Способ количественного определения церукала

 

Сущность изобретения: определение церукала проводят путем обработки пробы спиртовым раствором п-диметилкоричного альдегида (п - ДМАКА) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСNа) в среде цитратного буферного раствора при pH 1,2 - 4,0 с последующим фотометрированием полученного раствора при λ= 540 нм. 13 табл.

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам количественного определения церукала. Этот препарат имеет широкий спектр фармакологического действия. Его центральные эффекты связаны с тем, что он блокирует дофаминовые рецепторы, что лежит в основе нейрохирургического механизма его противорвотного действия, угнетающего пусковую зону ствола мозга. Из литературы известны данные об эффективности церукала при лечении диспепсии (многократной рвоты, тошноты) у тяжелых кардиологических больных (инфаркт миокарда, сердечная недостаточность), при рвоте беременных, при язве желудка и двенадцатиперстной кишки.

Церукал обычно хорошо переносится больными, однако возможны побочные явления: появление усталости, сонливости, шума в ушах, сухости во рту, нарушение концентрации внимания, явления паркинсонизма.

Для выработки рациональной схемы лечения необходимое установление эффективной дозы церукала индивидуально для каждого больного и оптимизация режима его введения.

В связи со сказанным актуальными являются разработки способа количественного определения церукала в биологических жидкостях.

Известные в литературе способы количественного определения церукала представлены в табл. 1. За рубежом широко используют способ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) как нормально-фазовой, так и с обращенными фазами.

Положительными сторонами метода ВЭЖХ для определения церукала являются низкий предел обнаружения, возможность определения церукала в биологических объектах (сыворотке и плазме крови).

Однако этот способ имеет ряд недостатков: длительность пробоподготовки, использование веществ 1 класса опасности (метанол и др.), что требует повышенного внимания к технике безопасности, не обеспеченность клинических и биохимических лабораторий дорогостоящим импортным оборудованием.

К второй группе определения церукала относятся спектрофотометрические способы. Авторы предлагают экстракцию церукала хлороформом с последующим спектрофотометрированием в УФ области спектра.

Анализ литературы свидетельствует о том, что предложенные способы имеют ряд недостатков: высокие значения предела обнаружения 5 мкг/мг, что не отвечает современным требованиям химико-аналитического контроля, отсутствие сведений о селективности определения, длительность определения связанная с экстракцией, использование дорогостоящих экстрагентов (хлороформа, этилацетата), использование дополнительных устройств в связи с применением инертных газов, отсутствие сведений о возможности определения церукала в биологических жидкостях.

Наиболее близким (прототип) является способ, основанный на использовании в качестве органического реагента о-а аминофенола. Определение проводят в среде глицинового буфера pH 1,5 1,7, предел обнаружения церукала 10 мкг/мг.

Недостатками данного способа прототипа являются: невозможность определения долей мкг церукала, узкий интервал pH, в котором возможно определение церукала, отсутствие сведений о селективности реакции, в частности нет данных о влиянии лекарственных препаратов, используемых с лечебной целью совместно с церукалом,
отсутствие сведений о возможности определения церукала в биологических объекта.

Базовым способом определения церукала является спектрофотометрический, требующий использования хлороформа.

Цель изобретения понижение предела обнаружения церукала, повышение селективности определения в присутствии других лекарственных средств, разработка фотометрического метода определения церукала в биологических жидкостях (крови, слюне).

Поставленная цель достигается тем, что определение церукала проводят путем обработки пробы спиртовым раствором п-диметиламинокоричного альдегида (п-ДМАКА) в присутствии додецилсульфата натрия (ДCNa) в среде цитратного буфера при pH 1,2 4,0 с последующим фотометрированием полученного раствора при λ=540 нм.

Эксперимент показал, что растворы, содержащие церукал и органический реагент, окрашены в желтый цвет. Спектры поглощения двойных систем в среде цитратных буферных растворов с pH 1,2 5,0, представлены двумя полосами поглощения. λ¹_max= 275-λ²_max= 400 (табл. 2). Введение третьего компонента ДCNa приводит к возникновению ярко-малиновой окраски раствора систем.

Спектры поглощения 3 систем "церукал-п-ДМАКА-ДСNa" представлены при всех значениях pH тремя полосами поглощения λ¹_max= 275нм, λ²_max= 400нм, λ³_max= 560нм, Δλ составляет 160 нм (табл. 2). Нами установлены оптимальные условия определения церукала.

Изучение зависимости светопоглощения систем церукал-н-ДМАКА-ДСNa от pH среды 1,2 6,0 показало, что оптимальной средой проведения реакции являются цитратные буферные растворы pH 1,2 4,0.

Исследовано влияние СДМАКА на правильность получения результатов церукала (табл. 3).

