Олигонуклеотид в качестве расщепляемого зонда и способ его получения

 

Использование: в качестве расщепляемого зонда. Сущность изобретения: продукт - олигонуклеотид ф-лы RiO-(0)P(OH)-NH-CH2-C(0)-OR2,где Р б АССТАССЗ1,, R2 5 TGGTGGC3 . Выход 48%. Реагент 1: смесь этилового эфира глицина и 1-этил-3.3 -диметиламинопропилкарбодиимида. Реагент 2: гептануклеотид d(TGGTGGT) и тетрадекануклеотид d(TGGATGGACCACCA). Условия реакции при рН 6,0 в присутствии 0,01-03 М 1-этил- 3,3 -диметиламинопропилкарбодиимида. 2 с.п.ф-лы, 2 ил.

<505 С 07 Н 21/04 NT4l.„-, ","

" ИБЛ 1,У -- .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ЬЭ

О

О

О

О

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4954854/04 (22) 10.06.91 (46) 07.09.93. Бюл. М 33 — 36 (71) Химический факультет МГУ им, M.Â.Ломоносова (72) Ивановская М.Г.. Кузнецова С,А„Шабарова 3.А. (73) Ивановская М.Г.. Кузнецова С,А., Шабарова 3.А. (56) Источники информации:

1. С.А. Кузнецова, M.Ã.Èåaíoâñêàÿ, 3.А,Шабарова, Биоорганич, химия, 1990, т. .16, N. 2, с. 219-225.

2. Narang S.À. Tetrahedron, 1983. Ч, 39.

N 1. р. 3-22.

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к получению олигонуклеотидов общей формулы

0 и О-Р-NH-Cl-I - С-ОР, 2я 2

ОН 0 где R1-5ÀÑÑÒAÑCÇ

Иг=5 Т66Т66СЗ . которые могут использоваться в качестве расщепляемых зондов в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, реагентов для направленного мутагенеза в генной инженерии, в качестве аналогов субстратов при изучении механизма действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии, а также в различных молекулярно-биологических исследованиях по белково-нуклеиновым взаимодействиям.

Единственным аналогом сходной структуры, обладающим сходным свойством направленно расщепляться по

„„RU„„ 2000300 C (54) ОЛИГОНУКЛЕОТИД В КАЧЕСТВЕ РАСЩЕПЛЯЕМОГО ЗОНДА И СПОСОБ ЕГО

ПОЛУЧЕНИЯ (57) Использование: в качестве расщепляемого зонда. Сущность изобретения: продукт — олигонуклеотид ф-лы

R >0 0)Р(ОН)-NH-СН2-С(0)ОЯ2, где

R >=5 ACCTACC3,, й2-5 Т66Т66СЗ . Выход

48%. Реагент 1. смесь этилового эфира глицина и 1-этил-З.З -диметиламинопропилкарI бодиимида. Реагент 2: гептануклеотид

d(TGGTGGT) и тетрадекануклеотид

d(TGGATGGACCACCA). Условия реакции при рН 6,0 в присутствии 0,01-03 M 1-этил3,3 -диметиламинопропилкарбодиимида. 2

I с.п.ф-лы, 2 ил. межнуклеотидной связи в заданном положении, является олигонуклеотид I: о

В,О-P-О- Р-ОР>

1 I

ОС2Н5 ОН где Н >=5 АССТАССЗ

R2=5 TGGTGG C3 .

Указанное соединение (I) может расщепляться по замещенной пирофосфатной связи при обработке его различными нуклеофильными агентами. Недостатком этого типа соединений является их высокая реакционная способность, что приводит к тому, что зонд при работе с ним может неконтролируемо расщепляться. Причиной этого является легкость расщепления замещенной пирофосфатной связи при действии нуклеофильных компонентов буферных смесей.

Способ получения соединения (!) заключается в конденсации двух олигонуклеоти2000300 дов (11) и (lll) на комплементарной матрице (iV) под действием водорастворимого карбодии мида.!! О О !1!

