Олигонуклеотиды и способ их получения

 

Использование: в качестве гидридизующих агентов. Сущность изобретения: продукт, олигонуклеотиды общей формулы 1: где R₁ - H или остаток формулы II где R₂ - H или остаток формулы III B-аденин, тимин, цитозин или гуанин, W и W' - атом кислорода, Z и Z' независимо - O-C₁-C₃ алкокси, C₁-C₃ алкил. Продукт получают реакцией между соответствующими нуклеотидными единицами с 3'- или 5'- концевыми фосфор (III) или фосфор (V) - содержащими группами и соответственно с 3'- или 5'- концевыми свободными гидроксигруппами, с последующим при необходимости снятием защитных групп. 2 с.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.

Антисмысловыми олигонуклеотидами называют фрагменты нуклеиновых кислот, последовательность которых комплементарна кодирующей или "смысловой" (восприимчивой) последовательности мРНК, кодирующей нити соответствующей ДНК. Такие олигонуклеотиды находят все большее применение для ингибирования экспрессии генов in vitro или в клеточных культурных системах. Применение такого рода соединений в медицине и терапевтической практике, например, в качестве антивирусных фармацевтических препаратов, является предметом многочисленных исследований. В биологии уже давно известны антивосприимчивые PHK-последовательности, выступающие в качестве природных регуляторов экспрессии генов в прокариотах (t. Mizuno, M.-Y. Shou and M. Inouye, Pros. Natl. Acad. Sci. США 81, 1966 1970, 1984) и в эукариотах (S.M. Heywood, Nusleic Acids Res. 14, 6 771 6 772, 1986). Через гибридизацию соответствующей mPHK (Messenger) они показывают ингибирующее действие на трансляцию. Между тем в ходе многочисленных экспериментов удалось показать, что такие антивосприимчивые последовательности PHK, будучи введенными в бактерии (A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi and M. Inouye, PNAS США 83, 7 726 7 730, 1986) или в клетки эукариотов (J.G. Izant and H. Weintraub, Cell 36, 1 007 1 015, 1984), также могут затруднять экспрессию генов и оказывать антивирусное (L. J. Chang and C.M. Stoltzfus, J. Virology 61, 921 924, 1987) и антионкогенное действие (J.T. Holt, T.V. Gopal, A.D. Moutton and A.W. Nienhuis, PNAS США 83, 4 794 4 798, 1986). Для таких исследований синтетические олигонуклеотиды по сравнению с биологическими антивосприимчивыми PHK имеют то преимущество, что они обладают более высокой стабильностью и легче доступны. Последнее обстоятельство обусловлено разработанной в последнее время усовершенствованной техникой синтеза, которая позволяет довольно легко получать олигомеры с более короткой цепью (например, из 12-30 оснований) (E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14, 274-325, 1986); Oligodeoxynusleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989; с. 7 и последующие).

Было показано, что уже такие короткие олигомеры являются эффективными модуляторами экспрессии. Кроме того, такие олигонуклеотиды могут связываться с двойным тяжем ДНК с образованием Tripel-Helix. Разумеется, для того, чтобы такие антивосприимчивые олигонуклеотиды и Triplex-образующие олигонуклеотиды можно было использовать в биологических системах, они должны отвечать следующим требованиям (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen ed. Macmillian Press, 1989, с. 1 и последующие): 1. Они должны хорошо растворяться в воде и в то же время легко проходить через лиофильные клеточные мембраны.

2. Они должны быть достаточно стойкими внутри клетки, т.е. стабильными по отношению к нуклеазам.

3. Они должны образовывать с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами при физиологических температурах стабильные гибриды.

4. Гибридизация должна быть селективной. Различие в температуре диссоциации по отношению к олигонуклеотиду, образующему неверное спаривание, должно быть достаточно большим, чтобы его можно было селективно отмыть.

В 1978 г. Zamecznik и Stephenson, PNAS США 75, 280-284 и 285-288, 1978 г. впервые показали, что немодифицированные олигонуклеотиды могут тормозить размножение вирусов саркомы Rous. Естественно, эти олигонуклеотиды использовались в очень высоких концентрациях. Кроме того, в большинстве случаев эти опыты проводились в предварительно нагретых средах для дезактивирования нуклеаз. Необходимость таких мер объясняется быстрым ферментативным распадом чужеродных нуклеиновых кислот в сыворотке и в клетках.

Поэтому уже давно проводились исследования, цель которых состояла в такой структурной модификации олигонуклеотидов, которая позволила бы более полно удовлетворить вышеперечисленные требования, в частности защитить их от разрушающего действия нуклеаз. Эти исследования были направлены в первую очередь на модификацию фосфордиэфирной межнуклеотидной связи, поскольку в конечном счете именно она является точкой воздействия всех нуклеаз. Все структурно модифицированные межнуклеотидные в принципе можно распределить на а) нуклеозидные связи с фосфором в качестве центрального атома (эти связи в свою очередь могут быть ионо-хиральными, ионо-ахиральными и нейтрально-ахиральными) и б) нейтрально-ахиральные нуклеозидные связи, не содержащие фосфора.

К стуктурно модифицированным, но еще ионным межнуклеозидным связям относятся тиофосфатные и дитиофосфатные связи. Модифицированные тиофосфатными связями олигонуклеотиды (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitor of Gene Expression, J. S.Cohen ed. Macmillian Press 1989, с.97 и последующие) являются в настоящее время соединениями, оказывающими наиболее сильное ингибирующее действие на экспрессию генов в клеточных структурах. Однако, это ингибирующее действие, по-видимому, не связано с какой-то конкретной последовательностью, поскольку ингибирующее действие оказывают и такие модифицированные тиофосфатными связями олигонуклеотиды, которые состоят только из одной нуклеиновой кислоты в качестве структурного элемента. Примерами таких олигонуклеотидов являются аналоги олигоцитидилата. Применение модифицированных тиофосфатными связями олигонуклеотидов ограничивается, кроме того, их хиральностью.

Так как при получении олигонуклиотида из n оснований образуется 2^n-1 диастереомеров, то лишь ничтожная часть полученного препарата с тиофосфатными связями обладает хорошими гибридизирующими свойствами.

В случае олигонуклеотидов с дитиофосфатными межнуклеозидными (A. Grandas, Williams. Marshall, John Nielsen u Martin H. Caruthers, Tetrahedron Lett 20, 543-546, 1989), G.M. Porritt. C.B. Reese Tetrahedron Lett 30,4 713 4 716, 1989) проблема хиральности не стоит. Однако в настоящее время такие соединения могут быть получены лишь с помощью сложных многостадийных синтезов с низким выходом. Поэтому до настоящего времени широкие исследования по гибридизации и прежде всего в клеточных структурах не проводились.

Другим классом химически модифицированных олигонуклеотидов являются олигонуклеотиды с неионными, т.е. нейтральными межнуклеозидными связями. К этому классу модифицированных структур относятся олигонуклеотиды с фосфортриэфирными или метилфосфонатмежнуклеозидными связями (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillian Press, 1989, с. 79 и последующие).

