Способ получения вакцины против эшерихиоза телят

 

Использование: ветеринарная микробиология, вакцина против эшерихиоза телят. Сущность изобретения: для получения анатоксина используют только токсичные штаммы Escherichia coli, отделяют токсин после культивирования в течение 5 - 7 дней на среде Хоттингера от микробной массы фильтрацией через стерилизующие пластины, инактивируют токсин в фильтрате формалином добавлением последнего до 0,3 - 0,4% с выдерживанием при 37^oC в течение 10 - 12 дней. Полученный анатоксин осаждают 10%-м раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем. Комплексный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигеном, полученным из штаммов Escherichia coli после выращивания суточных бульонных культур при 37^oC в течение 2 суток и смыва микробной массы физраствором, содержащим 0,3 - 0,4% формалина с доведением до концентрации 50 - 60 млрд. микробных тел в 1 мл и добавлением к смыву перекиси водорода до содержания ее до 0,15 - 0,25%, причем смесь анатоксина и антигена разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. микробных тел. Способ позволяет получить вакцину с высоким уровнем напряженности антитоксического и антимикробного иммунитета.

Предполагаемое изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к производству вакцины против эшерихиоза телят.

Известен способ получения конъюгированного энтеротоксина Escherichia coli при 18 24 часов культивировании в бульонной культуре с последующим центрифугированием и удалением бактериальной массы, осаждением токсинов из надосадочной жидкости сульфатом аммония, обработкой этанол-эфиром (1:1) и повторным центрифугированием и использованием осадка для получения конъюгата при действии глютаровым альдегидом и последующего диализа против фосфатно-солевого буфера (а.с. СССР N 1750690, A61К 39/108, 1992).

Конъюгат проверялся на безвредность и активность на белых мышах и сорбировался гидроокисью алюминия. Конъюгированный препарат анатоксина использовался для получения антитоксической сыворотки при гипериммунизации быков. Лечебно профилактические свойства гипериммунной антитоксической противоколибактериозной сыворотки проверены на 235 новорожденных телятах, из которых выздоровело 230, пало 5.

Сыворотка, полученная с использованием конъюгированного энтеротоксина E. coli, является средством достижения напряженного антитоксического иммунитета при профилактике и эффективным антитоксическим средством при лечении заболевания. Антимикробного действия она не оказывает. Высокая терапевтическая эффективность сыворотки отмечена в сочетании с лекарственными препаратами - антибиотиками.

Кроме того, осаждение анатоксина сульфатом аммония не может найти широкого применения в производстве из-за громоздкости процесса, малого выхода продуктов и необходимости удаления остатков соли (Е.А.Ильницкая, А.Н.Лобанова Дифтерийный анатоксин, в книге Руководство по вакцинному и сывороточному делу, Москва, "Медицина", стр.144).

Известен способ получения антигенных препаратов из культур бактерий кишечной группы, по которому выращивают в реакторах культуры вакцинных штаммов возбудителей в течение 10 16 часов с густотой 40 80 млр./мл, затем взвесь охлаждают до 20^oC и процесс экстракции антигенов и инактивации ведут при последовательном воздействии перекисью водорода и формалином в сублетальных концентрациях, причем H₂O₂ пергидроль вводят во взвесь культур при перемешивании до конечной концентрации в 0,15 0,25% Инкубируют 8 12 часов при 20^oC и затем вводят формалин (а.с. СССР N 460749, A61K 39/00, 1975). Полученные антигенные препараты могут обладать способностью вырабатывать в организме антимикробный и антитоксический иммунитет к эндотоксинам возбудителей кишечных инфекций. Антитоксический же иммунитет к экзотоксинам возбудителей кишечных инфекций они создавать не могут.

Известен способ получения формолтиомерсаловой вакцины против эшерихиоза телят основанный на отборе энтеропатогенных штаммов E.coli 08: K43; 09,015: K-14; 020, 026:K60; 041, 055, 078:K-80; 086:K-61:H32; 0115, 0117:K-62; 0119, 0141 и 0149 обладающих в опыте на белых мышах иммуногенными свойствами при ИД₅₀ не превышающей 1,0 х 10⁸ микробных клеток с последующим культивированием культур названных штаммов в бульоне Хоттингера для получения матровых культур и засевом их в реактор с такой же средой и культивирования глубинным методом с последующим доведением до концентрации 4 млрд. микробных клеток и инактивацией формалином и тиомерсалом (Б.Ю.Шустер, Ю.А.Малахов, В.С.Соловьев, О. А.Тугаринов Ветеринарные препараты, справочник, Москва "Колос", стр. 219 224).

Эта вакцина широко применяется в практике для специфической профилактики эшехириоза телят путем вакцинации стельных коров и получения сыворотки при гипериммунизации волов.

