Способ получения полинуклеотид-сорбента

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии. Цель изобретения - повышение выхода по аффинату, увеличение длины полинуклеотидов с заданной последовательностью. Изобретение заключается в использовании в качестве матрицы гранулированной целлюлозы. При этом целлюлозу поперечно сшивают эпихлоргидрином. Затем частично модифицируют диметокситритилхлоридом. Избыточно ацилируют уксусным ангидридом. Синтез олигонуклеотид-сорбента ведут на ДНК-синтезаторе с последующим снятием защиты аминогрупп оснований и ацетильной защиты целлюлозы обработкой концентрированным водным аммиаком.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (lt(l SU (lll

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4377220/30-13 (22). 08.02.88 (46) 07 ° 07.90. Бюл..й 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов и Институт цитологии АН СССР (72) В.В.Константинов, Ю.П.Зеров и В.M.Áoæêîa (53) 575.2,244.2 (088.8) 56) Gene Assemblers Course Pharmacia. Ио1еси1аг Biology Division.

Uppsa1a Sweden, 1986.

Beaucage S.L., Caruthers N.Н.

Tetrahedron Sett 1981, v.22, И 20, р ° 1859-1862.

Gilham Р.Т. Methods Enzymol. 1971, 21D, а.191-197.

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано для получения полинуклеотидных сорбентов со строго определенной последовательностью нуклеиновых оснований.

Целью изобретения является повышение выхода по аффинату, увеличение длины полинуклеотидов с заданной последовательностью, а также улучшение гидродинамических характеристик сорбента.

В качестве твердофазного носителя используют гранулированную целлюлозу, которую поперечно зашивают путем обработки эпихлоргидрином в водной щелочи при нагревании в атмосфере инерщ) 5 С 07 H 21/04, С 08 В 15/06

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДСОРБЕНТА (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии. Цель изобретения - повышение выхода по аффинату, увеличение длины полинуклеотидов с заданной последовательностью. Изобретение заключается в использовании в качестве матрицы гранулированной целлюлозы. При этом целлюлозу поперечно сшивают эпихлоргидрином. Затем частично модифицируют диметокситритилхлоридом. Избыточно ацилируют уксусным ангидридом.

Синтез олигонуклеотид-сорбента ведут на ДНК-синтезаторе с последующим снятием защиты аминогрупп оснований и ацетильной защиты целлюлозы обработкой концентрированным водным аммиаком.

)ееиь тного газа. Целлюлозные гранулы высушивают азеотропной отгонкой воды с абсолютным пиридином в вакууме и суспендируют в абсолютном пиридине.

Полученную суспензию обрабатывают диметокситритилхлоридом в темноте при комнатной температуре и, после промывки абсолютным пиридином, избытком уксусного ангидрида в абсолютном пиридине. В результате такой обработки получают целлюлозную матрицу, у которой заданное число гидроксильных групп блокировано диметокситритильной защитой, а остальные гидроксильные группы этерифицированы осушат" ком уксусной кислоты. В таком виде целлюлозные гранулы помещают в реак157 536

1 5

55 ционный проточный патрон, который вводят в синтезатор ДНК и ведут синтез полинуклеотида, начиная со стандартной процедуры удаления диметокситритильных групп целлюлозы. Деблокированные гидроксильные группы целлюлозы далее конденсируют с N-защищенным 5 -0-диметокситритил-дезокI си нуклеозид-3 -0- (P- цианозтил-N, Nд изопропилам 1но)-фосфоамидитом, синтезируя фосфит-тризфирную связь между нуклеотидом и матрицей. Эта связь после стандартной процедуры окисления, предусмотренной фосфит-амидным методом, превращается в фосфотриэфирную и остается таковой во время синтеза всего полинуклеотида, проводимого по стандратной программе., Последующая обработка концентрированным водным аммиаком.при нагревании приводит к полному деблокированию полинуклеотида, деацетилированию целлюлозной матрицы и превращению фосфотриэфирной связи носитель - полинуклеотид в фосфодиэфирную связь, стабильную в

Этих условиях.