Общее у этих двух классов связей состоит в том, что ионизирующий фосфатный остаток в них заменен незаряженной группой. Благодаря введению такой связи эти олигонуклеотидные аналоги становятся стойкими по отношению к нуклеазам. Недостатком их однако является плохая растворимость в водной среде.

Олигонуклеотиды с нейтрально-ахиральной межнуклеозидной связью до настоящего времени удавалось получать лишь путем замены атома фосфора в межнуклеозидной связи на другой центральный атом. Аналогичной связи эфира фосфорной кислоты является силоксановая связь. Олигонуклеотиды с силоксановыми межнуклеозидными связями синтезированы (K.K. Ogilvie, J.F. Cormeier, Tetrahedron Lett. 26,4 159, 1985), H. Seliger, G. Feger, Nusl, Nucl. 6, 1982), 483-484, 1987). Они являются стойкими по отношению к нуклеазам.

Олигонуклеотиды с карбонатными, ацетальными или карбоксамидными межнуклеозидными связями известны из M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 31, 2 385 2 388, 1990), J.R Tittenson, J.Chem. Soc. C. 1971, с. 2 656, и J. Coull и др. Tetrahedron Lett. 28,745, 1985).

Стойкие по отношению к нуклеазам аналоги олигонуклеотидов могут быть получены и без модификации фосфордиэфирной межнуклеотидной связи с использованием для этой цели сахарных остатков измененной конфигурации. Это удалось сделать путем синтеза аналогов олигонуклеотидов, в которых нуклеооснования соединены α-гликозидной связью (Oligodeoxynucliotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen ed. Macmillan Press, 1989, с.119 и последующие). Однако такие аналоги олигонуклеотидов предпаративно труднодоступны, поскольку в качестве исходных соединений при их получении необходимо использовать сахара и основания. Кроме того, с точки зрения направленности гибридизации, они до некоторой степени проявляют аномальное поведение.

Предметом изобретения является олигонуклеотиды формулы I или II

в которой R¹ означает атом водорода или остаток формулы III

R² атом водорода или остаток формулы IV

причем по меньшей мере один из остатков R¹ или R² означает остаток формулы III или IV.

B основание, например, природные основания, такие как аденин, тимин, цитазин, гуанин, или синтетические основания, такие как пурин, 2,6-диаминопурин, 7-деазааденин, 7-деазагуанин, N⁴ этаноцитозин, или их пролекарственные формы;
W и W¹ независимо друг от друга означают атом кислорода или серы;
Z и Z¹ независимо друг от друга означают алкокси-, предпочтительно C₁-C₈-алкокси-, наиболее предпочтительно C₁-C₇-алкокси-, в частности метоксигруппу;
C₁-C₁₈ предпочтительно C₁-C₈-, наиболее предпочтительно C₁-C₃-алкил, в частности метил;
NHR³, где R³ предпочтительно означает C₁-C₁₈- наиболее предпочтительно C₁-C₈-, в частности C₁-C₄-алкил, или C₁-C₄-алкокси;
C₁-C₆-алкил, предпочтительно метоксиэтил;
NR³R⁴, где R³ имеет вышеприведенное определение, а R⁴ предпочтительно означает C₁-C₁₈-, наиболее предпочтительно C₁-C₈-, в частности C₁-C₄-алкил, или R³ и R⁴ вместе с атомом азота, с которым они соединены, образуют 5-6-звенное гетероциклическое кольцо, которое может дополнительно содержать еще один гетероатом из числа O, S, N, например, морфолин;
Y означает остаток из группы O-Si(R)₂, OCH₂, C(O)NR или OCH₂-C(O), где R означает C₁-C₆-алкил, арил или C₅- или C₆-циклоалкил, а
n целое число, равное 5 60, предпочтительно 10 40, наиболее предпочтительно 15 25,
а также их физиологически приемлемые соли.

Под арилом в указанной формуле имеются в виду, например, фенил или замещенный (одно-трехкратно) C₁-C₆-алкилом, C₁-C₆-алкокси-группой и/или галогеном фенил.

Предпочтительными являются олигонуклеотиды формулы I.

Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды формулы I, у которых R² означает остаток формулы IV, а R¹ атом водорода; R¹ или R² означают остаток формулы III или IV, или R² означает атом водорода, а R¹ остаток формулы III, причем W или Z в последнем случае не означают атом кислорода.

Предпочтительными олигонуклеотидами формулы I являются далее соединения, у которых W или Z и W'означают атом кислорода.

Особенно предпочтительными являются олигонуклеотиды формулы I, у которых R² означает остаток формулы IV, а R¹ атом водорода.

Далее следует назвать олигонуклеотиды формул I и II, дополнительно замещенные группами, способствующими внутриклеточному включению, которые in vivo или in vitro играют роль информационных групп, и/или группами, которые при гибридизации олигонуклеотиды с ДНК или РНК реагируют с последними с образованием связи или с расщеплением.

Примерами групп, способствующих внутриклеточному включению, являются лиофильные остатки, такие как алкилы, например, содержащие до 18 атомов углерода, или холестерил, или конъюгаты, использующие природные системы носителей, такие как желчная кислота или пептиды, для соответствующего рецептора (например, передатчик рецептора эндоцитоза). Примерами информационных групп являются флуоресцирующие группы (например, акридинил, дансил, флуоресцеинил) или хемилюминесцирующие группы, такие как акридиноэфирные группы.

Олигонуклеотидные конъюгаты, которые связываются с нуклеиновыми кислотами и/или расщепляют их, включают акридин (N. Thuong и др. Tetrahedron Lett. 29, с. 5 905, 1988), псорален (U. Peiles и др. Nucleic Acid Res. т.17, с. 285, 1989) или хлорэтиламиноарильные конъюгаты (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen ed. Mc Millou Press, 1989, с.173 и последующие).

Характерная особенность структурной модификации олигонуклеотидов в соответствии с изобретением состоит в том, что межнуклеотидные связи в них изменены с обоих концов цепи, т.е. вместо биологических 3'-5'- имеют место 3'-3'-, соответственно 5'-5'- связи. Совершенно неожиданно нами было обнаружено, что такая минимальная структурная модификация оказывается достаточной, для того, чтобы сделать такие соединения стойкими к распаду, происходящему под действием нуклеазы.

Как будет показано ниже, такая лишь незначительная структурная модификация обеспечивает поведение при гибридизации, почти такое же, как в случае биологических олигонуклеотидов. Отсюда вытекает возможность широкого использования этих соединений в качестве ингибиторов экспрессии генов в клеточных культурах.