Как следует из результатов, представленных в табл. 3, наименьшие ошибки определения наблюдаются в интервале концентрации 0,1 1,0 мл 0,2% ного раствора п-ДМАКА (4,56·10^-5≅C ДМАКА ≅4,56·10^-4М) при выходе за указанный интервал концентраций с обеих сторон наблюдается увеличение ошибок определения до 15 16% Мы работали далее с СДМАКА=4,56·10^-5 М.

Установлена оптимальная концентрация ДСNa в реакционной системе. Определение содержания церукала (табл. 4).

Анализ результатов, представленных в табл. 4 показал, что наименьшие ошибки определения наблюдаются в интервале концентрация ДСNa 4·10^-3≅C_ДСNа ≅4·10^-2 М.

Таким образом, оптимальными условиями определения церукала являются pH 1,2 4,0 (мы использовали pH 2,0); С_ДМАКА=4,56·10^-5М (0,1 мл 0,2%-ного р-ра) и С_ДСNa=4·10^-3М (1 мл·10^-1 М) (V_общ.=25 мл).

Изучена подчинимость системы церукал п-ДМАКА-ДСNa закону Бугера-Ламберга-Бера. Установлено, что по заявляемому способу определения церукала можно находить "большие" и "малые" концентрации препарата. Установлено два диапазона определяемых концентраций церукала.

I "большие" количества 25 300 мкг/25 мл или 1,0 12 мкг/мл l=1 см
II "малые" количества 3,00 40,0 мкг/25 мл 0,12 1,6 мкг/мл l=5 см.

Доказательство существования диапазона определяемых содержаний церукала приведено в табл. 5.

Анализ данных, представленных в таблице 5, показал, что ошибки определения церукала соответствуют фотометрическому методу и не превышают 10% в интервалах 25 300 мкг/25 мл (l=1 см) и 3,00 40,0 мкг/25 мл (l=5 см).

Под пределом обнаружения мы понимаем наименьшее содержание церукала, которое можно обнаружить по данной методике, т. е. нижняя граница определения 3,00 мкг/25 мл или 0,12 мкг/мл (l=5 см).

В литературе указано, что нижняя граница определяемых содержаний по методу прототипу 10 мкг/мл, следовательно, по новому способу нам удалось снизить предел обнаружения в 83 раза, т. е. на 2 порядка. Это является существенным преимуществом новой методики.

Изучена зависимость предела обнаружения церукала от pH среды, концентрации п-ДМАКА и концентрации ДСNa. Полученные экспериментальные данные приведены в таблицах соответственно 6 8.

Анализ данных, представленных в таблицах 6 8 показал, что ошибки определения предела обнаружения церукала минимальны при 4,56·10^-5≅С_ДМАКА≅4,56·10^-4М и 4·10^-3>≅С_ДСNa≅4·10^-3 М в интервале 1,2 ≅pH≅4,0.

В таблице 9 приведены результаты исследования селективности реакции. Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Построение градуировочной характеристики для количественного фотометрического определения больших количеств церукала.

Стандартный раствор церукала готовили из ампулы, содержащей 10 мг препарата в 2 мл раствора. Содержимое ампулы количественно переносили в колбу на 100 мл и доводили до метки дистиллированной водой С_от.=100 мкг/мл.

Для построения градуировочной характеристики в 7 мерных колб емкостью 25 мл отмеряли (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мл) стандартного раствора церукала с концентрацией 100 мкг/мл. Добавляли в каждую колбу по 0,1 мл 0,2%-ного раствора ДМАКА, по 1 мл 0,1 М раствора ДСNa и доводили объем до метки цитратным буферным раствором с pH 2,0. Оптическую плотность указанных растворов измеряли на КФК-2-УХА-4,2 в кювете с толщиной поглощаемого слоя l=1,0 см при l= 540 нм относительно "холостого раствора", в состав которого входят цитратный буферный раствор pH 2,0, ДМАКА и ДСNa. По полученным значениям оптической плотности строили зависимость А=f(c).

Закон Б Л Б выполняется при концентрации церукала в интервале 25 - 300 мкг/25 мл, при l=1 см.

Пример 2. Построение градуировочной характеристики для количественного фотометрического определения малых содержаний церукала.

Рабочий раствор церукала с С=10 мкг/мл готовым разбавлением стандартного (С_ст. 100 мкг/мл).

Для построения градуировочной характеристики церукала в колбы вносили по 7 10 мл цитратного буферного раствора с pH 2,0, вносили 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 1,5, 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 мл; раствора церукала с С=10 мкг/мл. Добавляли п-ДМКА, ДСNa как указано в примере 1, доводим объем до V=25 мл, измеряли оптическую плотность при l=5 см, относительно "холостого" раствора. Эксперимент показал, что градуировочная характеристика прямолинейна в интервале 0,12 1,6 мкг/мл (3,00 40,00 мкг/мл 25).

Пример 3. Определение содержания церукала в таблетках "Cerucal" (Германия).

