмической фазе роста.
20
50
Смесь клетки — верхний агар затем помещалась на пластины с агаром. содержащим 40 мкгlмл Х-Gal (5-брома-4-хлора-3-индолил-PD-тиогалактозид) и 0,1 мМоль IPTG (изопро5 пил p-D-тиогалактозид), а эти пластины инкубировались при 37 С в течение ночи, На следующее утро несколько прозрачных в отличие от колоний индивидуально использовались для инокуляции 2 мл питательного бульона L, полученные в результате культуры инкубировались при 37 С с аэрацией в течение 2 ч. Отсутствие синего цвета говорит о том, что произошла желаемая вставка ДНК, Затем данные культуры
5 центрифугировавались, и 200 мкл полученного поверхностного слал вводили в 10 мл культуры (00ка = 0,5) Е. coli К12 IM109, выращенной при 37 С с аэрацией. Эти культуры инкубировались еще в течение 30 мин при 37 С; затем клетки гранулировались пуо тем центрифугирования и использовались для получения репликэтивной формы рекамбинантного фага, который они содержали, Двухниточная репликативнал форма
ДН К фага была выделена из клеток с использованиемм процедуры, описанной в примере
1 в уменьшенном масштабе. Трансфарманты, содержащие ДНК фага m 13Tc3, были идентифицированы путем рестрикционного . анализа фаговой ДНК.
F. (й) Получение аднонитевай ДНК фага
m 13Tc3.
Полтора миллилитра ночной культуры
Е,coli К12 IM109/m 13Тс3 подвергали центрифугировани а, 100 мкл поверхностного слоя, содержащего фаг m 1ЗТсЗ, использо- валась для инакуллции 25 мл культуры Е,соИ
M109 I при ООыа примерно 0,4 — 0,5. Культура инакулиравалась в течение 6 ч при 37 С с аэрированием, в течение этого времени культуру центрифугировали и полученный поверхностный слой (примерно 20 мл) переносили в новую трубку. Примерно 2 мл раствора, содержащего 20% палиэтиленгликоля (PEG) 6000 и 14,6%
NaCI, вводили в этот поверхностный слой ценпгрифугирования, который затем инкубировали на льду в течение 20 мин.
Этот поверхностный слой центрифугиравали в течение 25 мин при скорости вращения центрифуги 700 аб/мин, и полученная гранула, которал содержала однаниточную ДНК фага m13Tc3, снова суспензировалась в 500 мкл буферного раствора ТЕ.
Раствор ДНКдвукратно экстрагировали насыщенным TE фенолом и двукратно экстрагировали хлороформом. Затем осаждалась однонитачная ДНК с использованием
Na0Ac и этанола и подвергалась центрифу1838413
45 в каждом из dGTP TTP u dCTP 1 мкл (2 ед, Pharmacia Р,L. Blochemicals, 800 Centennial 50
Avenue, Piscataway, N.J. 08854) фермента гированию. Полученная грэнула промывалась 70 ь этанолом, высушивалась и затем растнорялась в 60 мкл HzO.
F. (ill) Мутагенеэ.
Фрагмент однонитевой ДНК, используемый 0 мутагенезе, был синтезирован н автоматическом синтезаторе ДНК, Этот фрагмент имел указанную последовательность
5 -CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3 и был гомологичен зоне, окружающей точку Вагп Н! (5 -GGATCC-3 ) в придающем стойкость к тетрациклину гене от плазмиды
pBR 322 с той разницей, что группа А вторая от конца 5 (или третья от конца 3 ) представляет собой С в плазмиде p8R 322. Такая замена не изменяет аминокислотный состав придающего стойкость к тетрациклину белка, но устраняет точку Bam Нl.
Примерно 10 пикомолей мутаген ной затравки и универсальной затравки 13 (Bethesda Research Laboratories (BRL) Р.О.