В имеющейся литературе отсутствуют данные о получении аналогов олигонуклеотидов с 3'-3'- и 5'-5'- межнуклеозидными связями на обоих концах цепи и их применении в качестве антивосприимчивых олигонуклеотидов. Аналоги динуклеозидфосфатов, содержащие 3'-3'- или 5'-5'- связи, в качестве главных (A. Myles, W. Hutzenlaub, G. Reits и W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2 857 2 871, 1975); H. Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub и W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2 872 2 877, 1975); J. Tomas'z, Nucl. Nucl. 2(1), 51-61, 1983); M. Nemer, N. Theriault, A. Schifmann u K. K. Ogilvie, 5-й International Round Table, Nicleosides, Nucleotides и their biological Applications, La Grande Motte, ed. J. L. Imbach, 94-96, 1984) или побочных (R. Letsinger, K.K. Ogilvie, J. Amer. Chem. Soc. 89, 4 801 4 802, 1967) продукты соответствующей реакции конденсации были уже давно получены и изучены. Такие димеры вследствие своей слишком низкой температуры плавления в принципе однако неспособны стабильно гибридизироваться с клеточными нуклеиновыми кислотами. Олигонуклеотиды с 5'-5'-связью только на одном конце синтезировали для создания места введения информационных групп в генозондах (S. Agrawal, C. Christodoulou, M. J. Gait, Nicleic Acid Res 14, 6 227 6 245, 1986). Однако до сих пор не изучена их способность к гибридизации. Для биофизических исследований были получены самокомплементарные олигонуклеотиды, в середине молекулы которых имеется одна 3'-3'- или 5'-5'-связь (J.H. Vande Sande, N.B.Ramsin, M.W.German, W. Elhorst, B. W. Kalisch, E.V.Kitzing, R.T.Pon, R.C.Clegg, T.M.Jovin, Science 241, 551-557, 1988).

Получение олигонуклеотидов с концевой инвертированной 3'-3'- и 5'-5'- связью осуществляется таким же образом, как и синтез биологических олигонуклеотидов, в растворе или, что предпочтительнее, в твердой фазе, при желании с использованием автоматического реактора.

Предметом изобретения, таким образом, является также способ получения олигонуклеотидов формулы I, отличающийся тем что,
а) нуклеотидную единицу с 3'- или 5'- концевыми фосфор (III)- или фосфор (V) содержащими группами или ее реакционноспособное производное подвергают взаимодействию с другой нуклеотидной единицей с 3'- или 5'- концевой свободной окси-группой или
б) синтезируют олигонуклеотид аналогичным образом из фрагментов; в полученных по способу (а) или (б) олигонуклеотидах отцепляют одну или несколько защитных групп, при желании введенных для защиты других функциональных групп, и полученные в результате олигонуклеотиды формулы I переводят при желании в их физиологически приемлемые соли.

В качестве исходного компонента для получения олигонуклеотидов с концевой инвертированной 3'-3'-связью в случае твердофизного синтеза используют смолу-носитель, с которым первый нуклеозидный мономер связан через 5'-OH-группу. Для получения этого компонента используют получаемую известными из литературы способами (T. Atkinson, M. Smith, в Oligonocleotide Synthesis, M. J. Geit (ed. ) 35-49, 1984) смолу-носитель, предпочтительно силикагель или стекло с контролируемыми порами с функциональными амино-группами. Ее подвергают взаимодействию с нуклеозидным производным с защищенными нуклеоснованием и 3'-OH-группой, предварительно переведенным в 5'-n-нитрофенилсукцинат. Для защиты основных групп предпочтительно используют ацильные группы, например, бензоил, изобутирил или феноксиацетил. 3'-положение предпочтительно защищают диметокситритильной защитной группой, которую можно ввести по методу M.D.Matteucci, M.H.Carithers, Tetrahedron Letter 21, 1980, с. 3 243 3 246. Дальнейший синтез олигонуклеотидной цепи до предпоследнего члена осуществляют известными из литературы способами, предпочтительно с использованием амидов эфиров нуклеозид-3-фосфористой кислоты или нуклеозид-3'-H-фосфонатов с замещенными диметокситритильными группами 5'-OH-группами. В качестве последнего члена цепи опять-таки используется 3'-OH-группа, предпочтительно замещенный диметокситритилом амид эфира нуклеозид-5'-фосфористой кислоты или нуклеозид -H-фосфонат. Ниже представлена схема синтеза такой олигонуклеотидной цепи с концевыми инвертированными межнуклеотидными связями (фосфорамидитный цикл получения олигонуклеотидов с 3'-3'- и 5'-5'-связями на концах). Аналогичным образом получаются олигонуклеотиды с 3'-3'- или 5'-5'-связями.

Для определения структуры и секвенирования полученного олигонуклеотида с 3'-3'- и 5'-5'-концами вначале метят его концы. Для этого в него вводят радиоактивную метку, предпочтительно с помощью 5' γ ³²-P-ATP-полинуклеотидкиназы. Эту радиоактивную метку вводят в свободные 5'-OH-группы, т.е. по отношению к олигонуклеотиду, содержащему только биологические 3'-5'-связи на другом конце нуклеотидной цепи. Дальнейшее секвенирование проводят известными из литературы способами, предпочтительно путем селективного основного статического расщепления, описанного Maxam и Gilbert (A. M. Maxam и W. Gilbert. Methodsin Enzymology 65, 499-560, 1980).

По радиоактивной метке на "обратном" конце молекулы осуществляется также считывание последовательности в сравнении с олигонуклеотидом с биологической 3'-5'-связью в обратном направлении. Подробное описание теста приведено в примере 6.

Олигонуклеотиды формул I и II находят применение при осуществлении гибридизационнохимического способа регулирования или подавления биологической функции нуклеиновых кислот, основанного на присоединении к одно- или двухтяжевым нуклеиновым кислотам, а также для селективного подавления экспрессии вирусных геномных функций и профилактики и лечения вирусных заболеваний, для подавления онкогенной функции и лечения раковых заболеваний.

Мерой стабильности in vivo может служить поведение растворенного в кровяной сыворотке синтезированного по способу в соответствии с изобретением олигонуклеотида формулы I или II. Общий тест описан в примере 7. Соответствующий тест in vitvo с раствором фосфодиэстеразы змеиного яда описан в примере 8. В отличие от 3'-5'-олигонуклеотидов олигонуклеотиды в соответствии с изобретением распадаются значительно медленнее.

Пример 11 иллюстрирует стабильность в сыворотке олигонуклеотидов с концевой инвертированной 3'-3'-связью.

Способность к гибридизации определялась в модельных опытах, таким образом, как это описано в примере 9. Из этих примеров следует, что ряд SV40-специфических последовательностей с 3'-3'- и 5'-5'-концами, полученных по способу в соответствии с изобретением, при гибридизации с соответствующим противотяжем SV40-ДНК имеют значительно более низкую температуру плавления, чем температура плавления продукта гибридизации с соответствующей последовательностью, отличной от предлагаемой, т.е. не содержащей 3'-3'- и 5'-5'-концов.

Активность предлагаемых олигонуклеотидов с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями в качестве ингибиторов экспрессии генов иллюстрируется подавлением роста вируса SV40 (пример 10), а также ингибированием in vitro экспрессии онкогенного продукта p53 (пример 12).

Пример 1. Синтез амида эфира 3'-0-DMTr-дезоксирибонуклеозид-5'-(N,N-бисдиизопропиламино-b-цианэтокси)фосфористой кислоты.

Ниже приведена схема реакции (с использованием в качестве исходного материала нуклеозидов с защищенными основными группами).

a: B тимин;
b: B N⁵ бензоиладенин;
c: B N⁴ бензоилцитозин;
d: B N² изобутирилгуанин;
DMTr 4,4'-диметокситритил.

A) Получение 3',5'-0-бис-DMTr-дезоксирибонуклеозида 2.

