Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть применимо для получения аутопротезов для пластики органов и тканей. Вводят основу в организм. Извлекают основу из организма после формирования на ней структуры клетками и волокнами соединительной ткани собственного организма с толщиной, достаточной для сшивания ткани. Вшивают основу в зону пластики. В частном случае, в организм вводят основу, имеющую форму трубки. В частном случае, в организм вводят основу, имеющую форму мешочка. В частном случае, в организм вводят основу, имеющую форму участка кожи. В частном случае, в организм вводят основу, выполненную из миллипора. В частном случае, основу в организм вводят подкожно. В частном случае, основу в организм вводят забрюшинно. Способ позволяет упростить технологию получения аутопротезов, получать аутопротезы для большого количества различных органов и тканей. 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологиям, а именно к выращиванию аутопротезов с собственными стволовыми клетками животного организма, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для трансплантации кровеносных сосудов, желчного пузыря, мочеточников, маточных труб, бронхов, кишечника, протоков желез, пищевода, кожи и других органов и тканей.

Из уровня техники известны способы получения протезов, суть которых заключается в поэтапном формировании сосудистой стенки на какой-либо основе. Известен, например, \Протез для кровеносных сосудов\ (Патент РФ №20295527, публ. 1995 г.) /1/.

Основа известного протеза выполнена из силиконовой трубки, т.е. представляет собой инородное для организма тело, которое с течением времени может тромбироваться, с течением времени стареет с изменением свойств и может применяться только временно.

Наиболее близким к заявляемому изобретению относится способ получения протезов человеческих артерий, описанный в (МсКее J.A., Banik S.S., Boyer M.J., Hamad N.M., Lawson J.H., Niklason L.E., Counter C.M. Human arteries engineered in vitro // EMBO Rep. 2003 Jun; 4(6): 633-638 (Department of Anesthesiology and Department of Biomedical Engineering, Duke University, and Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, 27710, USA). (МсКее. J.A., Banik S.S., Boyer M.J., Hamad N.M., Lawson J.H., Niklason L.E., Counter C.M. Проектирование человеческих арюрий в vitro // EMBO Rep. 2003 июня; 4 (6): 633-638 (Отделение Анестезиологии и Отделения Биомедицинской техники, Университет Дьюка, и Университетский Медицинский Центр, Дархем, Северная Каролина, 27710, США) /2/.

В известном способе на основу из биоразлагаемого полимера, имеющую форму трубки, высеивают клетки человеческих мышц, взятые предварительно из маленького разреза на коже. Перед высеванием на основу эти клетки подвергались размножению, затем для увеличения продолжительности их жизни к ним добавляли ген под названием hTERT.

Через 2 месяца после высеивания клеток на основу она растворяется. В результате получают плотную мышечную структуру трубчатой формы. Для завершения процесса создания искусственного сосуда в него вводят специальные клетки, формирующие внутреннюю структуру артерии.

Известный способ является сложным и длительным. Во-первых, он предполагает наличие инкубаторов для поддержания культур клеток. Поскольку используются разные типы клеток, то требуются дополнительные усилия по их сочетанию. Кроме того, в известном способе используют введение специального гена, который может вызвать рост клеток внутри сформированного сосуда, что приведет к его закупорке.

Длительность выращивания сосуда, обусловленная временем растворения основы, также относится к недостаткам способа при его использовании в медицине, которая иногда бывает неотложной. Ко времени публикации статьи /2/ ученым из Медицинского центра при Университете Дьюка (США) удалось получить четыре артерии длиной 8 см и диаметром 3 мм.

Наконец, даже при создании отлаженной технологии на основе известного способа он будет иметь ограниченное применение, т.к. с его помощью можно получать протезы только из мышечных клеток, которые не могут создавать коллагеновые волокна.

В основу настоящего изобретения положена задача создания простого в использовании способа получения аутопротезов для большого количества органов и тканей.

Для решения поставленной задачи способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей, включающий нанесение на основу клеток собственного организма и выращивание на ней аутопротеза для пластики нужного органа, причем основу для протеза вводят в организм и после формирования на ней структуры клетками и волокнами соединительной ткани собственного организма с толщиной, достаточной для сшивания ткани, извлекают из организма для вшивания в зону пластики.