Анализируемые таблетки лекарственных форм тщательно растирали в фарфоровой ступке. Точные навески 10 мг (0,1000 г) количественно переносили в мерные колбы V=100 мл и растворяли в дистиллированной H₂О. Аликвоты полученных растворов (1 мл) вносили в колбы на 25 мл, добавляли цитратный буферный раствор pH 2,0; ДМАКА и ДСNa как указано в примере 1. Проводили измерение оптических плотностей в кюветах с толщиной поглощающего слоя l=1 см относительно "холостого" раствора. Полученные результаты приведены в таблице 10.

Анализ данных, приведенных в таблице, позволяет заключить, что заявляемый способ отличается хорошей воспроизводимостью и правильностью.

Пример 4. Определение содержания церукала в донорской крови. При пробоподготовке крови к анализу белки осаждали трихлоруксусной кислотой.

В пробирки вносили по 2 мл крови донора, добавляли 30 мкг церукала, тщательно перемешивали. После фиксированного времени контакта осаждали белки 2 мл 30% трихлоруксусной кислоты. Смесь перемешивали стеклянной палочкой и центрифугировали 5 мин при скорости 3000 об/мин. Фильтрат сливали в мерные колбы на 25 мл, добавляли 8 10 мл буферного раствора pH 4,0, 0,1 мл 2% раствора п-ДМАКА, 1 мл 10^-1М раствора ДСNа и доводили до метки буферным раствором. Полученные смеси фотометрируют аналогично примеру 1. Содержание церукала определяют по градуировочной характеристике. Результаты определения церукала в донорской крови приведены в таблице 11.

Анализ данных, представленных в таблице 11, свидетельствует о правильности и воспроизводимости новой методики.

Пример 5. Определение содержания церукала в слюне.

При подготовке слюны к анализу белки, входящие в состав слюны, осаждают 96% спиртом ректификатором.

В мерные пробирки собирали слюну испытуемого, вводили 100 мкг церукала, центрифугировали в течение 15 мин при скорости 4000 об/мин для осаждения твердых остатков слюны. Затем переносили осторожно фильтрат в другую мерную пробирку, добавляли 2 мл осадителя и центрифугировали еще 5 7 мин. Фильтрат переносили количественно в мерные колбы на 25 мл и добавляли к каждому фильтрату по 10 12 мл буферного раствора pH 4,0 по 0,1 мл 0,2% раствора п-ДМАКА. Смеси доводили до метки буферным раствором и фотометрировали как указано в примере 1. Результаты определения церукала в слюне приведены в таблице 12.

Как следует из представленных данных ошибка определения не превышает 10% Определение церукала в слюне является очень перспективным, так как позволяет легко произвести забор анализируемой жидкости, особенно по сравнению с кровью.

Доказательство наличия существенных отличий.

Существенными отличиями разработанного метода определения церукала являются:
использование в качестве органического реагента - п-диметиламинокоричного альдегида,
введение третьего компонента додецилсульфата натрия,
проведение определения в среде цитратных растворов в интервале pH 1,2 - 4,0.

Разработанный авторами способ имеет ряд существенных преимуществ: во-первых, удалось значительно снизить предел обнаружения на два порядка по сравнению с способом прототипом,
во-вторых, расширить селективность реакции, новый способ позволяет определять церукал в присутствии антибиотиков широкого спектра действия, противотуберкулезных препаратов, гипотензивных и ноотропных препаратов, а также некоторых сердечных гликозидов,
в третьих, расширить диапазон определяемых содержаний церукала, по сравнению с известными методами. Впервые удается определять малые концентрации препарата (0,12 16,0 мкг/мл препарата),
в четвертых, впервые показана возможность определения церукала в крови и слюне спектрофотометрическим методом, что чрезвычайно важно для поиска наилучшего терапевтического эффекта с учетом индивидуальной особенности - чувствительности больного и своевременного поддержания лечебной концентрации препарата в организме.

Разработанный авторами способ реализуем на серийной отечественной аппаратуре, которой снабжены аналитические, биохимические и клинические лаборатории страны. Метод быстр, прост, хорошо воспроизводим.

Сравнение аналитических характеристик предлагаемого способа с прототипом дано в табл. 13.

Анализ данных, приведенных в табл. 9, показал, что все 29 препаратов, которые могут быть назначены больному совместно с церукалом, не оказывают мешающего действия на аналитическое определение его предлагаемым способом.

Формула изобретения

Способ количественного определения церукала путем обработки анализируемой пробы раствором органического реагента в кислой среде с полследующим фотометрированием полученного раствора, отличающийся тем, что кислую среду создают путем добавления цитратного буферного раствора до pH 1,2 4,0, затем добавляют последовательно п-диметиламинокоричный альдегид до концентрации 4,56·10^-5 4,56·10^-4 М и додецилсульфат натрия до концентрации 4·10^-3
4·10^-2 М и фотометрируют при 540 нм.