Исходные материалы:
6 ммоль dT, dA^bz, dC^bz или dG^ibu;
14.4 ммоль DMTr-Cl;
14.9 ммоль абс. TEA.

Дезоксирибонуклеозид 1 растворяют в 50 мл абсолютного пиридина и при 0^oC добавляют к полученному раствору триэтиламин и диметокситритилхлорид. Смесь затем перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре, контролируя протекание реакции с помощью тонкослойной хроматографии (подвижная фаза: смесь CH₂Cl₂ и MeOH в соотношении 9:1). Реакцию прерывают путем добавления метанола, растворитель отгоняют и остаток растворяют в дихлорметане. Органическую фазу несколько раз промывают 1 М раствором NH₄HCO₃ и водой, высушивают над Na₂SO₄ и упаривают в ротационном выпарном аппарате.

3',5'-дитритилированный продукт 2 может быть очищен от избытка тританола и 5'-DMTr-dN с помощью колоночной хроматографии (адсорбент: силикагель 60H; элюент: CH₂Cl₂ с увеличивающимся содержанием метанола, причем дитритилированные дезоксинуклеозиды элюируются при концентрации MeOH 1-1.5%).

Выход: 73-85% от теоретич.

B) Селективное отщепление 5'-диметокситритильных групп
Литература: M.D. Matteucci и M.H. Caruthers Tetrahedron Lett. 21, 3 243 3 246, 1980.

Исходные материалы:
3 ммоль 3'-,5'-0-бис-DMTr-dN2
15 ммоль ZnBr₂
200 мл абсолютного нитрометана.

Раствор 3'-, 5'-0-бис-DMTr-dN2 в 100 мл нитрометана добавляют при 0^oC к суспензии бромида цинка в 100 мл нитрометана. В случае защищенного дезоксиаденозина в целях избежания депуринизации реакцию продолжают при охлаждения. Тем не менее, в случае этого нуклеозида отщепление, как это следует из данных тонкослойной хроматографии, заканчивается уже через 60 мин. В случае тимидина и дезоксигуанозина реакция при протекании ее при комнатной температуре также заканчивается через 60 мин, тогда как 5'-детритилирование бис-DMTr-дезоксицитидина происходит неполностью. В этом случае, для того, чтобы избежать отщепления 3'-диметокситритильной группы, реакцию прерывают через 3 ч.

Прерывание реакции осуществляют путем добавления к реакционной смеси 200 мл I M раствора NH₄Ac. Продукт 3 экстрагируют 200 мл CH₂Cl₂, органическую фазу еще раз промывают насыщенным раствором NaCl и водой, высушивают над NaSO₄ и отгоняют растворитель в вакууме.

Большую часть тританола можно отделить путем осаждения сырого продукта в примерно 500 мл н-гексана при -15^oC. Очистку высаженного продукта осуществляют хроматографически на колонке, заполненной силикагелем 60H с использованием в качестве элюента дихлорметана с увеличивающимся содержанием метанола.

Значения R_f 3'-DMTr- дезоксирибонуклеозидов отличаются от R_f соответствующих 5' тритилированных мономеров (подвижная фаза: смесь CH₂Cl₂ и MeOH в соотношении 24:1), как это видно из приведенных данных (см. табл. 1).

Выход: 48 65% от теоретич.

C) Получение амида эфира 3'-0-DMTr - дезоситрибонуклеозид-5'-0-(N,N-диизопропиламино-β-цианоэтокси)фосфористой кислоты 4.

Литература: H. Koster, Nucleic Acids Res. 12, 4 539 4 557, 1984.

Исходные материалы:
1 ммоль 3'-O-DMTr-дезоксирибонуклеозида 3;
1,5 ммоль хлор-N,N-диизопропиламино-b цианоэтоксифосина;
4 ммоль диизопропиламина.

Реакции фосфитилирования проводят по способу, аналогичному описанному и др. для получения амида эфира 5'-O-DMTr - дезокситрибонуклеозид-3'-O-фосфористой кислоты. Для растворения защищенных нуклеозидов в абсолютном CH₂Cl₂ добавляли в атмосфере аргона диизопропиламин, а затем фосфорилирующий агент. Через 30 мин реакцию прерывали путем добавления к реакционной смеси 30 мл этилацетата, раствор трижды подвергали экстракции насыщенным раствором NaCl, органическую фазу высушивали над Na₂SO₄ и растворитель отгоняли в вакууме. Сырой продукт подвергали очистке с помощью колоночной хроматографии (адсорбент: силикагель 60H; элюент: смесь петролейного эфира, дихлорметана и триэтиламина в соотношении 45 45 10).

Выход 4a: 93% от теоретич.

Пример 2. Получение тимидилтимидина с 3'-3'-фосфодиэфирной связью.

Ниже приведена схема реакции димерного блока.

A) Получение 5'-0- диметокситритилтимидина 5.

Исходные материалы:
20 ммоль (4.84 г) тимидина;
24 ммоль (8.2 г) 4,4'-диметокситритилхлорида;
1 ммоль (122 мг) диметиламинопиридина;
28 ммоль (3.8 мл) триэтиламина.

Продукт 5 получали по методу R.A. Jones (G. S. Ti, B.L. Gaffney и R.A. Jones, H. Amer. Chem. Soc. 104, 1 316 1 319, 1982). Тимидин высушивали путем трехкратного упаривания в 50 мл абсолютного пиридина, растворяли затем в 100 мл пиридина и при охлаждении льдом добавляли к раствору 4,4'-DMTr-C1 и DMAP в качестве катализатора. Протекание реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (подвижная фаза: смесь CH₂Cl₂ и MeOH в соотношении 9 1). Через 4 ч реакцию прерывали путем добавления 100 мл воды. Раствор трижды подвергали экстракции эфиром, органическую фазу высушивали и упаривали в ротационном выпарном аппарате. Остаток подвергали очистке путем перекристаллизации из бензола.

Выход: 9.68 г DMTr-dT (89% от теоретич.).

B) Получение амида эфира 5'-0- диметокситритилтимидин-3'-0-(N,N-диизопропиламино-β-цианоэтокси)фосфористой кислоты 6.

Получение и очистку 6 осуществляли таким же образом, как и в случае синтеза амида эфира 3'-0-DMTr-5'-0-фосфористой кислоты 4 (пример 1, C).

C) Получение 5'-0-ацетилмидина 8.

Исходные материалы:
2.0 ммоль (1.1 г) 3'-0-DMTr-dT 3a;
0,2 ммоль (12.2 мг) диметиламинопиридина;
4 мл уксусного ангидрида.

Литература: A.M. Michelson и A.R. Todd, J. Org. Chem. 1955, 2 632 2 638 (модифицированный метод).

К раствору 3'-0-DMTr-dT и DMAP в 20 мл абсолютного пиридина добавляли по каплям при охлаждении льдом Ac₂O. Через 3 ч реакция заканчивалась (контроль с помощью тонкослойной хроматографии; подвижная фаза: смесь CH₂Cl₂ и MeoH в соотношении 24 1). Продукт 7 высаживали, в 400 мл ледяной воды, осадок белого цвета отсасывали, промывали ледяной водой и высушивали.