Способ получения формолтиомерсаловой вакцины обеспечивает и антитоксическую, и антимикробную иммуногенность препарата, но невысокую, так как анатоксины содержатся в ней в недостаточном количестве (не в концентрированном виде), недостаточно в ней и количество протективных К и O антигенов. Однако поиски новых более эффективных вакцин против колибактериоза телят до последнего времени продолжаются.

В основу предлагаемого изобретения положена задача создания способа получения вакцины против эшерихиоза телят с высокой концентрацией экзо- и эндоксинов и высоким содержанием протективных K и O антигенов легко реализуемого в производстве.

Заявляемый способ получения вакцины против эшерихоза телят включает подбор штаммов E.coli, обладающих адгезивными и токсигенными свойствами, культивирование их в течение 5 7 дней на среде Хоттингера и последующее отделение микробной массы на фильтрах со стерилизующими пластинами. Далее токсин в фильтрате инактивируется формалином добавлением последнего до 0,3 - 0,4% с выдерживанием при 37^oC в течение 10 12 дней, затем полученный анатоксин осаждают 10% алюмокалиевыми квасцами, добавленными в количестве 1% на весь объем.

После отстаивания в течение 2 3 дней надосадочную жидкость удаляют, а полученный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигенами, полученными из штаммов E.coli при посеве суточных бульонных культур на митраксы с МПА, выращивания при 37^oC в течение 2-х суток и смыва микробной массы физраствором, содержащим 0,3 0,4% формалина, концентрации 50 60 млрд. микробных тел в 1 мл и добавлением к смыву перекиси водорода до содержания ее 0,15 0,25% Полученную смесь разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд.м.т.

От прототипа заявляемый способ отличается тем, что для получения анатоксинов используют только токсигенные штаммы E.coli, отделяют токсин от микробной массы фильтрацией через стерилизующие пластины осаждение анатоксина ведут алюмокалиевыми квасцами, а протективные K и O антигены извлекают из микробных тел при воздействии на последние, находящегося в физрастворе формалина и перекиси водорода.

Отдельно взятые отличительные операции заявляемого способа известны, но в представленном способе совокупности они не известны. Сам способ обладает свойствами, не являющимися простой суммой свойств отличительных операций: заявленный способ позволяет получить вакцину с высоким уровнем напряженности антитоксического и антимикробного иммунитета, поскольку способ учитывает структуру, функцию и патогенетическое действие энтеропатогенных E.coli на организм животных.

Другие известные авторам способы получения средств борьбы с эшерихиозом телят таким свойством не обладают.

Приводим пример осуществления способа.

Для изготовления вакцины отбираются 6 8 штаммов обладающих вирулентными, токсигенными, иммуногенными и адгезивными свойствами определяемыми согласно существующих методов исследований и с учетом наличия изолятов эшерихий, выделяемых от телят из хозяйств определенных регионов.

Отобранные штаммы E.coli засеваются в колбочки на 100 мл со средой Хоттингера и после получения матровых культур каждый штамм засевается в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (pН 7,8) выращивается 5 7 дней в термостате при 37^oC, затем культуры каждого штамма фильтруются через бактериальный фильтр Сальникова (пластины СФ) в общую бутыль. Затем к фильтрату добавляется формалин до 0,3 0,4% и выдерживается в термостате при 37^oC 10 12 дней. Полученный анатоксин осаждают 10% стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета до 1% на весь объем.

После отстаивания анатоксина в течение 2 3 дней надосадочную жидкость отсасывают сифоном.

К и О антигены получают путем засева суточных бульонных культур отобранных штаммов E.coli на МПА в колбы Тартаковского и выращивания в термостате при 37^oC в течение 2-х суток, затем смываются стерильным физраствором с содержанием 0,3% формалина в стерильную колбу с примерной концентрацией 50 60 млрд.м.к. в 1 мл к смыву культур добавляется перекись водорода до концентрации 0,15 0,25% Затем полученные анатоксин и антиген смешивают в равных объемных соотношениях и смесь разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. и.т. по стандарту мутности. Остаточное количество формалина в смеси не должно превышать 0,07% Авторами вакцина названа "Перекисная формолквасцовая вакцина против эшерихиоза телят". Технология ее изготовления может быть освоена на биофабрике при культивировании в реакторах как при получении анатоксина, так и антимикробных К и О антигенов.

Вакцина разливается при соблюдении стерильности во флаконы емкостью 100 и 200 мл. этикетируется с указанием даты изготовления, срока годности, номера контроля, серии, хранится при температуре 4 10^oC.

Контроль каждой серии вакцины перед выпуском осуществляется на: стерильность при высеве на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и инкубации 10 дней в термостате при 37^oC, при этом не должно быть роста микрофлоры.