Для получения протезов органов трубчатой формы, например сосудов, пищевода, кишечника, протока желез, мочеточников, маточных труб, в организм вводят основу, имеющую форму трубки.

Для получения протезов органов, таких как, например, желчный пузырь, в организм вводят основу, имеющую форму мешочка.

Для получения протезов участков ткани, например кожи, в организм вводят основу, имеющую форму участка кожи.

Для ускорения процесса формирования соединительнотканной структуры в организм вводят основу, выполненную из миллипора.

Более простым и эффективным является подкожное введение основы. В случаях, необходимых для протезирования внутренних органов, например желчного протока или мочеточника, основу можно вводить в забрюшинное пространство.

В отличие от способа по прототипу, в котором стволовые клетки берут из человеческого организма, но выращивают на искусственной основе вне его, в заявленном способе клетки нужного органа выращивают внутри организма, нуждающегося в протезировании.

В основу настоящего способа положено защитное свойство живого организма \инкапсулировать\ введенные в него инородные тела. Ранее заготовленная основа, имеющая форму и размеры, обусловленные анатомией протезируемого органа, будучи введенной в организм, \инкапсулируется\ им, т.е. на основе неизбежно поселяются стволовые клетки органа или ткани, нуждающихся в пластике.

Через определенное время на введенной основе с помощью клеток формируется специфическая соединительнотканная структура, близкая к протезируемому органу по форме и клеточной структуре. При достижении соединительнотканной структурой толщины, достаточной для сшивания ткани при пластике ее извлекают из организма и после удаления из нее первоначальной искусственной основы вшивают больному.

Полученная внутри организма больного соединительнотканная структура представляет собой новообразованный протез, не пораженный патологическим процессом, совпадающий по антигенному составу с организмом, в котором он выращен, и поэтому не отторгающийся им.

Поскольку соединительнотканная структура всех тканей практически одинакова, полученный заявленным способом протез может быть вшит в любое место организма.

Заявленный способ является технологически простым, безопасным и пригоден для получения протезов для различных органов и тканей. Сроки выращивания протеза в эксперименте составляют четыре недели и будут опробованы способы их сокращения.

Заявленный способ экспериментально опробован на лабораторных животных - беспородных крысах, морских свинках, кроликах (табл.1). Перед операцией животным проводили эфирную анестезию 0,5%-ным раствором новокаина. Операционное поле выбирали в области спины или брюшной стенки и освобождали от волосяного покрова. Затем делали небольшой разрез размером 10 мм у крыс и свинок, 20 мм - у кроликов и подкожно вводили основу в форме трубки из следующих материалов: полихлорвинила, полиэтилена, миллинора). Для крыс и свинок использовали трубки диаметром 3 мм, для кроликов - 5 мм.

Форму трубки целесообразно использовать для получения основы иной формы, т.к. трубка легче извлекается из организма и при использовании определенных приемов моделируется в \заплатку\ (участок кожи) или в мешотчатое образование (например, для получения основы для желчного пузыря).

После вшивания основу оставляли в организме животного на сроки от 1 до 6 недель. Экспериментально определено, что через 4-5 недель на введенной основе образуется соединительнотканная структура, размеры которой достаточны для сшивания. Ее извлекали из организма, удаляли из нее основу и полученный трансплантат помещали в промежуточную среду (среда 199). С помощью бинокулярной лупы выделяли сонную артерию и накладывали два сосудистых зажима выше и ниже места протезирования. После этого артерию разрезали. Полученный протез вшивали конец-в-конец в виде анастомоза в рассеченную сонную артерию того животного, в организме которого он был получен. Для сшивания сосуда с протезом использовали материал Ethlon (9-0). Для предупреждения осложнений животному вводили антибиотик.

В конце аутотрансплантации зажимы убирали и наблюдали восстановление кровотока.

В таблице приведены результаты морфологического исследования аутопротезов, полученных заявленным способом для крыс и морской свинки.

Выводы по каждому из примеров 1-4 результатов исследований свидетельствуют о процессе формирования протеза. Так в примере 1 отмечается начало формирования соединительнотканной основы, в примере 2 стенки соединительнотканной основы уже более плотные, а в примерах 3, 4 соединительнотканная основа представляет собой протез стенки кровеносного сосуда.