Выход: 1.02 г 3'-0-DMTr-5'-0-Ac-dT (88% от теоретич.).

Для отщепления 4,4'-диметокситритильной группы продукт 7 перемешивали при комнатной температуре в 10 мл 80%-ной уксусной кислоты. Через 3 ч реакцию прекращали путем добавления к реакционной смеси 100 мл ледяной воды. При этом 4,4'-диметокситританол выпадал в виде белого осадка. Осадок отсасывали и фильтрат упаривали в ротационном выпарном аппарате. Маслянистый остаток растворяли в небольшом количестве CH₂Cl₂ и высаживали продукт в 200 мл н-гексана при -15^oC.

Выход: 455 мг 5'-0-ацетилтимидина (94% от теоретич.).

D) Получение тимидилил-(3'-3')тимидина 10.

Исходные материалы:
1.0 ммоль (705.8 мг) амида эфира 5'-0-DMTr -тимидин-3'-0-(N,N-дизопропиламино-b-цианоэтокси)-фосфористой кислоты 6;
0.9 ммоль (253 мг) 5'-0-ацетилтимидина 8;
2.6 ммоль (182 мг) тетразола;
9.0 ммоль (1.14 г) J₂.

Синтез димерного блока 10 осуществляли по описанному Koster (H. Koster, Nucleic Acids Res. 12,4 539 4557, 1984) способу получения 3'-5'-димеров нуклеозидов. Смесь 5'-0-ацетилтимидина и тетразола растворяли в 30 мл абсолютного CH₃CN и в атмосфере аргона добавляли к раствору амид эфира фосфоритной кислоты. Затем к раствору добавляли смесь 9 ммоль иода в 30 мл смеси ацетонитрила, пиридина и воды (24:5:1) и через 15 мин восстанавливали избыток иода 5 мл 40%-го раствора H₂SO₃. Раствор затем упаривали, остаток растворяли в CH₂CL₂, дважды промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и растворитель отгоняли. Сырой продукт подвергали очистке с помощью колоночной хроматографии (адсорбент: силикагель 60H; элюент: смесь уксусноэтилового эфира и дихлорметана сотношении 50:50).

Выход: 665 мг (75% от теоретич.).

Для отщепления ацетильной и b-цианоэтильной групп димер 1 в течение 1 ч обрабатывали 5 мл концентрированного NH₃ при комнатной температуре. 4,4'-диметокситритильные группы удаляли с помощью 80%-ой уксусной кислоты.

Пример 3. Получение тимидилтимидина с 5'-5-фосфодиэфирной связью 14.

Ниже приведена схема синтеза 14.

Отдельные стадии синтеза проводили описанными в примере 2 способами.

Структуру обоих димерных блоков устанавливали с помощью FAB-масс-спектрометрии и IH ЯМР.

Пример 4. Связывание 3'-0-диметокситритилдезоксирибонуклеозид-5'-0-сукцината с носителем CPG 10-1 400.

Введение в носитель CPG функциональных 3-аминопропильных цепей осуществляли по прописи Atkinson и Smith (T. Atkinson, M. Smith, в Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait (ed.), 35-49, 1984).

A) Получение 3'-0-DMTr-дезоксирибонуклеозид-5'-0-сукцината 15.

Исходные материалы:
1.0 ммоль 3'-0-DMTr-dN3;
0.8 ммоль (80 мг) ангидрида янтарной кислоты;
0.5 ммоль (61 мг) диметиламинопиридина.

Реакцию между ангидридом янтарной кислоты и 5'-OH-группой дезоксирибонуклеозида, растворенных каждый в 5 мл абсолютного пиридина, проводили в течение ночи при комнатной температуре, в присутствии DMAP в качестве катализатора. После окончания реакции раствор концентрировали и пиридин удаляли путем трех-кратной азеотропной перегонки с толуолом. Остаток растворяли в дихлорметане, промывали 10%-ным ледяным раствором лимонной кислоты и водой и упаривали органическую фазу в вакууме в ротационном выпарном аппарате. Сырой продукт растворяли в примерно 3 мл толуола и высаживали в 200 мл н-гексана.

Выход: 79-84% от теоретич.

B) Получение 3'-0-DMTr-дезоксирибонуклеозид-5'-0-сукцинил-n-нитрофенилового эфира 16 и связывание с носителем (см. нижеприведенную схему).

Исходные материалы:
0.8 ммоль 3'-0-DMTr-dN-5'-0-сукцината 15;
0.8 ммоль (112 мг) n-нитрофенола;
2.8 ммоль (412 мг) дициклогексилкарбодиимида;
3 г CPG 10-1 400 с функциональным группами.

Защищенный сукцинилированный дезоксирибонуклеозид добавляли к раствору n-нитрофенола в 5 мл абсолютного диоксана и 0.2 мл пиридина, после чего к смеси добавляли DCCI в качестве конденсирующего агента. Уже спустя короткий промежуток времени выпадал осадок дициклогексилмочевины, а через 3 ч по данным тонкослойной хроматографии (CH₂Cl₂/MeOH, 9:1) реакция полностью заканчивалась. Осадок отсасывали в атмосфере аргона и фильтрат без дополнительной обработки добавляли к суспензии носителя с функциональными группами в 15 мл абсолютного диметилформамида. После этого к смеси добавляли 0.8 мл триэтиламина и встряхивали ее в течение ночи. Носитель с иммобилизированным на нем продуктом отсасывали, промывали метанолом и эфиром и высушивали в эксикаторе.

Связывание продукта с носителем контролировали спектрометрически. Путем обработки пробы носителя (около 2 мг) 10 мл 0.1 н раствора n-толуолсульфокислоты в ацетонитриле отщепляли 4,4'-диметокситритильный катион и по абсорбции раствора при 498 нм рассчитывали степень связывания (в мкмоль/г) по уравнению:

Результаты:
3'-DMTr-dT-носитель 23 мкмоль/г
3'-DMTr-dG^ibu-носитель 21 мкмоль/г
3'-DMTr-dA^bz-носитель 21 мкмоль/г
3'-DMTr-dC^bz-носитель 15 мкмоль/г
Для блокирования непрореагировавших амино-групп носитель с иммобилизированным на нем продуктом встряхивали с раствором 1 мл уксусного ангидрида и 50 мг диметиламинопиридина в 15 мл абсолютного пиридина в течение 1 ч при комнатной температуре, затем отсасывали, промывали метанолом и эфиром и высушивали.

Пример 5.

А) Синтез олигонуклеотидов с концевой 3'-3'- и 5'-5'-связью
Синтез осуществляли в синтезаторе ДНК фирмы Applied Biosystems, Forster City, США, модель 381А, с использованием 0.2 мкмоль стандартной программы для всех стадий конденсации.