Всх 6009, Gaithersburg, MD 20760) обрабатывались отдельно 10 единицами (BRL Т4 палинуклеотидокиназы в 20 лкл буферного раствора киназы !Х(60 мМоль Трис. HCI, рН
7,8; 15 ммоль 2-меркаптоэтанола;
10 мМоль MgClz; 0,41 лКмоль ATP в течение 30 мин при 37 C. Обработанная кинэзой ДНК использовалась в операции мутагенеза, описанной ниже, Отжиг осуществлялся путем перемешивэния друг с другом 300 нанограммов (1,2 мкл) однонитевого фага 13ТсЗ, 1 пикомоля (2 мкл)универсальной затравки, 1 пикомоля (2 икл) мутагенной затравки, 2 мкл 10Х буфериогоо раствора (100 мМоль Трис. HCI, рН 7,5; 1 мМоль ЕДТА; 500 мМаль NaCI) и
12,8 мкл Н О, Реакционная смесь инкубировалась при 80"С н течение 2 мин, при 50 С в течение 5 мин и затем охлаждалась до комнатной температуры. . Реакция удлинения цепи осуществлялась путем ввода 5 мкл экстенсивного буферного раствора 10Х (500 мМоль Трис. Н Cl, рН 8; 1 мМоль ЕДТА и 120 мМоль MgClz), 5
MKJl 2 мМоль, ATP, 1 лкл 6 MMonb раствора
Кленова; 1мкл (100 ед,) Т4 ДНК лигазы; 17 мкл НгО в смесь аналелированной ДНК, Реакционная смесь вытягивания цепи инкубировалась при комнатной температуре в течение 1 ч, затем при 37 С в течение.2,5 ч и затем в течение ночи при 4 С.
Реакция прекращалась посредством двух экстракций насыщенным ТЕ фенолом, за которыми следовали две экстракции
10
СНС!з, ДНК осаждалась этанолом и NaOAc.
ДНК извлекалась путем центрифугирования и повторно суспензировалась н 50 мкл Н;О, 6 мкл буферного раствора 10 XSI затем вводили в этот раствор ДНК.
Раствор ДНК был распределен поровну в три трубки. В две из этих трубок вводили примерно 200 единиц (Miles Laboratories Sl) нуклеазы, Одна реакционная смесь инкубировалась при комнатной температуре в течение 5 мин, другая в течение 10 мин.
Реакции прекращались путе л экстракции реакционной смеси двукратно насыщенным
ТЕ фенолом. За фенольным экстракциями следовали две экстракции хлороформом; затем ДНК осаждалась из реакционной смеси
NaOAc и этанолом. Не подвергнутый обработке образец ДНК служил н качестве негативного контрольного образца.
Обработанные Sl образцы хранились отдельно друг от друга в ходе остальной части процедуры, но результать1 получались аналогичные.
Гранулы ДНК повторна суспензировались н 20 мкл HzQ, 10 мкл полученного раствора использовалось для трансформации
Е.coli К12 IM109 (Е.col! К12 IM101 также можно было использовать) согласно процедуре, используемой при построении фага гп13ТсЗ стой разницей, что ни ipTG ни Х-Gal не подавали на пластины, Двухнитевая репликативная форма
ДИК была выделена примерно из 48 колоний как описано выше и отобрана на присутствие ограничительной точки Bam Hl.
Маоляты без точки были отобраны путем получения однониточной ДНК, как описано выше, Однониточная ДНК была построена в форме последовательности с использованием метода построения дидеоксипоследавательности (!.Н.Smith„ 1980 r., "Методы в энзимологии", 65:560-580). Желаемый изолят был обозначен pL110B (фиг.8).
6, Построение плазмиды pL110C.
Г1римерно 50 мкг репликатинной формы
ДНК фага pL110B вываривались в 250 мкл буферного раствора IX Nde! (50 мМоль NaCI;
6 мМоль Трис. HCI, рН 7,5; 6 мМоль MgClz u
6 мМоль Р-меркаптоэтанол), содержащего
50 единиц фермента Ndel при 37 С в течение 2 ч, 5 мкл, 5 мМоль NaCI затем вводили в обработанную Ndel ДНК фага pL110B, после чего вводили 5 мкл (.50 единиц) фермента Sal. Вынаринание продолжалось в течение 2 ч при 37 С. Желаемый фрагмент
