Способ получения средства, обладающего антиаллергической активностью

 

Способ предназначен для получения средства, обладающего антиаллергической активностью. Побеги курильского чая кустарникового экстрагируют 45 - 55%-ным спиртом этиловым при отношении 1 мас.ч. сырья : 12 об.ч. экстрагента два раза по 60 мин. Один раз - 30 мин при 50 - 70^oС. Водно-спиртовые извлечения упаривают, очищают сепарированием. Доупаривают и высушивают в вакуумной сушилке. 14 табл.

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего антиаллергической активностью.

В настоящее время повысилась частота аллергических заболеваний среди населения. Причиной этого является загрязнение воздушного бассейна, широкое использование химических средств, частое, иногда необоснованное, применение химиотерапевтических средств, которые сами являются выраженными аллергенами.

В связи с этим, актуальным представляется поиск и разработка новых антиаллергических препаратов из растительного сырья, обладающих десенсибилизирующей активностью, не оказывающих побочного действия и безвредных при длительном применении.

Разработан способ получения сухого экстракта из побегов курильского чая кустарникового.

Известен способ получения сухого экстракта из фиалки трехцветной, применяемого в качестве антиаллергического средства. Это средство получают экстракцией горячей водой при 70-80^oC.

Недостатками указанного способа являются слабо выраженная антиаллергическая активность по сравнению со средством, полученным по предлагаемому способу, а также низкое содержание биологически активных веществ в исходном лекарственном растительном сырье и в сухом экстракте, которые определяют биологическую активность (табл. 1).

Целью предлагаемого решения является повышение выхода биологически активных веществ и повышение антиаллергической активности.

Для достижения поставленной цели растительный материал - побеги курильского чая кустарникового (пятилистника кустарникового), экстрагируют 45-55%-ным спиртом этиловым при отношении 1 мас.ч. сырья: 12 об.ч. экстрагента при 50-70^oC и постоянном помешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при первом и втором контактах фаз 60 мин, при третьем контакте фаз 30 мин. Водно-спиртовые извлечения фильтруют через серошинельное сукно и последовательно упаривают до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений сепарируют. Полученный продукт доупаривают приблизительно до 1/5 и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта составляет 25,86% от массы растительного материала.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой аморфный порошок коричневого цвета с приятным запахом, потеря в массе при высушивании не более 4%.

1. На основании качественного фитохимического анализа сухого экстракта: 1. Установлено наличие флавоноидов.

0,1 г полученного экстракта растворяют в 50 мл 50%-ного спирта.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2% раствора алюминия хлорида, появляется желто-зеленое окрашивание.

На полоске хроматографической бумаги шириной 12 см и длиной 25 см, на линии старта, отстоящей на расстоянии 5 см от нижнего конца, на расстоянии 3 см от края хроматограммы и друг от друга, отмечают три точки. В первую точку с помощью микропипетки наносят 0,01 мл полученного раствора, в другие наносят 0,01 мл раствора ГСО (государственный стандартный образец) рутина и 0,01 мл раствора ГСО кверцетина в 95% спирте. Диаметр пятен не должен превышать 7 мм. Хроматограмму помещают в камеру с системой - бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2) так, чтобы линия старта не смачивалась, и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителя пройдет 20 см, хроматограмму вынимают из камеры и сушат на воздухе в течение 40 мин. Затем хроматограмму опрыскивают 2%-ным спиртовым раствором алюминия хлорида и помещают в сушильный шкаф на 2-3 мин при 100-105^oC. На уровне пятен-свидетелей должны появиться желтые пятна.

2) Установлено наличие дубильных веществ.

0,05 г полученного экстракта растворяют в 5 мл воды очищенной.

К 2 мл полученного раствора прибавляют 2-3 капли раствора железо-аммониевых квасцов, появляется черно-синее окрашивание.

3) Установлено наличие сапонинов.

0,05 г полученного экстракта растворяют в 5 мл воды очищенной.

К 2 мл полученного экстракта прибавляют 1 мл серной кислоты концентрированной, 1 мл 96%-ного спирта, 1 каплю 10%-ного железа сернокислого, появляется сине-зеленое окрашивание.