Схема синтеза приведена выше. В качестве материала носителя использовали описанный в примере носитель CPG 10-1 400. Реакции конденсации проводили с использованием обычных эфиров нуклеозид-3'-фосфористой кислоты и лишь на последней стадии использовали описанный в примере 1 амид эфира 3'-0-DMTr-нуклеозид-5'-0-(N, N-диизопропиламино-β-цианоэтокси)-фосфористой кислоты. После отщепления олигонуклеотида от носителя с помощью концентрированного NH₃ и удаления всех фосфатных и основных защитных групп путем нагревания аммиачного раствора в течение ночи при 60^oC пробу обессоливали путем высаживания в этаноле и подвергали целевую последовательность очистке от более коротких фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Для проведения исследований мы синтезировали эйкозатимидилат, содержащий только 3'-5'-связи, а также эйкозатимидилат с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями. Кроме того, мы выбирали последовательности из SV40-генома.

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды: dT₂₀; dT₂₀(3'-3', 5'-5'); SV40TS17: 17-мер, восприимчивая последовательность из SV40-генома в положениях 5 159 5 176; 5'-AGC TTT GСA AAG ATG CA-3'; SV40TAS17: 17-мер, антивосприимчивая последовательность по отношению к SV40TS17; 5'-TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'; SV40TAS17(3'-3', 5'-5'): 17-мер, антивосприимчивая последовательность по отношению к SV40TS17 с концевыми связями 3'-3', соответственно 5'-5'; 3'-T(5'-5') CC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5'; SV40TS35: 35-мер, восприимчивая последовательность из SV40-генома в положениях 5 142 5 176; 5'-AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGA AG-3' SV40TAS35: 35-мер, антивосприимчивая последовательность по отношению к SV40TS35; 5'-TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG CT-3' SV40TAS35(3'-3', 5'-5'): 35 мер, антивосприимчивая последовательность по отношению к SV40TS35 с концевыми связями 3'-3', соответственно 5'-5'; 3'-T(5'-5')CT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5'.

В) Синтез олигонуклеотдидов с концевой 3'-3'-связью.

В качестве материала носителя использовали описанный в примере 4 носитель CPG 10 1 400. Реакции конденсации проводили с использованием обычных эфиров нуклеозид-3'-фосфористой кислоты.

После отщепления олигонуклеотида от носителя с помощью концентрированного NH₃ и удаления всех фосфатных и основных защитных групп путем нагревания аммиачного раствора в течение ночи при 60^oC пробу обессоливали путем высаживания в этаноле и целевую последовательность подвергали очистке от более коротких фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. SV40TAS17(3'-3'): 17-мер, антивосприимчивая последовательность по отношению к SV40TS17 с концевой 3'-3'-связью; 3'-ТСС АТС TTT GCA AAG С(3'-3')Т-5'.

С) Синтез олигонуклеотидов с концевой 5'-связью и двумя концевыми тиофосфатными остатками.

В качестве материала носителя использовали выпускаемый промышленностью носитель CPG, содержащий 5'-0-диметокситритилтимидин, связанный через 3'-окси-группу. Реакции конденсации проводили с использованием обычных эфиров нуклеозид-3'-фосфористой кислоты и лишь на последней стадии использовали описанный в примере 1 амид эфира 3'-0-DMTr-нуклеозид-5'-0-(N,N-диизопропиламино-b-цианоэтокси)фосфористой кислоты.

На первых двух стадиях цикла вместо обычного окисления иодом окисление осуществляли элементарной серой (W. Stec и др. J.A.C.S. 106, с. 6 077, 1984).

После отщепления олигонуклеотида от носителя с помощью концентрированного NH₃ и удаления всех фосфатных и основных защитных групп путем нагревания аммиачного раствора в течение ночи при 60^oC пробу обессоливали путем высаживания в этаноле и целевую последовательность подвергали очистке от более коротких фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Был синтезирован следующий олигонуклеотид:
SV40TAS17(5'-5'): 17-мер, антивосприимчивая последовательность по отношению к SV40TS17 с 5'-5'-связью на 5'-конце и двумя тиофосфатными межнуклеотидными связями на 3'-конце 3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG (P_s) C(P_s) T 3'.

Пример 6. Анализ структуры и последовательности олигонуклеотида с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями.

Секвенирование олигонуклеотидов осуществляли по методу Maxam и Gi1bert (A.M.Maxam and W. Gi1bert, Methods in Enzymo1ogy 65, 499-56, 1980). Пробы по 100 рмоль метили радиоактивной меткой в присутствии (g-³²p)-ATP/Т4-полинуклеотидкиназы в 5'-OH-группе и затем проводили следующие специфические в отношении основной группы реакции:
(A+G) реакция: протонирование основания муравьиной кислотой;
G реакция: взаимодействие с диметилсульфатом;
(T+C) реакция: гидразинолиз;
C реакция: взаимодействие с гидразином в присутствии 5М NaC1.

Путем обработки 1M пиперидином при 95^oC олигонуклеотидные цепи расщепляли в модифицированных местах. Образующиеся в результате расщепления фрагменты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (20%-ый акриламид, 7М мочевины) и детектировали с помощью ауторадиографии. На фиг.1 показана ауторадиограмма секвенирования SV40TS17, SV40TAS17 и SV40TAS17(3'-3', 5'-5') (описание этих олигонуклеотидов см. в примере 5). Поскольку цепи были помечены в 5'-OH-группе, основную последовательность можно было проследить только для 3'-5'-связей в 3'-5'-направлении. Однако поскольку олигонуклеотид SV40TAS17(3'-3', 5'-5') имеет 3'-3'-концевую связь, 5'-OH-группа с радиоактивной меткой находится в его 3'-конце. Поэтому направление считывания этой последовательности является обратным (фиг.1). Это также является доказательством наличия 5'-5'-фосфодиэфирной связи на 5'-конце цепи со свободной 3'-OH-группой, которая не может быть фосфорилирована ферментом полинуклеотидкиназой.

Пример 7. Определение стабильности олигонуклеотида с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями в кровяной сыворотке.

А) Киназирование эйкозатимидилата с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями.

Литература: T. Mizuno, M.-Y. Chou and Inouya, Proc, Nat1. Asad. Sci. США 81, 1 966-1 970, 1984.

Исходные материалы:
1 мкл олигонуклеотида (0,01 OD₂₆₀);
1 мкл 10 х киназного буфера;
1 мкл Т4-полинуклеотидкиназы;
1 мкл g-³²p-АТР (удельная активность 6000 Ки/ммоль);
6 мкл H₂O.

Исходную смесь выдерживали в течение 30 мин при 37^oC, после чего инкубацию прекращали путем добавления мкл H₂O и проводили разделение на колонке, заполненной сефадексом ®G50. Фракции, содержащие целевой продукт, подвергали очистке и лиофилизировали.

в) Тест с кровяной сывороткой.

Литература: S.M. Heywood, Nuc1eic Acids Res. 14, 6 771-6 772, 1986.

Исходная смесь:
0.01 OD₂₆₀ радиоактивно меченный фосфорилированный олигонуклеотид для сравнения;
0.01 OD₂₆₀ T₂₀, для эксперимента 0.01 OD₂₆₀ T₂₀ с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями;
50 мкл свежей человеческой сыворотки.

Сыворотку добавляли к исследуемой пробе и встряхивали вручную в течение непродолжительности времени. Затем сразу же отбирали пипеткой 3 мкл для нулевого опыта и вводили их в 3 мкл формамидного буфера для подавления ферментной активности. После этого пробы подвергали инкубации при 37^oC.

