Способ эндотелизации in vitro протезов кровеносных сосудов

 

Изобретение относится к медицине, в частности к имплантируемым протезам кровеносных сосудов из пористого политетрафторэтилена. Способ включает электризацию внутренней поверхности протеза до осаждения на него положительного заряда с поверхностной плотностью 3,3•10^-11-3,3•10^-8 кл/м², термостабилизацию зарядов при температуре (150±2)^oС, заполнение протеза суспензией эндотелия в питательной среде и закрепление эндотелиальных клеток на внутренней поверхности протеза. В качестве эндотелия берут аутогенный эндотелий пациента или эндотелий человека на стадии его внутриутробного развития. Технический результат состоит в упрощении технологии и обеспечении стерильности протеза с эндотелиальным покрытием. 3 з.п.ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к имплантируемым протезам кровеносных сосудов. Протезы кровеносных сосудов, в частности протезы, изготовленные из пористого политетрафторэтилена (ПТФЭ), находят применение в сосудистой хирургии.

С начала использования полимерных изделий медицинского назначения делаются усилия повысить их биосовместимость и, в частности, создать антитромбогенную, фибринолитическую или тромболитическую поверхность раздела с жидостями организма, такими как кровь.

Известен способ [заявка Великобритании 2257147, МКИ С 08 J 7/12, 1993] повышения биосовместимости полимерных протезов кровеносных сосудов, согласно которому на внутреннюю поверхность полимерной трубки прививают агент с кислотными группами, такой как гепарин, гирудин, гиалуроновая кислота, стерптокиназа или урокиназа. Прививку проводят с помощью промежуточного соединения, содержащего аминогруппы, например альбумина, урокиназы, стрептокиназы или полиэтиленимина, способных ковалентно связываться с полимерной поверхностью под действием обработки высокочастотной плазмой.

Однако обработанная таким образом внутренняя поверхность полимерной трубки атромбогенна недостаточно. Практика показывает, что покрытие указанными препаратами недолговечно и легко смывается кровью.

Также известен способ [патент США 3808113, МКИ В 01 J 1/10, 1974] придания биосовместимости полимерным медицинским изделиям из полиэтилена, полипропилена, политетрафторэтилена и полисилоксана. Согласно этому способу полимерную поверхность обрабатывают искровыми разрядами, на обработанную поверхность наносят кислый водный раствор коллагена, покрытие сушат и подвергают воздействию радиации в атмосферных условиях.

Недостатком этого способа также является недостаточная атромбогенность полученного покрытия. Коллаген, не покрытый эндотелием, представляет собой тромбогенную поверхность. При имплантации протеза кровеносного сосуда с коллагеновым покрытием в артерии небольшого (менее 8 мм) диаметра наступает тромбоз.

Было показано [Herring M. , Gardner A., Glover Y. Surgery 84:498-504, 1978] , что наилучшим покрытием внутренней поверхности протезов кровеносных сосудов, предотвращающим тромбообразование, является покрытие аутогенными клетками эндотелия, трансплантированными на внутреннюю поверхность протеза. Было высказано предположение, подтвердившееся впоследствии, что трансплантированные клетки эндотелия будут мигрировать и размножаться, образуя в результате неоинтиму (neointima).

Поверхность протеза кровеносного сосуда из пористого политетрафторэтилена обычно несет электрический заряд, возникающий в процессе его изготовления. Этот заряд неравномерно распределен по поверхности; он может быть и положительным и отрицательным. Для трансплантации отрицательно заряженных клеток эндотелия необходимо, чтобы внутренняя поверхность протеза из пористого ПТФЭ несла равномерно распределенный положительный заряд. Такой заряд поверхности пористого ПТФЭ можно придать электризацией, однако он неустойчив во времени, так называемый "временный заряд". Было показано [Bowlin G. J. and Ringers S.E. Cell Transplantation, v. 6, 6, pp.623-629, 1997], что можно использовать "временный" заряд поверхности, если проводить эндотелизацию одновременно с электризацией поверхности пористого ПТФЭ.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является способ эндотелизации in vitro протезов кровеносных сосудов из пористого ПТФЭ [Bowlin G.J. and Rittgers S.E. Cell Transplantation, v. 6, 6, pp. 631-637, 1997]. Согласно указанному способу внутренний электризующий электрод помещают внутрь отрезка протеза. Отрезок протеза вместе с внутренним электродом помещают в наполняющий аппарат, в котором его медленно наполняют суспензией эндотелиальных клеток в питательной среде. Отрезок протеза, наполненный суспензией эндотелиальных клеток, вместе с внутренним электродом размещают внутри внешнего электрода, установленного в специальном устройстве, вращающем всю конструкцию. Непосредственно после начала вращения на электроды подается напряжение от делителя напряжения. Оптимальное напряжение, скорость вращения и время трансплантации (не указаны) выбирали для каждого материала и размера протеза кровеносного сосуда.

Описанный способ позволяет воспользоваться "временным" положительным зарядом поверхности для закрепления на ней эндотелия. Однако осуществление способа требует сложного устройства, в котором трудно поддерживать стерильные условия; это создает риск инфицирования протеза, который нельзя стерилизовать после трансплантации эндотелия.

Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, состоит в упрощении технологии и обеспечении стерильности протеза с эндотелиальным покрытием.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе эндотелизации in vitro протезов кровеносных сосудов из пористого политетрафторэтилена, включающем заполнение отрезка протеза суспензией эндотелия в питательной среде, электризацию внутренней поверхности протеза и закрепление на ней эндотелиальных клеток, перед заполнением отрезка протеза суспензией эндотелиальных клеток в питательной среде проводят электризацию внутренней поверхности протеза до осаждения на ней положительного поверхностного заряда с поверхностной плотностью 3,3•10^-11-3,3•10^-8 кл/м² и последующую термостабилизацию заряда при температуре 150±2^oС.

Нами неожиданно было обнаружено, что термостабилизация электризованного протеза из пористого ПТФЭ сохраняет заряд в течение времени, достаточного для его последующей эндотелизации и значительно дольше.

Электризацию проводят следующим образом.

Отрезок протеза кровеносного сосуда, изготовленного из пористого ПТФЭ, плотно надевали на стержневой внутренний электрод зарядного устройства, представляющий собой металлический стержень с диаметром, близким по размерам к внутреннему диаметру протеза кровеносного сосуда. Наружный электрод, выполненный в виде цилиндра, имел на внутренней поверхности покрытие из мягкого гигроскопического материала, которое перед электризацией пропитывали дистиллированной водой. Наружный электрод надвигали на стержень с надетым на него отрезком протеза и включали источник питания ВС-23, имеющий выносной делитель напряжения. На внутренний электрод подавали заданное значение потенциала 600±10 B в течение 1-10 минут. По истечении заданного времени без отключения напряжения наружный электрод сдвигали и после отключения напряжения измеряли поверхностный потенциал на контрольных участках отрезка протеза. Из значений поверхностного потенциала внутренней поверхности, а также значений относительной диэлектрической проницаемости и толщины протеза из ПТФЭ, определенных предварительно, рассчитывали поверхностную плотность заряда. Значение поверхностной плотности заряда должно быть не меньше 3,3•10^-11 кл/м² (это наименьшее значение, которое может быть точно измерено) и не выше 3,3•10^-8 кл/м², т.к. при большей поверхности возможен неконтролируемый разряд заряда.

Электризованные протезы кровеносных сосудов непосредственно после электризации прогревали в термостате при 150±2^oС в течение часа (термостабилизировали). Протезы были стерилизованы автоклавированием при 121^oС.

Для получения суспензии эндотелиальных клеток резецируют участок подкожной вены больного, которому предстоит трансплантация протеза кровеносного сосуда. Удобен для этой цели участок наружной яремной вены длиной около 4 см. Из этого участка получают аутогенный эндотелий.

Нами было также обнаружено, что для получения "универсального" эндотелия, годного для эндотелизации протезов кровеносных сосудов, можно использовать участок пупочной вены человеческих плодов, погибших при малом кесаревом сечении на сроках внутриутробного развития 16-26 недель.

В обоих случаях вена помещается во флакон со стерильным раствором фосфатного буфера, содержащим гентамицин и амфотерицин. В лаборатории в стерильных условиях вену промывают раствором фосфатного буфера или раствором Хенкса, в вену вводят раствор диспазы, закрывают с обеих сторон канюлями и помещают во флаконе с раствором фосфатного буфера на водяную баню. Содержимое вены и промывные воды сливают в стерильную пробирку с питательной средой; пробирку центрифугируют и собирают белый осадок. Осадок помещают в питательную среду, содержащую гентамицин и средство, вызывающее пролиферацию эндотелия "in vitro". Суспензию высевают в чашки Петри и выращивают в СО₂-инкубаторе в атмосфере углекислого газа в течение 1-4 недель.

Отрезки протеза кровеносного сосуда с внутренним диаметром 8 мм и меньше, длиной 5-70 см, электризованные и стерилизованные, наполняют суспензией эндотелия в питательной среде, помещают в роллерную установку, в которой их вращают со скоростью 8-25 об/час в течение 24 часов при температуре 37^oС. За это время эндотелий закрепляется на внутренней поверхности протеза. В стерильных условиях протез переносят в резервуар с питательной средой, где он выдерживается 10 дней в условиях 100%-ной влажности при 37^oС и в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа.

Электронная микроскопия (фиг. 1 и 2) протезов, обработанных заявляемым способом, показывает, что на внутренней поверхности протеза сформировался слитный монослой эндотелиальных клеток.

Формула изобретения

1. Способ эндотелизации in vitro протезов кровеносных сосудов из пористого политетрафторэтилена, включающий заполнение отрезка протеза суспензией эндотелия в питательной среде, электризацию внутренней поверхности протеза и закрепление на ней эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что проводят электризацию внутренней поверхности протеза перед заполнением отрезка протеза суспензией эндотелиальных клеток в питательной среде до осаждения на ней положительного заряда с поверхностной плотностью 3,3•10^-11-3,3•10^-8 кл/м² и термостабилизацию непосредственно после электризации при температуре (150±2)^oС.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве эндотелия берут аутогенный эндотелий пациента.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве эндотелия берут эндотелий человека на стадии его внутриутробного развития.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что берут эндотелий пупочной вены человеческих плодов на стадии внутриутробного развития 16-26 недель.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2