Количественное определение.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу с шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 100 мл 50%-ного спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. После охлаждения объем извлечения доводят 50%-ным спиртом до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А и 1 мл раствора алюминия хлорида в 95%-ном спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 95%-ным раствором до метки в мерной колбе на 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D_o - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья; m_o - масса ГСО рутина; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

Приготовление раствора ГСО рутина.

Около 0,5 (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при 130-135^oC в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95%-ном спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено, %: 7,95±0,07.

Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.

Изучены влияние состава и природы экстрагента, его соотношение с сырьем, температурного режима, степени измельчения сырья, продолжительности и кратности числа экстракций на выход биологически активных веществ из исследуемого лекарственного растения.

Количественная оценка велась по выходу суммы экстрактивных веществ (ГФ 11, вып, 1, с. 295) и содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт. Метрологическая характеристика определения суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов проводилась на образце курильского чая кустарникового, собранного в Иволгинском районе 1992 г. (табл. 2).

Подбор оптимального экстрагента является одним из основных моментов при получении извлечений. Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья водой, этиловым спиртом различной концентрации: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 96.

Результаты представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, 45-55%-ный спирт этиловый является оптимальным экстрагентом, так как позволяет получить наибольшее количество суммы флавоноидов в пересчете на рутин с учетом выхода суммы экстрактивных веществ.

Как известно, размер частиц сырья обуславливает полноту и скорость перехода в раствор экстрагируемых веществ. Проверена зависимость выхода суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы экстрактивных веществ от степени измельчения сырья. Сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0,5; 1; 2; 3; 5; 7; 10 мм.

Данные анализа представлены в табл. 4.

Оптимальная степень измельчения для сырья является размер частиц 2 мм. Дальнейшее уменьшение размера частиц приводит к затруднению процесса фильтрации, а увеличение размера частиц ведет к уменьшению выхода суммы флавоноидов и суммы экстрактивных веществ.

Подобрано оптимальное соотношение сырье : экстрагент для однократного залива сырья (табл. 5).

Оптимальное соотношение сырья и экстрагента 1:12. Дальнейшее увеличение соотношения нецелесообразно ввиду незначительного повышения выхода действующих веществ, а также увеличение расхода экстрагента.

На основании экспериментальных данных можно заключить, что увеличение температуры экстрагента положительно влияет на ход процесса экстракции. Установлена равновесная температура экстракции 60 ± 5^oC (табл. 6).

С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций изучена зависимость времени достижения равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент при трехкратной экстракции сырья. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 50%-ным спиртом в соотношении 1:12 на водяной бане при 60^oC при постоянном перемешивании с обратным холодильником. Через заданные промежутки времени (30, 60, 90, 120 мин) извлечения фильтровали (1-ый контакт фаз), определяя содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы экстрактивных веществ. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья при том же промежутке времени, подавая каждый раз 50%-ный спирт в количестве, равном объему слитого извлечения (второй и третий контакты фаз), также анализировали на содержание суммы флавоноидов и суммы экстрактивных веществ. Экспериментальные данные свидетельствуют, что равновесное состояние наступает при первом и втором контактах фаз через 60 мин, при третьем контакте фаз через 30 мин (табл. 7).

В течение первого контакта фаз экстрагируется около 50-60% экстрактивных веществ и суммы флавоноидов, второй контакт обеспечивает выход 25-30% и третий контакт - 10-25%, т.е. для полноты истощения сырья достаточно трехкратной экстракции.

Пример 1. 1 кг побегов курильского чая кустарникового измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л 50%-ным спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при 60^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор спирт 50%-ный в количестве, равном объему слитого. 1-ый слив 9,9 л; 2-й слив 10 л; 3-й слив 9,9 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно порциями упаривают примерно до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при 65-70^oC 8 ч. Получают 258,7 г готового продукта, что составляет 25,87% сухого экстракта от веса исходного сырья.

Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок коричневого цвета и приятным запахом, комкуется, с вяжущим вкусом, потеря в массе при высушивании 2,13%.