Для определения кинетики процесса через определенные промежутки времени отбирали по 3 мкл и прекращали процесс ферментации вышеописанным образом (см. табл.2).

Пробы добавляли к 20%-му полиакриламидному гелю и разделяли с помощью гель-электрофореза, после чего анализировали с помощью ауторадиографии.

Ауторадиограмма расщепления со свежей человеческой сывороткой (слева) приведена на фиг.2, в табл.3.

Из полученных результатов следует, что природный олигоннуклеотид начинает распадаться уже через 5 мин, причем со временем распад возрастает. Модифицированный олигонуклеотид и после инкубации в течение 90 мин остается практически неизменным. Слабые линии, наблюдающиеся в продолжении всего опыта, являются следствием активности эндонуклеаз, присутствующих в сыворотке. Такое расщепление имеет важное значение для терапевтического применения этих олигонуклеотидов и является желательным, поскольку оно обеспечивает медленный распад активного вещества, благодаря чему в организме не может происходить аккумулирование этих соединений.

Пример 8. Изучение поведения олигонуклеотидов с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями по отношению к змеиному яду фосфодиэстеразе.

А) Киназирование эйкозатимидилата с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями.

Осуществляется таким же образом, как это описано в примере 7.

В) Гидролиз эйкозатимидилата с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями змеиным ядом фосфодиэстеразой.

Литература: A.Hirashima, S.Sawaki, Y.Inokuchi and M.Inouye, PNAS США 83, 7 726-7 730, 1986.

Исходные материалы:
5 мкл РНК-носителя;
50 мкл SQ-буфера;
1 мкл SVpdE (1.5 u/мкл).

Фосфорилированную пробу с радиоактивной меткой (сравнительное соединение: T₂₀; эксперимент: T₂₀ с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями) лиофилизировали и добавляли к ней РНК-носитель и SQ-буфер. Отбирали из смеси для нулевого опыта пипеткой по 5 мкл, а остальной раствор смешивали с ферментом и инкубировали при 37^oC. Для определения кинетики процесса отбирали пробы по 5 мкл в холостом опыте через 5, 15 и 30, а в опыте с эйкозатимидилатом с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями через 5, 30, 45, 60 и 90 мин. Для дезактивирования фермента пробы сразу же после отбора нагревали на водяной бане в течение 2 мин при 95^oC. Затем пробы лиофилизировали и добавляли к аналитическому 20%-му полиакриламидному гелю. После гель-электрофоретического разделения проводили ауторадиографический анализ.

Ауторадиограмма расщепления SVpdE приведена на фиг.3. Слева направо: T₂₀ (сравнительное соединение); T₂₀ с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями; кинетика процесса: через 5, 15, 30, 45, 60, 90 мин, смесь проб, отобранных через 0 и 15 мин, смесь проб, отобранных через 0 и 30 мин; кинетика процесса в холостом опыте: через 5, 15, 30 и 45 мин.

5'-5'-связь, как уже отмечалось, расщепляется сразу же. То, что дальнейшее расщепление по сравнению со сравнительным соединение происходит очень медленно, является несомненным следствием структуры испытуемого олигонуклеотида. После расщепления 5'-5'-фосфордиэфирной связи образуется молекула, содержащая в месте расщепления функциональную 5'-окси-группу. На других концах молекула 5'-фосфорилирована. Змеиный яд фосфодиэстераза не может воздействовать на эти оба конца. Медленное, но явно заметное дальнейшее расщепление обусловлено, по-видимому, присутствием описанной изготовителем (J.G. Izant and H.Weintraud, Ce11 36, 1 007-1 015, 1984) примесью однотяжевой эндонуклеазы, сверхскрученной ДНК РМ2, переведенной в развернутые формы. Хорошо видна длина последовательности. Однако можно различить лишь 19 полос, так как через 5 мин (отбор первой пробы для анализа кинетики процесса) уже произошло расщепление 5'-5'-фосфодиэфирной связи.

Пример 9. Излучение склонности к гибридизации олигонуклеотидов 3'-3'- и 5'-5'-связями.

Для определения склонности олигонуклеотидов к гибридизации снимали кривые плавления, для чего эквимолекулярные (5.23 нмоль) количества SV40TS17 и SV40TAS17 (3'-3', 5'-5') (описание этих олигонуклеотидов см. в примере 5) растворяли в 1 мл буфера с pH 7, содержащего 10 нМ какодилата Na и 100 мМ NaCl, нагревали раствор до 70^oC и контролировали процесс ренатурализации при медленном охлаждении (1^o/мин), измеряя поглощение раствора. Для снятия сравнительной кривой использовали такие же количества SV40TAS17. Аналогичным образом нагревали в буфере до 90^oC смесь 4.75 нМ SV40TS35 и 4.75 нМ SV40TAS35, соответственно SV40TS35 и SV40TAS35 (3'-3',5'-5'), и измеряли абсорбцию этих смесей при охлаждении. В результате были получены кривые плавления, из которых были определены следующие значения Tm (см. табл. 4).

Таким образом, за счет абиологических связей в случае 17-мера температура плавления снижается лишь на 0.6, а в случае 35-мера на 1.3^oC.

Пример 10. Ингибирование биосинтеза SV40T-антигенов олигонуклеотидов с концевыми 3'-3'- и 5'-5'-связями.

A) Клеточная культура.

Выращивали COSI-клетки в модифицированной Dulbecco Eagle среде (DMEM) с 10% -ой эмбрионной телячьей сывороткой. Чашки с тканевой культурой инкубировали при 37 и 7.5^oC в атмосфере CO₂.

B) Введение радиоактивной метки и разрушение клеток.

Около 4·10⁴ клеток наносили в виде монослоя на тканевую культуру. Конфлуэнтный слой клеток трижды промывали не содержащим метионина DMEM и затем метили ³⁵S-метионином с активностью 100 мкКи. В модификационных опытах с антивосприимчивыми олигонуклеотидами клетки одновременно с олигонуклеотидом SV40TAS17 (3'-3',5'-5') и радиоактивным метионином инкубировали в течение 30 мин при 37^oC. Затем клетки дважды промывали DMEM, содержащим 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и оставляли в этой среде еще на 30 мин. Для разрушения клеток их обрабатывали ледяным буферированным фосфатным буфером физиологическим соляным раствором (PBS), соскабливали с чашек и центрифугировали в течение 2 мин при нагрузке 400 г. Гранулы клеток разрушали затем путем обработки в течение 45 мин при охлаждении льдом 0.4 мл буфера (0.5% нонидет P40, 100 мМ трис-HCl, pH 9.0, 0.1 М NaCl) на 3·10⁶ клеток. Для предупреждения протеолиза к используемому для разрушения клеток буферу добавляли 1% трасилола и фенилметилсульфонилфторид до концевой концентрации 0.25 мг/мл. Лизат затем центрифугировали в течение 30 мин при 4^oC в ультрацентрифуге (105 000 г). Из центрифугата отбирали аликвотную часть (10 мкл) и определяли в ней содержание белка по методу Lowry. Для иммунного осаждения использовали такие же количества общего белка.

C) Иммунное осаждение.