II QH HQ

5 ACCTACC P P-Т CC T ССТ 3

3 TCCATCG ACCACCA Ь

ОС н нО

VI СН СООН Ч!! з

ACCTACCp-NH H0 TCCTGC

° т ° ь

TCGATCG АССАССА вводится неприродная сложнозфирна, которая по гидролитической устойчивости превосходит замещенную пирофосфатную в аналоге (1), Больная гидролитическая устойчивость его обеспечивает стабильность соединения при работе с ним, исключает воэможность неконтролируемого расщепления зонда и уровень неспецифических noIv t Водораспiбориныц бочных реакций. В то же время

О q кдабо ооноч IC спожнозфирнапсапзьможетпегкоикопиче5 АЫТАСС-Р,-O-Р— TGCTCCT З г и

1 ственно расщепляться в условиях мягкой

ОлС Н ЬН щелочной обработки, что позволяет расще3 TCGATGGi" " АССАССА З пить пред,агаемыа зонд напраапенно по этой модифицированной связи.

Способ получения соединения (V) засоединения (II) в качест- ключается в конденсации двух олигонуклеоДля получения соеди ве исходного используется э ется полученный по тидов (Vl) и (Vil) под действием стандартной методике ике на автомате-синте- водорастворимого карбодиимида в присутэаторе олигонуклеотид отид АССТАССр. Этот ствии третьего олигонуклеотида (И), выпололигонуклеотид превра евращается в соответст- 20 няющего роль комплементарной матрицы. вующий 3-этиловый эфир (11) путем конден- Схема реакции; сации с этанолом в присутствии водорастворимого карбодиимида. Другой олигонуклеотид TGGTGGT, также полученный на автомате-синтезаторе, фосфорили- 25 руется по 5-концу с помощью аденоэинтрифосфата(АТФ) и фермента пол8000pacrn5IIpII Hbiu инуклеотидкинаэы. Образующийся фосфокарбодио.мид

АССТАСС -МН-СН -СОО выфЬления и очистки конденсируется с оли- 30 ,гонуклеотидом (Il) в присутствии комплв- АСС АССА ментарной матрицы (IV) и конденсирующего агента — водорастворимого карбодиимида.

Недостатком описанного способа пол- Для получения олигонуклеотида (Vl) учения является многос-.а о ог-.адийность а также 35 проводится конденсация исходного олигоналичие дорогостояще ящей стадии фермента- нуклеотида АССТАССр с этиловым эфиром

1 тивногофосфорилирования с помощью пол- глицина в присутствии 1-зтил-3,3-диметит ре бу ю щей ламинопропилкарбодиимида. После щелочспециальных обработок по удалению фер- ного омыления сложноэфирной связи мента и АТФ, а также стадии выделения 40 образующийся олигонуклеотид (Vl) конденфосфорилированного олигонуклеотида (III). сируется с олигонуклеотидом (Vll) e присутЦель изобретения — получение нового ствии комплементарной матрицы (IV) и олигонуклеотида общей формулы конденсирующего агента — водорэстворимого карбодиимида.

О О 45 Отличием предлагаемого способа от

lI И способа получения аналога (I) состоит в том, Р10- Р-NH- Сн - С-ОР g что в качестве исходного соединения вместо I

5-фосфорилированного олигонуклеотида ! (lll) используется его нефосфорилировангде R15АССТАССЗ 50 ный предшественник (Vll). Исключение этой

Rg=5 TGGTGGC3 . стадии фосфорилирования очень важно, так в качестве расщепляемого зонда и способ как, во-первых. эта стадия требует наличия его получения, отличающегося от аналога дорогостоящего фермента — 5-полинукбольшей легкостью получения и более высо- леотидкиназы и, во-вторых, исключается кой гидролитической устойчивостью. что 55 трудоемкий этап выделения 5 -фосфорлироделает этот е ает этот зонд более доступным и удоб- ванного олигонуклеотида на хроматографиным для практического использования. ческих носителях импортного

Поставленная цель достигается тем. что производства. в заданное аданное положение олигонуклеотида Совокупность указанных о1личительвместо прир о природной межнуклеотидной связи ных признаков fl03Roëÿåò сугцестр р íu уп2000300

55 зонда ростить процесс, сократить длительность приготовления зонда, снизить стоимость за счет использования недорогостоящих К0Мпонентов.