Пример 1. К суспензии 10 мл (2,8 г) целлюлоэных гранул в 100 мл

0,25 н. раствора NaOH, находящейся в круглодонной колбе, добавляют 2,1 r эпихлоргидрина. Колбу помещают на роторный испаритель, откачивают воздух и заполняют внутреннее пространство инертным газом (И, Ar). Под колбу помещают водяную баню с температурой

60 С и перемешивают. реакционную смесь в течение 2 ч. Целлюлозные гранулы .промывают дистиллированной водой и суспендируют в 1 н. растворе NaOH в атмосфере инертного газа в круглодонной колбе помещенной на роторный ис-! а паритель, при температуре бани 100 С в течение.1 ч. После охлаждения до комнатной температуры целлюлозные гранулы промывают на фильтре дистиллированной водой, 0 1 í. НС1 и снова водой до нейтрального рН, высушивают азеотропной отгонкой воды с абсолютным пиридином в вакууме„ суспендируют в 10 мл абсолютного пиридина и добавляют 55 мг диметокситритилхлорида.

Жидкую фазу выпаривают в вакууме до исчезновения супернатанта и реакционную смесь выдерживают в течение Ь ч при комнатной температуре в темноте.

К реакционной смеси добавляют 10 r уксусного ангидрида и 40 г абсолютного пиридина и оставляют при перемешивании при комнатной температуре на 6 ч. Целлюлоэные гранулы промывают на фильтре абсолютным пиридином и хлористым метиленом. 70 мкл набухших в хлористом метилене целлюлоэных гранул помещают в реакционный проточный патрон синтезатора ДНК Gene Assembler фирмы нфармация" и проводят синтез полинуклеотида по стандартной программе.

Синтезированная таким образом с выходом 721 олиго (d Т) < -целлюлоза связывает в (0,5 М КСl +,5 м M трисНС1 -буфере 160-230 о.е. поли(Д)-РНК на 1 r сухого сорбента.

Пример 2. По методу, описанному в примере 1, с увеличением длительности синтеза на приборе был синтезирован 56-мерный полинуклеотид последовательности 5 -ААРАДДААСТССТТССССТСССДДРТДТДТДТТТСССДССССДРССДСТТТТТТТТ-3 с выходом 301.

Способ характеризуется большой технологичностью за счет сокращения трех стадий (удаление с матрицы и деблокирование, очистка, иммобилиэация на носителе). Причем иммобилиэация полинуклеотида за один (3 -) коI нец обеспечивает, максимальную доступность аффината с точки зрения комплементарных взаимодействий, Кроме того, способ обеспечивает высокий выход по аффинату, большую длину синтезируемых полинуклеотидов, синтез полинуклеотидов с любой заданной последовательностью, лучшие гидродинамические характеристики сорбента, возможность автоматизации процесса, формула изобретения

Способ получения полинуклеотидсорбента, включающий синтез полинуклеотида, концевую иммобилизацию на целлюлозной матрице посредством фосфодиэфирной связи и обработку концен трированным водным аммиаком, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода по аффинату, увеличения длины полинуклеотидов с заданной последовательностью и улучшения гидродинамических характеристик сорбента, в качестве матрицы используют гранулированную целлюлозу, при этом целлюлозу предварительно модифицируют в атмосфере инертного газа сначала эпихлоргидрином в растворе NaOH npu

60 С в течение 2 ч при молярном соото ношении D-глюкозного звена целлюлозы

Составитель Д. Папковский

Редактор В.Петраш Техред Л.Сердюкова Корректор И.Муска

Подписное

Заказ 1829

Тираж 301

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, И-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент, г.Ужгород, ул.Гагарина, 101

5 1 к эпихлоргидрину и NaOH 1:1,3:1,4, затем избытком 1 н. NaOH при 100 С в течение 1 ч, далее модифицированную целлюлозу обрабатывают в среде абсолютного пиридина последовательно диметокситритилхлоридом при молярном

576536

6 соотношении D-глюкозного звена целлюлозы к диметокситритилхлориду 106:1) и избытком уксусного ангидрида, а

5 синтез и иммобилизацию полинуклеотида осуществляют фосфит-амидным твердофазным методом.