Антиаллергическую активность готового продукта оценивали в соответствии с "Методическими рекомендациями ..." (1988). С этой целью использовали модель анафилактического шока у морских свинок и реакцию непрямой дегрануляции тучных клеток крыс. Опыты проведены на 15 морских свинках обоего пола массой 300-350 г. Анафилактический шок вызывали общепринятым методом предварительной сенсибилизации животных антигеном и последующим введением разрешающей дозы этого антигена. В опытах в качестве антигена использовали сухой кристаллический яичный альбумид в дозе 1250 мкг/кг в 0,2 мл физиологического раствора, который вводили однократно подкожно. На 21 день после сенсибилизации животным вводили разрешающую дозу (12500 мкг/кг) антигена внутрибрюшинно. Следует отметить, что разрешающую дозу антигена вводили внутрибрюшино, а не внутривенно или внутрисердечно, чтобы не вызвать жестокую модель шока со смертельным исходом и с учетом того, что растительные препараты обычно оказывают на организм животного мягкое действие и вряд ли могут предотвратить анафилаксию. Оценку степени развития анафилактической реакции проводили по шкале Weigle (1960).

Экстракт курильского чая в виде водного раствора вводили животным внутрижелудочно 1 раз в сутки в дозе 300 мг/кг в объеме 1 мл/100 г в течение 21 дня. Морские свинки контрольной группы получили в соответствующем объеме дистиллированную воду. В качестве препарата сравнения (прототипа) использовали экстракт травы фиалки трехцветной в изоэффективной дозе 300 мг/кг внутрижелудочно 1 раз в сутки в объеме 1 мл/100 г в течение 21 дня.

Анафилактическую реакцию наблюдали сразу после введения разрешающей дозы яичного альбумина. Полученные результаты представлены в табл. 8.

Как следует из табл. 8, курсовое введение экстракта курильского чая кустарникового в указанной дозе оказывает выраженное антиаллергическое действие: значительно удлиняет латентный период развития анафилактической реакции (на 66 %), намного уменьшается тяжесть течения реакции анафилаксии и почти в два раза уменьшается продолжительность самой реакции. При этом антиаллергическая активность испытуемого средства более выражена, чем препарата сравнения.

Для подтверждения полученных данных проводили оценку влияния экстракта курильского чая кустарникового на реакцию непрямой дегрануляции тучных клеток (РНДТК). С этой целью реакцию ставили с сывороткой указанных морских свинок (контроль и опыт), добавляя антиген (яичный альбумин в физиологическим растворе) и тучные клетки крыс.

Полученные данные о количестве дегранулированных тучных клеток представлены в табл. 9.

Как следует из табл. 9, под влиянием экстракта курильского чая кустарникового дегрануляция тучных клеток снижается на 25%, а при использовании экстракта фиалки трехцветной - на 17%.

Пример 2. 1 кг побегов курильского чая кустарникового измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л спирта 45%-ного в соотношении сырье - экстрагент 1: 12 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при 50^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор спирт 45%-ный в количестве, равном объему слитого. 1-й слив 9,3 л; 2-й слив 9,5 л; 3-й слив 9,2 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно порциями упаривают примерно до 1/3 от первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке от балластных веществ сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают приблизительно до 1/5 первоначального объема и сушат на нержавеющих стальных противнях в вакуумной сушилке при 65-70^oC в течение 8 ч.

Получают 258,5 г готового продукта, что составляет 25,85% сухого экстракта от веса исходного сырья.

Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок коричневого цвета с приятным запахом, комкуется, на вкус вяжущий. Потеря в массе при высушивании 2,05%.

Исследовали острую токсичность сухого экстракта курильского чая кустарникового по общепринятому методу Кербера (Требования ...1984).

Опыты проведены на 36 беспородных белых крысах-самцах с исходной массой 160-180 г. Экстракт курильского чая кустарникового вводили в виде водного раствора однократно внутрибрюшинно в дозах 1500 - 5000 мг/кг. Наблюдения за животными проводили в течение 14 сут. Проведенные исследования показали, что LD₅₀ экстракта курильского чая кустарникового при внутрибрюшинном введении составляет 3000 мг/кг. При внутрижелудочном введении экстракта не отмечали гибели животных в течение всего срока наблюдения, что позволяет классифицировать испытуемое средство как малотоксичное вещество по классификации К. К. Сидорова (1973).

Антиаллергическую активность экстракта курильского чая кустарникового оценивали в соответствии с "Методическими рекомендациями ..." (1988). Описание схемы эксперимента описано в предыдущем разделе. Используемое средство в виде водного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 300 мг/кг в течение 21 дня. Полученные результаты приведены в табл. 10.