Пример 1. К водорастворимой соли олигонуклеотида 4(АССТАССр) (0,7 ое260, 0,01мкмоль), полученного по стандартной методике на автомате-синтезаторе, прибавляли 50 мкл 1 М водного раствора этилового эфира глицина и 5 мг 1-этил-3,3 -диметилаI минопропилкарбодиимида, Смесь выдерживали 3 ч и олигонуклеотид выделяли методом гель-фильтрации на биогеле Р2, используя воду в качестве элюента, Полученный после гель-фильтрации водный раствор упаривали и добавляли 0,1 н.водный раствор NaOH. После выдерживания смеси в течение 20 ч и нейтрализации ее 40ф,-ной уксусной кислотой делали повторную гель-фильтрацию нэ той же колонке. Водный раствор олигонуклеотида упари вали, добавляли эк в имоля рное (0,7 ое, 0,01 мкмоль) количество водорэстворимой соли олигонуклеотида (Vll) и эквимолярное (1,4 о,е., 0,01 мкмоль) количество олигонуклеотида (IV). Смесь олигонуклеотидов растворяли в 280 мкл 005 M морфолиноэтансульфонатного буфера с рН

6,0, содержащего 0,02 Mg C12 и 10 мг 1-этил3-(3 -диметилами«опропил)карбодиимида, I

Смесь инкубировали 48 ч при 0 С и затем целевой олигонуклеотид (V) выделяли методом электрофореза в 20-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину при flocTQAHHQM напряжении 1000 В. Выход олигонуклеотида (V) составил 607, относительно исходного олигонуклеотида (Vl).

Пример 2. К водорастворимой соли олигонуклеотида d(ACCTACCp) (0,025 о.е.260, 0,5 мкмоль). г1олуче«ного фосфотриэфирным методом по стандартной методике

2 добавляли 30 мкл 1 М водного раствора этилового эфира глицина и 5 мг 1-этил-3-(31 диметиламинопропил) карбодиимида.

Смесь выдерживали 3 ч при 10 С и олигонуклеотид выделяли методом гель-фильтрации на биогеле Р2. После омыления по вышеописанной методике олигонуклеотид

VI смешивали с эквимолярным количеством олигонуклеотида (VII) (0,025 о.е. 260, 0,05 нмоль) и олигонуклеотида (1 у) (0,05 о,е., 0.5 нмоль) в 10 мкл 0,05 M морфолиноэтансульфонатного буфера с рН 6,0, содержаще 0,02

М МдСI2 и 0,2 М 1-этил-3 (3-диметиламинопропил)кэрбодиимида. Смесь инкубировали 48 ч и целевой олигонуклеотид выделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле, как описано в примере 1.

Выход олигонуклеотида (V) относительно исходного (Vl) составил 48 .

Г1 р и м е р 3. При вь полне ии,;ь «теза в тех же угловиях, что и в пример 2, «и при времени инкубации 24 ч, выход ели о«уклеотидэ (V) составил 28 .

Способ испытания предлагаемого зонда. Основная характеристика расщепляемого зонда — его гидролитическая устойчивость, При нейтральных значениях рН в водном растворе олигонуклеотид (V) устойчив и может храниться при -20"С в течение нескольких месяцев.

При инкубации зонда в буферных растворах. традиционно использующихся в биохимических исследованиях и содержащих такие нуклеофильные компоненты как трис-, меркаптоэтанол, спермидин, N-метилимидэзол, расщепление зонда не обнаружено, в отличие от аналога (I).

На фиг.1 приведен радиавтограф 20 ного полиакриламидного геля иллюстрирую цего стабильность P ìå÷åííîãî зонда

32 (V) при инкубации его в различных буферных растворах.

Дорожка 1 — исходный олигонуклеотид (V). 2 — олигонуклеотид (V) после инкубации в 0,05 М трис-буфере (рН 9.0), содержащем

0,01 M NgCI2, 0,002 М спермин, 0,005 M меркаптоэтанол (37 С. Э суток), 3 — олигонуклеотид (V) после инкубэции в 0,4 M N-метилимидазольном буфере (рН 8,0). содержащем 0.2 М NaCI M 0,12 M МдС12 (37 С, 3 суток).

Для сравнения на том же геле нанесен олигонуклеотид-аналог (I) (дорожка 4) и продукты его расщепления в тех же условиях, что в подписи к дорожке 3 (дорожка 5).