И для иммунного осаждения дикого штамма T-антигена SV40, и для осаждения локализированного в цитоплазме мутантного T-антигена использовали моноклональное антитело PAb108. Указанное антитело подвергали очистке от содержащего гибридом супернатанта с помощью хроматографии на содержащей белок A сефарозе.

Экстракт клеток предварительно осаждали 100 мкл 10%-ной суспензии инактивированных путем нагревания и фиксированных с помощью формальдегида бактерий штамма Staphylokokkus aureus (Cowan 1) в течение ночи при 4^oC. Бактерии затем отделяли путем центрифугирования, надосадочную жидкость инкубировали в течение по меньшей мере 2 ч при 4^oC моноклональным антителом и, добавляя к ней S. aureus, получали высокоспецифичные иммунокомплексы. Этот процесс повторяли трижды для обеспечения полноты осаждения.

После этого иммунопреципитаты промывали (трижды 50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 500 мМ LiC1, 1 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, 1% трасилола; дважды 50 мМ трис-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl 5 мМ ЭДТА, 1% нонидета P40 и один раз 50 мМ NH₄HCO₃). Затем их элюировали в течение 45 мин при 4^oC 200 мкл буфера (50 мМ NH₄HCO₃, 1% SDS, 1% β-меркаптоэтанола), лиофилизировали, растворяя путем десятиминутного кипячения в 20 мкл буфера (65 мМ трис-HCl, pH 6.8 58 b-меркаптоэтонол, 1% глицерина, 0,01% бромфенолового синего) и добавляли к 3%-му полиакриламидному гелю (10% SDS). Белки отдельными порциями разделяли с помощью гель-электрофореза. Полосы фиксировали с помощью флюорографии на рентгеновской пленке (Kodak X-AR).

С помощью олигонуклеотидов, полученных предлагаемым способом таким образом, что они перекрывали начало трансляции Т-антигена, при внеклеточной концентрации их 30 мкМ, регистрировали 70%-ое торможение роста вирусов. Это по активности отличает их от соответствующих последовательностей, не содержащих 3'-3'- и 5'-5'-связей. В случае этих последних при такой же концентрации торможения не наблюдалось.

Фиг. 4 с очевидностью демонстрирует ингибирование Т-Ag-биосинтеза при обработке клеток 30 мкМ SV40TAS17-(3'-3', 5'-5').

Пример 11. Сравнение стабильности олигонуклеотидов в сыворотке, модифицированных только на 3'-соответственно только на 5'-конце инвертированными фосфодиэфирными связями.

Олигонуклеотиды расщепляли, предпочтительно со стороны 3'-конца, нуклеазами (J.Р. Shaw, K.Kent, J/Bird, J.Fishback. B.Froehler, Nucleid Acids Res. ) 19, 747-750, 1991). Поэтому необходимо было установить, достаточное ли только одной концевой 3'-3'-фосфодиэфирной связи для стабилизации олигонуклеотида в кровяной сыворотке. Поскольку меченый 32P фосфатный остаток в частности, при более длительной обработке пробы сывороткой расщепляется фосфатазами, для детектирования олигонуклеотидов использовали флуоресцеин.

Из генома Xenopus levis были синтезированы следующие последовательности:
кселев 1: 3'-А(5'-5') GC CTC AAA C^*AT GTG TGA CG-3';
кселев 2: 5'-AGC CTC AAA C^*AT GTG TGA S(3'-3')G-5'.

Синтезы проводили таким же образом, как это описано в примере 5, причем для десятой реакции конденсации использовали модифицированный в основании амид эфира цитидинфосфористой кислоты C^*, который обеспечивал впоследствии образование ковалентной связи с флуоресцеином. Реакцию с флуоресцеином проводили по методике фирмы Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology Auto Primer^TM Synthesis Kit Instructions (XY-023-00-01). Модифицированные олигонуклеотиды подвергали очистке с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле.

Тест в сыворотке:
10 пМ олигонуклеотида;
140 мкМ свежей человеческой сыворотки.

Пробы инкубировали при 37^oC. Через 15, 30, 45, 60 мин, 8 и 72 ч отбирали пробы по 20 мкл, дважды подвергали их экстракции смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1 и осаждали олигонуклеотиды этанолом. Продукты расщепления отделяли на 16%-ом полиакриламидном геле в автоматическом секвентаторе A.L.F. (Pharmacia, Freiburg) и детектировали. Как видно из фиг. 5, только в случае последовательности с инвертированной межнуклеотидной связью на 5'-конце уже через 15 мин после обработки сывороткой происходит расщепление (обнаруживаются продукты распада), а через 60 мин расщепление почти полностью заканчивается. В отличие от этого защищенный на 3'-конце 3'-3'-связью олигонуклеотид даже через 72 ч расщепляется лишь частично.

Пример 12. Ингибирование экспрессии генов в экспрессионной системе in vitro.

Для количественной оценки ингибирования экспрессии генов INV-олигонуклеотидами мы исследовали действие соответствующих антивосприимчивых олигонуклеотидов на экспрессию p53 in vitro в системе, содержащей p53 и РНК (E.Reihsaus, M.Kohler, S.Kraiss, M.Oren, M.Montenarli, Oncogene 5, 137-144, 1990).

Были синтезированы антивосприимчивая последовательность:
NH₂(CH₂)₆pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT(3'-3')T и в качестве сравнительного соединения соответствующая восприимчивая последовательность
NH₂(CH₂)₆ pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3'-3')A.

Антивосприимчивый олигонуклеотид предназначен для предупреждения трансляции онкобелка p53.

Изучалась экспрессия белка:
1. без добавки олигонуклеотида,
2. с добавкой 30 мкМ восприимчивой последовательности,
3. с добавкой 1 мкМ антивосприимчивой последовательности,
4. с добавкой 10 мкМ антивосприимчивой последовательности.

Для количественной оценки определяли денситометрически почернение полос белков (E. Reihaus, M. Kohler, S.Krass, M.Oren, M.Montenarli, Oncogene 5, 137-144, 1990).

Из фиг. 6 следует, что добавление 10 мкМ антивосприимчивого олигонуклеотида к экспрессионной системе вызывает примерно 70%-ое ингибирование. При снижении концентрации его до 1 мкМ ингибирования практически не наблюдается. То же самое имеет место и в случае восприимчивой последовательности, которая не связывается с иРНК.

Формула изобретения

1. Олигонуклеотиды общей формулы I

где R¹ H или остаток формулы II

R² H или остаток формулы III

В аденин, тимин, цитозин или гуанин;
W и W¹ кислород;
n 15 25;
Z и Z¹ независимо O^-, C₁ C₃-алкокси, C₁ C₃-алкил.

2. Способ получения олигонуклеотидов общей формулы I по п.1 или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что
а) нуклеотидную единицу с 3'- или 5'- концевыми фосфор (III) или фосфор (V) содержащими группами или ее реакционноспособное производное подвергают взаимодействию с другой нуклеотидной единицей с 3'- или 5'- концевой свободной гидроксигруппой или в) синтезируют олигонуклеотид из фрагментов в соответствии с а) и в полученных олигонуклеотидах при желании отделяют одну или несколько защитных групп, введенных для защиты других функциональных групп.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6