422 Ndel-Sall, содержащий мутантную тетрациклин-резистентности гена, затем был выделен из акриламидного геля.
ДНК плазмиды pL110A затем вываривалась с Ndel u Sall н аналогичных условиях, 1838413
40 тифицировалась среди трансформантов путем отделения плазмиды и последующего рестрикционнаго анализа, I. Построение плазмиды р1104
Плазмида pCZR 336 представляет собой вектор экспрессии, который использует и ромотор Aph. Для соединения
ОАС$/DAOCS с промоторомЯр! в плазмиде
pCZR 336, необходимо использовать синтезированное связующее звено ДНК. Это свяэующее звено соединяло сайт Nde плаэмиды pCZR 336 с сайтом Sstl в кодиру-. ющей последовательности DACS/DAOCS u
50 имело приведенную ниже структуру: 7
5 -TATGACTTCCMGG I TССССТСТТТССТСТЛСЛССЛССТСЛЛСЛСССССЛЛССТССТСЛСССЛССТ-3
ilffllllllfllllllllllffff!!!3!!!)!!!!!!)!!В!!(!!!!3!!!!!!!!!
3 -ЛСТСЛЛССТТССЛЛСГССЛСЛЛЛССЛСЛТСТССТССЛСТТСТСССССТТССЛССЛСТССС-5
I отличающихся тем,.что фаг pL110B был замвнен плазмидом pL110A. Ограничительный фрагмент 6,1 кб Ndel-Sall плазмиды
pL110A был очищен от агарозы, Желаемая плаэмида pL110С была построена путем сшивки друг с другом 100 нанограммов каждого из фрагментов NdeiSall плазмиды pL110A (6,1 кб) и pL110B (422 п.о.) с использованием обычной процедуры. Желаемая плазмида 110С придает устойчивость к 10 мкгlмл тетрациклина в
Е.соИ, но не имеет сайта Bam Hl тетрациклинреэистентности гена, Н. Построение плазмиды pCZRIII.
Плдзмида pCZRIII была построена путем сшивки фрагмента 3,5 кб EcoRI-Pstl плаэмиды pL110C (содержащей не поврежденную кодирующую последовательность) с фрагментом 3 кв EcoRI Pstl плазмиды
Р1Т160. Плаэмида Р1Т160 содержала фрагмент — 3 кб EcoRI-Pstl. образованный от плаэмиды pL110C, вставленной в обработанную EcoRI-Pstl плазмиду PVC18 (New
England Biolabs). Этот фрагмент — 3 кб содержал ген тетрациклинрезистеí Tíости плазмиды pL110C с той разницей, что сайт
Clat был исключен. Рестрикционная и функционалbHая карта р1Т160 представлены на фиг.9, Плаэмида р1Т160 могла быть образована от Е.coli К12 IM109 (р1Т160, имеющейся в лаборатории NRRL, где она хранится под номером ЯКИ В-18135) в основном согласно процедуре, описанной в примере 1, Плазмида р1Т160 придает устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина и в ней отсутствует сайт рестрикции. Clai. Тетрациклин реэистентности плэзмиды р!Т260 очищался на фрагменте Psti-EcoRI для использования s построении плазмидь pCZRII I.
Примерно 50 мкг ДНК плазмиды pL110C (пример 2G) инкубировались в общем обьеме 250 мкл 1Х ECORI буферного раствора, содержащего 10 мкл (50 единиц) EcoRI, в течение 2 ч при 37 С. Затем вводился 1 мкл (5 единиц) рестрикционного фермента, и инкубация продолжалась при 37 С, Аликвоты удалялись примерно каждые 5 мин и экстрагировали ь электрофоретически на агарозном геле, Желаемый фрагмент -3,5 кб EcoRI-Pstl содержал неподвергнутый воздействию ген в GH и включал внутренний сайт Pstl (на нарезаемый в ходе частичного вываривания с Pstl). Желаемый фрагмент
35 отделялся от нежелаемых фрагментбв: фрагмента 2,5 кб Pstl-Pstl, который содержал лишь часть гена в GH, фрагмента 3 кб
Есор-Pstl, который содержал ген тетрациклинрезистности; и фрагмента - 6,5 кб EcoRI (невываренный Pstl). Фрагмент 3.5 кб
Pstl-EcoRI очищался и сшивался с фрагментом 3 кб Pstl-EcoRI плазмиды plT160, Сшитая ДНК использовалась для трансформации Е.col!К12; IM109, и желаемая плазмида, обозначенная pCZRIII и показанная на фиг.10, выделялась из трансформанта и характеризовалась с помощью общепринятых методик. Плазмида pCZRIII также могла быть получена из л аборатории NRRL, где она хранится под номером NRR LB-18249.