Поскольку соединительнотканная основа всех тканей практически одинакова, можно предположить, что заявленный способ применим для получения протезов тканей большого количества органов и тканей.

Представленные в примерах результаты формирования соединительнотканной основы у разных типов животных и на разных типах материалов дают основание рассматривать обнаруженное явление, как общебиологическое, что в свою очередь позволяет распространить заявленный способ и на человека.

Таблица 1.
№№ примеров	Исследуемое животное	Материал основы	Способ введения основы	Время нахождения основы в организме	Результаты исследования
1	Крыса	Миллипор	забрюшинно	1 неделя	Стенка протеза представлена фибробластами, между которыми проходит бесструктурное межклеточное вещество. Определяется значительное количество клеток лнмфоидного ряда лимфоцитов и сегментоядерных лейкоцитов В наружной стенке протеза определяются структуры волокнистых коллагеновых волокон, в которых определяются мелкие капилляры. В прилегающей жировой ткани определяются лимфоидные инфильтраты и значительное количество тучных клеток. При окраске по ван-Гизону в стенке протеза определяются тонкие волокна более зрелые к наружной стенке протеза, во внутренней стенке межклеточное вещество бесструктурное, но на этом фоне определяются тонкостенные синусоидальные капилляры, проходящие перпендикулярно стенке протеза.
					Вывод: отмечается начало формирования соединительнотканной трубки.
2	Крыса	Миллипор	подкожно	2 недели	Протез представлен пролиферирующими фнбробластами. менее дифференцированными во внутренней и наружной оболочках. Со стороны внутренней оболочки определяются клетки лимфоидного ряда, единичные сегментоядерные лейкоциты, небольшое количество макрофагов. В средней части протеза определяются ориентированные волокнистые коллагеновые волокна, между которыми определяются фиброциты и в средней части протеза определяются капилляры, содержащие в просвете эритроциты. Располагаются очагово. Со стороны адвентиции количество капилляров увеличивается. При окраске по ван-Гизону более зрелые коллагеновые волокна локализованы в средней части протеза. С внутренней и наружной оболочки коллагеновые волокна располагаются более рыхло, менее ориентированы.
					Вывод: в сравнении с примером 1 соединительнотканный каркас более выражен, стенки трубки более плотные.
3	Крыса	ПХВ	подкожно	4 недели	Стенка протеза представлена фиброфластами, располагающимися рядами. Между ними проходят коллагеновые волокна разной степени зрелости. Часть из них приобретает волокнистую структуру. Фибробласты созревают в фиброциты. Также определяются по краям участки пролиферируюших фиброфластов, между которыми определяются тонкие коллагеновые волокна без определенной ориентации. По периферии протеза со стороны формирующейся адвентиции в стенке определяются капилляры, но это так называемые vaso vasorum.
					Вывод: образованная соединительнотканная основа готова для замещения дефекта стенки кровеносного сосуда.
4	Морская свинка	Полиэтилен	подкожно	4 недели	Со стороны интимы определяются в просвете протеза пролиферирующие фибробласты (мезенхимные стволовые клетки) с очаговой инфильтрацией сегментоядерных лимфоцитов и макрофагами. Сформированных клеток эндотелия и интимы не определяется К середине протеза определяются в стенке фиброциты, между которыми проходят волокнистые структуры, состоящие из коллагеновых волокон. К протезу прилегают структуры жировой ткани. При окраске по ван-Гизону коллагеновые волокна разной степени зрелости. Более зрелые со стороны адвентиции.
					Вывод: образованная соединительнотканная основа готова для замещения дефекта стенки кровеносного сосуда

1. Способ получения аутопротезов для пластики органов и тканей, включающий нанесение на основу клеток собственного организма и выращивание на ней аутопротеза для пластики нужного органа, отличающийся тем, что основу для протеза вводят в организм и после формирования на ней структуры клетками и волокнами соединительной ткани собственного организма с толщиной, достаточной для сшивания ткани, извлекают из организма для вшивания в зону пластики.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в организм вводят основу, имеющую форму трубки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в организм вводят основу, имеющую форму мешочка.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в организм вводят основу, имеющую форму участка кожи.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в организм вводят основу, выполненную из миллипора.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что основу в организм вводят подкожно.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что основу в организм вводят забрюшинно.