Способ расщепления рибонуклеиновых кислот

 

Использование: для изучения функций РНК, создания противовирусных препаратов . Сущность изобретения: гидролиз РНК с помощью пептида - (Leu - Агд)з - Gly (R), ковалентно связанного с олигонуклеотидом, комплементарным участку РНК, прилежащему к сайту расщепления R -NH2 или -OAlk.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАР CTBE ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ .

O (21) 4827531/13 (22) 23.05.90 (46) 07.08,92. Бюл. N 29 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР (72) В.Ф.Зарытова, Е.M.Èâàíîâà, А,Г,Веньяминова и М.Н.Репкова (56) J. Amer. Chem, Soc., 1988, 110, р, 68806882.

Изобретение относится к биотехнологии и.биохимии нуклеиновых кислот и может быть использовано для получения фрагментов рибонуклеиновых кислот (PHK), создания противовирусных препаратов, для изучения функций РНК, для создания геннаправленных соединений и т.п.

Наиболее близким к предлагаемому является способ расщепления PH К с помощью основных пептидов путем инкубации PHK c расщепляющим агентом.

Существенным недостатком этого способа, как и всех известных неферментативных методов расщепления РНК, является недостаточно высокая специфичность (т.е. множественность разрывов цепи PHK).

Целью изобретения является повышение специфичности за счет обеспечения единичного разрыва PHК в заданном месте.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу расщепления рибонуклеиновых кислот путем инкубации рибонуклеиновой кислоты с основным пептидом в . качестве основного пептида используют пептид (Leu - Arg)a — Gly (R), ковалентно связанный с 5-концом олигонуклеотида или его

I производного, комплементарного участку

„„5U „, 1752773 А1 (я)ю С 12 Q 1/68, С 07 Н 21/04 (54) СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (57) Использование: для изучения функций

РНК, создания противовирусных препаратов. Сущность изобретения: гидролиз РНК с помощью пептида — (Leu - Агц)з — Gly (R), ковалентно связанного с олигонуклеотидом, комплементарным участку РНК, прилежащему к сайту расщепления R = -NH2 или

-0AIk. разщепляемой рибонуклеиновой кислоты, прилежащему к месту разрыва, прйчем R—

-КН2 или -OA!k.

Пример 1, B качестве PHK используют меченный радиоактивным фосфором гептацекарибонуклеотид (10-7 М) формулы

5 - (32Р) - р6А66АС6АААСААСААС-З, в качестЬе расщепляющего реагента берут пептид, ковалентно связанный с гептадезоксирибонуклеотидом, комйлементарным

5 -концу РН К (подчеркнуто):

3 — d CTCCTGCpxLeu - Аг9)з - Gly(R), где R — -ИН2, -OAlk, Реагент взят в концентрации 10 М, его инкубацию с РН К осуществляют в течение 2

1„ сут при комнатной температуре в 10 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НО, 100 мМ NaCI и 1 мМ ЭДТА, рН 7.9. Реакцию останавливают осаждением реакционной смеси 2%-ным перхлоратом лития в ацетоне. После отделения остаток растворяют в 5 мкл 10 М мочевины и 1мкл смеси ксиленцианола и бромфенола в формамиде (1: 10) и наносят на 20%-ный полиакриламидный гель. Проводят гель-электрофореэ (при

1000 — 1200 В, 2 ч) и экспонируют гель для получения радиоавтографа (для контроля

1752773

5 (2Pj-pGAUUGAAAAUCCCC-3;, в качестве расщепляющего реагента — производное формулы инкубируют в тех же условиях указанный выше гептадекарибонуклеотид без расщепляющего реагента), Электрофоретический анализ свидетельствует, что в реакционной смеси, помимо исходной РНК, присутствует 5 один укороченный радиоактивномеченый фрагмент:

-(32Ðj-pGAGGACGAAACA

Структура фрагмента установлена по методу Донис-Келлер с помощью расщепления 10 его специфическими ферментами, чувствительными к определенным типам гетероциклических оснований молекулы олигорибонуклеотида. Степень расщепления РНК, оцененная с помощью лазерного 15 сканирования рентгеновской пленки на

Ultroscan XL Laser Densitometer (LKB, Швеция), составляет в укаэанных условиях 30 .

Пример 2, В качестве PHK используют гептадекарибонуклеотид, указанный в 20 примере 1, в качестве реагента используют

К-(2-оксиэтил)феназиниевое (Phn) производное указанного в примере 1 основного пептида

0 . 25

h(o.ì CTL" ÃTG C p) (L- Ai ) - Cg(A)

1

Эксперимент ведут аналогично описан- 30 ному в примере 1, Получают единичный разрыв РН К с образованием того же укороченного фрагмента, Степень расщепления 70 (известно, что введение остатка

Phn в олигонуклеотид повышает прочность 35 образующихся дуплексов между нуклеиновой кислотой и олигонуклеотидом).

Пример 3. В качестве РНК используют тетрадекарибонуклеиновую кислоту формулы 40

Р,„d(o-р-0-CTA CTr)-tLeu 6 43а1(k) ( I

-,г 4, i- ь/н(си,)м к где олигонуклеотидная часть комплементарна 5 -концу РНК (подчеркнуто). Условия проведения эксперимента аналогичны вышеописанным, Получен единичный разрыв

РНК с образованием укороченного фрагмента формулы

5 (32 Pj- 6ДЦ ЦДдДДДЦ

Степень расщепления 55 .

В контрольных экспериментах при инкубации РН К в тех же условиях, что указаны в примере 1, но с использованием в качестве расщепляемого реагента только его пептидной части или ее смеси с олигодезоксирибонуклеотидом расщепление не наблюдается, Формула изобретения

Способ расщепления рибонуклеиновых кислот путем инкубации рибонуклеиновой кислоты с о новным пептидом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения специфичности эа счет обеспечения единичного разрыва РН К в заданном месте, в качестве основного пептида используют пептид (Leu - дгц)з - Gly. ковалентно связанный с

5 -концом олигонуклеотида или его производного, комплементарного участку расщепляемой рибонуклеиновой кислоты, прилежащему к месту разрыва, где R =-ИН2, или -0Alk.

Составитель A,Âåíüÿìèíîâà

Техред M.Mîðãåíòaë Корректор О.Юрковецкая

Редактор В,Петраш

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2734 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5