1. Построение плазмиды pCZR336.
Плазмида pCZR336 является вектором экспрессии, построенным на основе ХЬаlBam Hl фрагмента плазмиды PCZRIII (пример 2Н) и двухцистронной структуры GH от плазмиды р1103 (пример 2Д и фиг,7). Примерно 50 мкг плазмиды р1103 инкубировалось в 250 мкл высокосолевого буферного раствора IX, содержащего 50 единиц каждого иэ ферментов Bam ill u Xbal в течение
2 ч при 37 С. Фрагмент 650 п.о. Xbal-Bam
Hl, содержащий первый цистрон, и ген, кодирующий последовательность СН, отделялся и очищался от акриламидного геля.
Примерно 50 мкг плазмиды pCZRIII (nðèìåð
2Н) также вываривалось с ферментами Xbal и Bam Н! и большой фрагмент Xbal-Bam Hl очищался от агарозы. Два фрагмента ХЬа!Bam Hl сшивались вместе друг с другом, и сшитая ДНК использовалась для трансформации Е.соИ К12 RV308 (NRR LH-15624) с использованием общепринятых процедур.
Желаемая плаэмида PCZR336 (фиг,11) иден1838413
Эта связующая молекула была синтезирована в автоматическом синтезаторе ДНК в виде двух одиночных нитей с использованием общепринятых процедур. Эта связующая молекула имеет несколько отличий от естественной последовательHости
CephalosporIum, ни одно из которых не оказывает нежелательногоо влияния на белок, кодированный получаемой последовательностью, Эти изменения включают: 1) образование сайта Ndel, включающего трансляционную инициирующую. точку; 2) замену С на А в третьем положении кодона
10, который составляет лейциновый кодон, поскольку CTC и СТА эквивалентны, образуя сайт Xbal и 3) замену С на Т в третьем положении четвертого кодона, который составляет алиновый кодон, поскольку GTC u
СТТ эквивалентны.
Для облегчения последующего клонирования связующая молекула клонировалась в плазмиду pUC19 (New Llgland
Biolabs). . Примерно 5 мкг плаэмиды pUC19 рас творялись в 50 мкл буферного раствора IX
Sstl (50 мМоль NaCI; 50 мЫоль Трис. НС1, рН
-7,5; 10 мМоль М9С!2), содержащего 10 единиц фермента Sstl (BRL). Данная реакционная смесь инкубировалась в течение 2 ч при 37 С, Концентрация NaCI в реакционной смеси затем увеличивалась до 150 мМоль путем добавления 1 мкл 5 мол. NaCI, Вводили примерно 2 мкл (10 единиц) фермента Ndel и смесь инкубировалась в течение еще 2 ч при 37 С. Затем осаждалась
ДНК и извлекалась путем центрифугирования, Примерно 100 нанограммов вываренной e Ssti-Ndel плаэмиды риС19 смешивалось с 1 пикомолем синтезированного связующ го в буферном растворе лигаз4 с
Т4 ДНК лигазой. Сшитая ДНК использовалась для трансформации клеток Е,coli К12 !
М109. и аликвоты этой смеси высевали на чашки на I -агзре {питательный бульон с 15
i на литр агара), с содержанием 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 40 мкг/мл
PTG.
Эти чашки инкубировались при 370С в течение ночи. Колонии, содержащие плазмиду беэ вставки, такие как i:-.coli К12
IIv1109/pUC19, проявляли синий цвет на этих чашках. Колонии, которые содержали плазмиду с вставкой, такие как Е.coil K12
M109/p1104, были белыми. Отбиралось несколько белых колоний и осуществлялся их отбор методом рестрикционногоо анализа их плазмидной ДНК на присутствие фермента -60 bp Ndel Sstl с той же последова тельностью, что и синтезированный, как
5 .10
40 указано выше, фрагмент. Типичный изолят желаемого построения обозначен как плазмида р1104 (фиг.12).
