Противоопухолевое средство

 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и заключается в применении гексапептида формулы Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp в качестве противоопухолевого средства. Указанный гексапептид обладает выраженным цитостатическим эффектом, вызывая торможение роста опухолей разной природы (лимфолейкоз Р-388, меланома В-16). Этот гексапептид способен восстанавливать угнетенные действием опухоли функции Т-лимфоцитов, играющих центральную роль в противоопухолевой защите. Гексапептид нетоксичен и может быть использован для лечения широкого спектра онкологических заболеваний. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и заключается в применении гексапептида формулы Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp в качестве противоопухолевого средства.

Известно использование в онкологической практике полипептидов (цитокинов), таких как интерферон, колониестимулирующие факторы, интерлейкин-2. Они имеют молекулярную массу 15 70 кДа, их получают биологическим, генно-инженерным способом. Введение в организм больного этих сравнительно крупных веществ в лечебных дозах вызывает, как правило, тяжелые побочные эффекты. Гораздо предпочтительней использовать в качестве лечебных средств низкомолекулярные пептидные соединения, особенно эндогенной природы. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и производят, как правило, регуляторное, корригирующее влияние, не оказывая вредных для организма воздействий.

Гексапептид формулы I был обнаружен в супернатанте культуры клеток костного мозга свиньи. Известно, что в смеси с гексапептидом формулы II Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr он производит модулирующее влияние на болевую чувствительность: при низком исходном пороге болевой чувствительности пептиды его повышают, при повышенном пороге болевой чувствительности его понижают. Синтез этих эндогенных пептидов позволил получить их в раздельном состоянии. Другие биологические свойства их не изучены.

Цель изобретения применить пептид Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp в онкологии.

Поставленная цель достигается тем, что гексапептид формулы I Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp отменяет ингибирующий эффект опухолевых клеток на функциональную активность Т-лимфоцитов и тормозит рост ряда мышиных перевиваемых опухолей (лимфолейкоза Р-388, меланомы В-16).

Гексапептид получают твердофазным методом, наращивая пептидную цепь по N-концу. Присоединение защищенных по аминогруппе Fmoc-аминокислот проводят карбодиимидным методом.

Пример 1. Гексапептид формулы I восстанавливает активность Т-лимфоцитов, подавленную опухолевыми клетками человека.

Известно, что опухолевые клетки больных ОМЛ, а также клетки линии HL-60, ведущей происхождение от лейкозных клеток костного мозга этих больных, продуцируют белки, сопрессирующие функции Т-лимфоцитов, что выражается в резком снижении их способности отвечать пролиферацией на воздействие митогена (фитогемагглютинина, ФГА).

Свежевыделенные Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров в концентрации 1·10⁶ клеток/мл стимулировали к пролиферации ФГА (3 мкг/мл). В конце 3 суток инкубации Т-лимфоцитов с митогеном в инкубационную смесь вводили Н-тимидин (2 мкКи/мМоль), по включению которого в ДНК Т-лимфоцитов судили об их пролиферативной активности, и выдерживали 4 часа. Если в данную инкубационную смесь в начале инкубирования добавить 10% кондиционной среды (КС) от лейкозных клеток HL-60, то уровень пролиферации Т-лимфоцитов в ответ на ФГА снижается в среднем на 50% по сравнению с контролем (100% инкубация без КС HL-60) (таблица 1).

Установлено, что гексапептид формулы I в отличие от близкородственного по физико-химическим свойствам гексапептида формулы II восстанавливает редуцированный лейкозными клетками ФГА ответ Т-лимфоцитов до нормального уровня. Способность гексапептида формулы II восстанавливать подавленный пролиферативный ответ Т-лимфоцитов обнаруживает четкую дозовую зависимость. Гексапептид формулы II, близкородственный по физико-химическим свойствам гексапептиду формулы I, но имеющий другую аминокислотную последовательность, не только не восстанавливает редуцированный ФГА ответ Т-лимфоцитов, но даже усиливает токсический эффект лейкозных клеток HL-60 (таблица 1).

Таким образом из двух гексапептидов эндогенной природы, описанных ранее как влияющие на болевую чувствительность (3), один (гексапептид формулы I) обладает еще противоопухолевой активностью.

Пример 2. Введение гексапептида формулы I мышам тормозит рост привитой им опухоли лимфолейкоза Р-388.