Безвредность при внутрибрюшинном введении 4 6 белым мышам массой 14 - 18 г в дозе 0,3 0,5 мл и при наблюдении в течение 10 дней они должны оставаться живыми и не проявлять клинических признаков болезни.

Активность проверяется на 10 белых мышах привитых подкожно вакциной в дозе 0,1 мл (500 млн.м.т.) и через 14 дней заражением смесью гомологичных штаммов E.coli в дозе 3ЛД₅₀, при этом допускается гибель из 10 до 3-х мышей.

Характеристика готовой заявляемой перекисной формолквасцовой вакцины.

Вакцина жидкий препарат серовато белого цвета, содержащей 5 млрд. микробных тел в 1 мл, состоящие из анатоксинов к экзо и эндотоксинам и антимикробных К и О антигенов. Препарат обладает выраженными иммуногенными и антитоксическими свойствами.

При введении белым мышам в дозе 0,2 0,3 мл внутрибрюшинно с последующим заражением их в дозе вирулентной культурой в дозе 0,2 0,3 1 млрд. взвеси наблюдался 100% иммунитет, при 100% гибели контрольных мышей. Дозы вакцины 0,3 0,5 мл при подкожном введении белым мышам были безвредны. При высеве на МПА и МПБ,МППБ и экспозиции в течение 10 суток при 37^oC в термостате вакцина оставалась стерильной.

В совхозе "Чикский" проведена иммунизация 50 стельных коров вакциной подкожно за 1 1,5 мес. до отела по схеме: первый раз в дозе 5 мл. второй раз через 7 8 дней в дозе 7 8 мл в область средней трети шеи и третий раз 8 10 мл в область надвымянных лимфоузлов. Титры антител и привитых коров перед отелом к О антигену были в сыворотке крови к О антигену в среднем 1:320, в молозиве 1: 160, у телят в сыворотке крови до сосания молозива антитела к О-антигену E.coli отсутствовали, но после сосания молозива они появлялись и титр их в среднем был 1:160.

При комиссионном производственном испытании опытной и производственной вакцин против эшерихиоза телят заболеваемость телят от опытных коров была ниже и проявлялась в легкой форме, хотя дозы вакцины вводимой животным были в два раза меньше.

В 1993 году в учебном хозяйстве "Тулиновское" опытная вакцина была привита стельным коровам в таких же дозах как и биофабричная за 1,5 мес. до отела двукратно в дозах 15 мл и через 10 дней 20 мл. Из числа привитых биофабричной вакциной отелилось в марте 80 коров, заболеваемость полученных от них телят составила 80% летальность 12% В то же время из привитых опытной вакциной отелилось в марте же 20 коров, заболеваемость телят в легкой форме была у 20% и все они остались живыми.

Опытная вакцина использовалась для гипериммунизации 6 быков 1,5 2 лет весом 350 400 кг при подкожном введении по схеме: 5,10,20,30,40,50,60, 70 мл с интервалом 3 4 дня с последующим обескровливанием, получением 25 литров сыворотки в биоцехе Новосибирской областной ветеринарной станции, титр которой к О-антигену в среднем был 1:640.

Гипериммунная сыворотка применялась для лечения 150 больных эшерихиозом телят в совхозе "Чикский", лечебная эффективность ее составила при тяжелом течении болезни 86,7% В то же время за предыдущий 1991 год при лечении эшерихиоза телят на этой же ферме биофабричной гипериммунной сывороткой падеж телят был в два раза выше и составил 42% В 1993 году при гипериммунизации 10 быков 1,5 2 лет в учебном хозяйстве "Тулинское" титр сыворотки составил по О-антигену 1:1280, применение ее с профилактической целью по 20 мл. профилактировало заболевание в опыте на 20 телятах, при заболеваемости в контроле 80%

Формула изобретения

Способ получения вакцины против эшерихиоза телят, включающий культивирование токсигенных штаммов Escherichia coli в жидкой питательной среде, отделение микробной массы от токсинсодержащей культуральной жидкости с последующим осаждением токсина, отличающийся тем, что токсигенные штаммы культивируют на среде Хоттингера в течение 5 7 дней, микробную массу отделяют от токсина на фильтрах со стерилизующими пластинами, далее токсин инактивируют в фильтрате формалином добавлением последнего до 0,3 0,4% с выдерживанием при 37^oС в течение 10 12 дней, затем полученный анатоксин осаждают 10%-ным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем, после отстаивания в течение 2 3 дней надосадочную жидкость удаляют, полученный комплексный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигеном, полученным из штаммов Escherichia coli после выращивания суточных бульонных культур при 37^oС в течение двух суток и смыва микробной массы физраствором, содержащим 0,3 0,4% формалина с доведением до концентрации 50 60 млрд. микробных тел в 1 мл и добавлением к смыву перекиси водорода до содержания ее до 0,15 0,25% причем смесь анатоксина и антигена разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. микробных тел.