К, Окончательное построение плазмиды р1Т507
Плазмида р1Т507 была построена путем сшивки содержащего кодирующего последовательностьОАСЗ/ОАОСЪ фрагмента
Sstl-Bam lll плазмиды р1Т508 с вставкой
Ndel-SstI плазмиды р1104 и с расщепленным Ndel-Bam Н! фрагментом плазмиды
pCZR 336. Фрагмент 2,2 кб Ssti-Bam Н! . плазмиды р1Т503 (пример 1) получен путем полного вываривания с Bam Hl и частичного вываривания с Sstl (другой сайт Sstl расположен на 50 п.о. от сайта Bam Н! в желаеглом фрагменте 2,2 п.о.), Плазмида р1Т503 в количестве примерно 50 мкг растворялась в 250 мкл буферного раствора IX Sstl, содержащего 50 единиц
Bam HI, и реакционная смесь находилась при 370С в течение 2 ч. Затем вводили один мкл (-10 единиц фермента Ssti) осуществлялась реакция при 37 С. Аликвоты удалялись каждые 5 мин, охлаждались смесью фенол/СНС!з, осаждалась ДНК и осуществляпаса грануляция путем центрифугирования.
Фрагмент -2,2 кб Sstl-Bam Hl, содержащий наибольшую часть кодирующей последовательности экспандазы/гидроксилазы, выделялся и очищался от 6% акриламидного геля, Примерно 50 мкг ДНК плазмиды pCZR
336 (пример 21) суспендировались в 250 мкл высокосолевого буферного раствора, содержащего примерно 50 единиц каждого из ферментов Ndei или Barn Н! и смесь находилась при 37 С в течение 2 ч.
Ф рагмент 3,8 кв Ndel-Âàãn Hl плазмиды pCZR 336, который не имел кодирующей последовательности, затем был выделен йз агарозного геля.
П ри мер но 100 гл кг пл аз миды p1 104 (и ример 2I) суспендировалось в 500 мкл буферного раствора IX Sstl, содержащего примерно 100 единиц фермента Sstl, и эта смесь находилась при 37 С в течение 2 ч.
Концентрация !чаС! затем увеличивалась от
50 до 150 мМоль путем добавления 10 мкл 5 моль NaCI. Вводили примерно 20 мкл (100 единиц) фермента Ndel и смесь инкубировалась дополнительно 2 ч при 37 С. Желаемый фрагмент 60 вр Ndel/Ssti очищался от 15% агарозного геля.
Примерно 100 нанограммов фрагмента
5,8 кб Ndel-Вагп Hl плазмиды pCZR 336, 100 нанограммов фрагмента -2,2 кв SstlBam Hl плазмиды plT503 и 50 нанограммов фрагмента — 60 рв Яэ Н!де! плазмиды р1104 сшивались вместе с лигаэой Т4 ДНК.
1838413
Сшитая ДНК использовалась для трансформации клеток Е.coll К12 IM109 с использованием обычной процедуры с той разницей, что клетки выращивались при
30 С, а не при 37 С (для предотвращения транскрипции от Aph). Сшитая ДНК смешивалась с 100 мкл компетентных клеток М109 (промышленно получаемых Stratagene
Corp., 3770 Fansy Street. Сан Диаго, Калифорния, 32121), инкубировалась при 4 С в течение часа, затем инкубировалась в течение 1 мин при 42 С и затем разбавлялась 2 мл свежего питательного бульона 1 и инкубировалась при комнатной температуре (без встряхивания) в течение часа. Аликвоты высева jMcb на чашках с агаром. содержащим тетрациклин, 10 мкг/мл. Чашки инкубировались при 30 С. Трансформанты Е.соП
К12 IM109/plT507 идентифицировались путЕм рестрикционного анализа плазмидной
ДНК. Рестрикционная и функциональная карта плазмиды plT507 представлены на фиг.11.
Пример 3. Определение продуцированной Е.coll активности DACS/DAOCS.
А. Культура Е.coll К12 IM109/piT507: экспрессирующая активности
ЙАСЯ/DAOCS.
Трансформанты Е.coll К12 1М109 (р
1Т507 (прийер 2К) выращивалась при 30 С в течение ночи в 500 мл питательного бульона
L (содержащего 10 мкгlмл тетрациклина) в гироторном инкубаторе, вращающемся со скоростью 250 об;/мин, Клетки разбавлялись (1;10) путем ввода 100 мл ночной культуры в 900 мл свежеприготовленной среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, в 2,8 л колбы Fornbach и дополнительно инкубировались в течение часа при 30 С в тех же условиях выращивания. Температура воздушного встряхивателя затем повышалась до 42 С, инкубация продолжалась дополнительно в течение 6,5 ч. Чувствительный к температуре репрессор с 1857 лямбда pl промотора, установленный таким образом, что обеспечивалась экспрессия
DACS/DA0CS на плазмиде plT507, был инактивирован при 42 С и, таким образом, допускал экспрессию DACS/DAOCS. После инкубации клетки собирались путем центрифугирования и использовались как предпочтительный источник продуцирования активности DACS/DAOCS.