Как следует из табл. 10, экстракт курильского чая кустарникового в дозе 300 мг/кг оказывает умеренное антиаллергическое действие, о чем свидетельствует увеличение латентного периода и уменьшение длительности анафилактической реакции, а также снижение тяжести ее течения. При этом антиаллергическая активность экстракта курильского чая кустарникового превосходила таковую у препарата сравнения.

В другом опыте с целью подтверждения полученных данных проводили оценку влияния испытуемого средства на реакцию непрямой дегрануляции тучных клеток (РНДТК). Полученные данные представлены в табл. 11.

Как видно из табл. 11, под влиянием испытуемого средства дегрануляция тучных клеток снижается на 17,8%, а при использовании препарата сравнения на 12,7%.

Пример 3. 1 кг побегов курильского чая кустарникового измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л спирта 55%-ного в соотношении сырье - экстрагент 1: 12 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при 70^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор спирт 55%-ный в количестве, равном объему слитого. 1-й слив 9,8 л; 2-й слив 9,5 л; 3-й слив 9,5 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно порциями упаривают примерно до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке от балластных веществ сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают приблизительно до 1/5 первоначального объема и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при 65-70^oC в течение 8 ч. Получают 258,6 г готового продукта, что составляет 25,86% сухого экстракта от исходного сырья.

Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок коричневого цвета с приятным запахом, комкуется, с вяжущим вкусом, потеря в массе при высушивании 3,33%.

Антиаллергическую активность экстракта курильского чая кустарникового изучали по вышеописанному методу. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили в дозе 300 мг/кг внутрижелудочно в течение 21 дня.

Установлено, что полученный экстракт курильского чая кустарникового в указанной дозе обладает умеренной антиаллергической активностью, способствуя развитию менее тяжелой анафилактической реакции у морских свинок (табл. 12).

Как видно из табл. 12, под влиянием испытуемого средства латентный период развития анафилактической реакции удлиняется, уменьшается тяжесть течения и длительность анафилактической реакции. При использовании препарата сравнения наблюдаются аналогичные явления, но несколько в меньшей степени.

При использовании реакции непрямой дегрануляции тучных клеток крыс с использованием сыворотки морских свинок установлено, что при использовании экстракта курильского чая кустарникового РНДТК снижается на 17,1%, а экстракта фиалки трехцветной на 10,0% (табл. 13).

Таким образом, как видно из табл. 13, испытуемое средство оказывает умеренное антиаллергическое действие на морских свинках, несколько превосходя аналогичное действие у препарата сравнения.

Предлагаемый способ по сравнению с базовым позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой антиаллергической активностью за счет более высокого содержания биологически активных веществ (суммы флавоноидов).

Подсчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако, вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и дают перспективу внедрения в фармпромышленность.

Источники информации 1. Государственная фармакопея XI изд. - Вып. 1,2. -М. -1987. - 1990.

2. Кобыльченко Н. В. , Лежнева Л.П., Дорогойченко В.И., Забазная Е.И. //Всесоюзный съезд фармацевтов, 4-ный: Тезисы докладов.-Казань.-1986.- с. 233-234 (прототип).

3. Кугач В.В., Никульшина Н.И., Ищенко В.И. Лекарственные формы флавоноидов (обзор) //Химико-фармацевтический журнал -1988.-N 8.-с.1018-1025.

4. Методические рекомендации по оценке аллергических свойств фармакологических средств.- М, 1988. - 22 с.

5. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. //В кн. Токсикология новых промышленных химических веществ. - М, 1973. -с. 47-51.

6. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. - М.: Медицина, 1984.

7. Weigle W.O., Cochrane G., Dixon F.L., //J. Immunol.-1960.-V.95.-p.5.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего антиаллергической активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют побеги курильского чая кустарникового, экстракцию проводят 45 - 55%-ным спиртом этиловым при отношении 1 мас.ч. сырья : 12 об.ч. экстрагента два раза по 60 мин, один раз - 30 мин при температуре 50 - 70^oС, водно-спиртовые извлечения упаривают, очищают сепарированием, доупаривают и высушивают в вакуумной сушилке.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5