На фиг,1 видно, что в условиях, когда аналог (I) целиком расщепляется, предлагаемый нами зонд (V) устойчив. Устойчивость зонда в условиях, приведенных выше, свиде;ельствует о том, что он может использоваться в различных исследованиях без побочных неконтролируемого расщепления в условиях, близких к физиологическим.

Направленное расщепление олигонуклеочидэ V. Основное отличительное свойство олигонуклеотида (V) заключается в том, что при создании определенных условий он может расщепляться направленно по модифицированной межнуклеотидной связи.

Тэк, при обработке зонда (V) водным раствором пиридина с триэтиламином или водным раствором конц. NH

16 ч происходит эффективное расщепление

На фиг.2 приведен радиоавтограф 20 ного полиакриламидного геля, где дорожка

1 — " Р-меченный исходный зонд (V), 2—

Р-меченный олигонуклеотид (VI); 3 — nlmдукт расщепления зонда (V) смесью пири2000300

Заштрша5онны

ЛЪ9/ 70 10ЖРНПЯ

Щ- меченни от:аануглеогпцда Яр дин триэтиламин — вода (3:2:5) в течение 16 ч при 20 С., 4 — продукты расщепления зонда концентрированным раствором водного аммиака (16 ч. 20 С), На том же геле на дорожке (6) нанесены продукты реакции зонда (V) с 0.5 М водным раствором этилендиамина (рН 8.0) (37 С, 6 ч), Дорожка (5) — контрольный олигонуклеотид структуры

О

d(ACCTACCp CHz-CONH-(CH2)2 - NHg)

"МН (ЧИ().

Подвижность продуктов реакции в геле свидетельствует о том, что зонд (V) расщепляется под действием этилвндиамина в мягких условиях в водной среде, и при этом остаток этилендиамина присоединяется по карбоксильной группе олигонуклеотида. Такой ход реакции подтверждается путем идентификации продукта расщепления зонда (V) этиленд>аамином со специально синтезированным соединением (Vill). Это важное свойство зонда (V) служит ацилирующим агентом, а не фосфорилирующим, так как это описано для аналога (1), также является характерным отличительным свойством. которое может найти полезное применение в дальнейшем. например для направленного ацилирования эминогрупп в белках и ферментах. образующих биоспецифмческие комплекгы с олигонуклеотидами.

Преимущество предлагаемого нового типа соединений заключается s большей легкости его получения по сравнению с аналогом, так как при синтезе исключается трудоемкая и дорогостоящая стадия

Нанера дорожек ферментативной реакции и выделения фосфорилировэнного олигонуклеотида.

Второе важное преимущество новых соединений заключается в том. что эти соеди5 нения, в отличие ранее описанных замещенных пирофосфатов, гидролитически устойчивы, что позволяет использовать их в качестве зондов в исследованиях по гибридизационной диагностике, генотера10 пии и аффинной модификации белков.

Еще одной принципиально новой особенностью их является то, что в реакциях с аминосоединениями они выступают в качестве ацилирующих, а не фосфорилирующих

15 агентов, как замещенные пирофосфаты. 3m свойство открывает новые перспективы их использования в молекулярной биологии и генной инженерии.

Формула изобретения

20 1. Олигонуклеотид общей формулы

О

II

BIO-V-Se-CH - C-PP, ! 2 ц 2

ОН, 0

25 где Rl=5 4(АССТАСС) 3;

Ra=5 d(TGGTGGTj 3, в качестве расщепляемого зонда.

2. Способ получения олигонуклеотида, отличающийся тем, что гептануклеотид

30 d(ACCTACCp) обрабатывают смесью этилового эфира глицина и 1-этил-3,3-диметила1 минопропилкарбодиимида в водной среде, выделяют, подщелачивэют, нейтрализуют, добавляют эквимолярное количество rema35 нуклеотида d(TGGTGGT) и тетрэдекануклеотида d(TGGATGGACCACCA) при рН 6 в присутствии 0,01 — 0,3 M 1-этил-3,3 -диметиламинопропилкарбодиимида. г елФ

2000300

Составитель М. Ивановская

Техред М.Моргентал Корректор О. Густи

Редактор Л. Павлова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5

Заказ 3064

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 1