В. Иллюстрация активностей экспандазы и гидроксилазы в клетках Е.coll К12
1М109/pIT507, выращенных при 42 С, Пример 14 r (сырая масса) клеток Е.coll
К12 IM109/plT507, приготовленных как описано в примере 3Л. повторно суспендирова30
35 с использованием 0,28 мМоль пенициллина
40 N 60 мМоль а-нетоглутарата (а-KG), 0,06 мМоль сульфата железа (двухвалентного), 50
55 . вался методом жидкостной хроматографии высокогодавления следующим образом. Ак5
Ф
25 лись в Трис-GEDA буферном растворе (15 мМоль Трис. HCI, рН 7,5; 10 (глицерин;
10Я, этанол; 10 мМоль дитиотрситол; 10 мМоль аскорбат) в общем объеме 20 мл.
Клетки разрывались путем пропускания звука при 4 С или ниже тремя 30-секундными импульсами полной мощности. В ходе пропускания звука осуществляли многоократный ввод фенилметилсульфонилфторида (pMSF) до тех пор, пока окончательная концентрация не становилась равной 2 мМоль.
Вводили декоксирибонуклеазу и сульфат магния до тех пор, пока не достигались концентрации соответственно 1 мкг/мл и 2 мМоль. Подвергнутая пропусканию звука суспензия подвергалась центрифугированию со скоростью 40000 Я9 в течение 30 мин.
Поверхностный слой заключал в себя сырой экстракт фермента 0АСЯ/DAOCS, Этот сырой экстракт объемом 13 мл вводился в 50 миллитровую колонну ДЕАЕ-Тризакрил, предварительно уравновешенную с
15 мМоль Трис-GEDA, рН 7,5. Колонку промывали 4-мя объемами 15 мМоль буферного раствора Трис-GEDA и затем линейным градиентом от 0.015 мМоль Трис-GEDA до 0,3 мМоль Трис-GEDA. Пятимиллилитровые фракции собирали при скорости потока 15 мл/ч. Фермент элюировался как один основной пик активности, Активности DAOCS (экспандоза) и
DACS (гидроксилаза) элюировались с тем же временем удерживания.
Ферментную активность определяли, осуществляя анализ, основанный на жидкостной хроматографии высокого давления.
Катализированная экспандазой реакция осуществлялась в течение 15 мин при 30 С
0,67 мМоль аскорбата, 1 мМоль дитиотреитола, 0,05 мМоль АТР, и 0,000-0,00 ед. фермента в 1 мл 50 мМоль Трис. HCI, рН 7,5.
Катализированная гидроксилазой реакция осуществлялась при 36 С в той же среде с деацетоксицефалоспорином С концентрацией 0,05 мМоль вместо пенициллина N, Ферментные реакции прерывались путем добавления 1 мл этилового спирта.
Осажденный продукт отделялся путем центрифугирования при 4000 xg в течение 5 мин. Поверхностный слой, содержащий ферментные продукты реакции, анализиротивность экпланлазы была определена путем измерения образования как DAOC. так и DAC из пенициллина ввиду явной бифунк183 Ь413
Частичная очистка DAOCS u DACS от 14 г Е.coli К12 lM109/plT511.
4 о
1 милли и = наномолей продукта в минуту на миллилитр экстракта.
2 Не определено. циональности фермента, Активность гидроксилазы определялась путем измерения образования DAC из DAOC.
Аликвоты (от 20 до 100 мкл) поверхностных растворов анализировались на DAOC u
ОАС посредством жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) с использованием внешних стандартов.
Предпочтительная система flPLC включала два компонента: систему регулятора модели
721 модуль данных модели 730, насосы модели 510 EF, водяной артикуляторный процессор образца модели 7108 и спектрофотометр лямбдамакс модели
481L (Waters Anoc., Milfor, М.А.) DAC u
DAOC разделялись предпочтительно с помощью колонки с радиально упакованными опрессованными микроБондпэк(0,8 х 10 CM) (Waters Assoc.) с подвижной фазой 2 уксусной кислоты; 0,4$ метилового спирта,.