В экспериментах использовали гибридных мышей-самок BDF-1. Лимфолейкоз Р-388 прививали подкожно по общепринятой методике взвесью лейкозных клеток в питательной среде 199 в количестве 1 млн. клеток на мышь. Гексапептид вводили внутрибрюшинно через 48 часов после перевивки опухоли однократно, двукратно и пятикратно с интервалами 96 и 24 часа соответственно. Использовали диапазон разовых доз от 0,5 до 4,0 мг/кг.

Об эффективности гексапептида судили по торможению роста опухоли (ТРО,), которое рассчитывали как разницу в средних объемах опухолей в контрольной и подопытных группах, выраженную в процентах. В таблице 2 представлены средние данные из двух серий опытов. Количество мышей в контрольных группах без лечения равно 29. Количество мышей в каждой подопытной группе равно 8. Токсичность гексапептида оценивали по числу павших мышей в подопытных группах до начала гибели животных в контрольных группах.

Представленные данные показывают, что гексапептид формулы I обладает значимым и достоверным противоопухолевым действием на мышах в отношении подкожного лимфолейкоза Р-388.

Данный гексапептид нетоксичен в использованных дозах.

Пример 3. Введение гексапептида формулы I мышам тормозит рост привитой им солидной опухоли меланомы В-16.

В экспериментах использовали линейных мышей C 57 BL/6. Меланому В-16 прививали по 50 мг измельченной опухолевой ткани на мышь в питательной среде 199. Гексапептид вводили 1- или 2- кратно с интервалом 96 часов. Лечение начинали через 72 часа после прививки опухоли. Дозы гексапептида, а также способ оценки его эффективности были такими же, как и в примере 2. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 следует, что противоопухолевый эффект гексапептида формулы I достоверно проявился и на этой солидной опухоли. Он был наиболее выражен на 7-й день после окончания курса лечения.

Как и в примере 2, пептид нетоксичен при использованных дозах введения.

Пример 4. Синтез гексапептида формулы I Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp.

Синтез пептида проводили на автоматическом синтезаторе пептидов Biosearch 9600 (США) на РАС-смоле, используя Fmoc/DIPCDI метод по стандартной программе c: FDI, прилагаемой к прибору. Конденсацию Fmoc-аминокислот проводили карбодиимидным методом, для подавления рацемизации добавляли эквимолярные количества 1-оксибензтриазола. Остаток тирозина вводили в виде его о-трет-бутилового эфира. Стартовую аминокислоту триптофан присоединяли к 5 г РАС-полимера в количестве 0,76 ммоль аминокислоты на 1 г полимера. Далее Trp-полимер обрабатывали 0,4 М растворами соответствующих защищенных аминокислот, содержащими примерно 7-кратный избыток соответствующей аминокислоты и диизопропилкарбодиимида. Отщепление Fmoc-группы после конденсации проводили смесью пиперидин-толуол-диметилформамид (30:35:35). После окончания синтеза пептид отщепляли от смолы трифторуксусной кислотой, содержащей 2,5% этандиола и 2,5% воды при охлаждении льдом в течение 1,5 часов. Полученный пептид выделяли и очищали высокоэффективной хроматографией на колонке Диасорб-130 С-16 Т, 10 мкм, размером 26х250 мм в градиенте ацетонитрила в 0,05 М фосфатном буфере рН 3,0 и обессоливали на той же колонке. После лиофилизации получали 2 г белого аморфного порошка, гомогенного по данным ВЭЖХ. Аналитическую хроматографию проводили на колонке Ультрасфера ODS-3 в градиенте ацетонитрила (20 80%) в 0,05 М фосфатном буфере рН 3,0, детекцию осуществляли при 220 нм. Аминокислотный анализ кислого гидролизата (6н HCl, 20 часов) показал наличие следующих аминокислот: Leu 1 (0,95), Val 2 (1,87), Tyr 1 (1,03), Pro 1 (0,96).

Далее 1 мг полученного пептида растворяли в 0,5 мл 98%-ной муравьиной кислоты, добавляли 0,25 мл уксусного ангидрида и выдерживали 30 мин при 18^oС. Далее упаривали при комнатной температуре и очищали высокоэффективной хроматографией на колонке Ультрасфера С-18 ODS (4,6х250 мм) в градиенте ацетонитрила в 0,1% -ной трифторуксусной кислоте. Получали 0,5 мг пептида.

Формула изобретения

Применение гексапептида формулы Ley-Val-Val-Tyr-Pro-Trp в качестве противоопухолевого средства.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2