6 — 7% ацетонитрила; 87 — 92)(воды; рН 8, Скорость потока составляла 1,5-2,0 мл/мин, детектирование осуществлялось при 260 нм (цефалоспоринхромор). Результаты анализа были воспроизводимыми с 27, отклонениями при дубликатных анализах
5 катализированных как экспендазой, так и гидроксилаз0й, и гидроксилазой реакций.
Для анализа экспландазы количественная оценка на DAC (в дополнение к количественной оценке DAOC) корректировалась на пе10 нициллин N виду совместного элюирования.
Рсзультаты анализа приведены ниже.
Формула изобретения
15 Способ экспрессии 0АСЯИАОС$ активности в клетках Escherichla coll, заключающийся в том. что осуществляют трансформацию штамма-реципиента Е. coll
К12 lm109 рекомбинантной плазмидной
20 ДНК plT 507 с последующим отбором клонов; экспрессирующих DACS/DAOCS-активность.
1838413
Eeoc
BamH
Есор рКЕЯ11!
EcoRI
vugg
РраХ
Рра1
fc_#_I а. аКЕ
Жа1 Е
Юа11 //раХ
950 Ър НраХЕгадтел1 AluI йб2бр АЬ1 Frcrgrsent
Есин 4иМед.ю
73 liguse Еа)Ю
4ЮЮ Бр ЬЮК1
Л agent
pBR222
Есюк1 i ndN
PvuE
Ееок1
ФЯа,Ыт
Рйтрйа1аае
r„ZPg 4 1838413 ! . PLasmi d 103fFi pure 2J ИлИ7 ЮЮсйазг BamhI 4сюХел Òð Л!И Ыдале ,» далЖ» Т ЭКА 4 разе EeoA аХ ОХ Ю7М ь Eeottt Narti ut ЖряЫ ол 81фис&же 1 И пай 4тйегз Я.ЮИ Ьщале Hind ß / TЭЯА ligase Ю Я uI ЕюЮ dambI 1838413 PEusrmu 105(РЩОРСМ ) SatI ЮатУХ Жадюг Phuspbut Р1ала ЫрХЕИЯ ffdf л Fi gureZ ) риХ SulI4гюМ гг TqDh_#_ Li guse ) St71l Лаю Ваяйте Илйегз Т УЛФ4фюе EdmA Х = У5ЮЗр Ргаущеп1 ЗаИ,8amh1 Ends АМ EcL7RI сйы7Ж 1838413 ptrpE5d50ñÀÅÍ800 trpp Р10ЯпЫ ДВК32Х f08tn Рщиге Ь )8uriwI /И7(юР Рдлрдю1 ЮУР Г/ алЫ 7ы ы е4/ Hindй рЮ/74Ч fia Z Fnu27E РыХ NvuE dames plusmid оаИт f100 f09i n Figure 5) SónßeËс р ат Ятрпгл/ Гав 4 р Samer Гаа2П Fragment 1838413 НИХ PstI и/Н1 atI fcaRI fc0RI Н(па//// t// de1 1. Nde1 Еяепо s.T,I/N Ligase 4 TranstormRVJ08 1. EcuRI ЕН @1/// 2lsutute4 М Fruyment O Ump 6! te TeR 6епе 4igase torm RYE// heI ut1 FcoRI gtI/ Фиа8 И ° 69юааН! EcaEi И1е! 7сйбепе Ра11 8umNI фе Га// ь о41/0А Ъ Ло РИА4igase (0500bp) < Рсо//1 2Transtorm ЭИ/00 . ф 8010 JIsutate Ыпа/е Pvu// Е "801 Strand 1®Пе1 . Ваа/ Н1 31 (/4 2 Яо11 11п ч Ь о mutagens/s ьИИ NheI " Вап/Н! $аИ тд)епопуеС-д) m 7Ô/0g Remticatt ve urm 1838413 Sca М Х Sat ©гЯ Составитель Н, Бурбело Техред М, Моргентал Корректор И. щулла т Редактор С. Кулакова Заказ 2905 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Her у ;у у,уу 9D 8. g РХ HI
