Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок musca domestica, и способ ее получения



Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок musca domestica, и способ ее получения
Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок musca domestica, и способ ее получения
Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок musca domestica, и способ ее получения
C07K1/16 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2714128:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" (RU)

Группа изобретений относится к области ветеринарной медицины, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для лечения инфекций бактериальной этиологии. Способ получения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica включает измельчение навески личинок в ступке с песком до однородной массы с добавлением по частям раствора, состоящего из 0,25% азида натрия и фосфатного буфера, перемешивание в течение 4 часов, центрифугирование, отбор водного слоя, содержащего антимикробные пептиды. Затем осуществляют высаливание путем добавления к выделенному раствору (NH4)2SO4, помещение раствора в морозильную камеру при t=5-10°С на 24 ч, центрифугирование в течение 40 минут при t=5°С со скоростью 4200 об/мин, и хроматографическое разделение пептидов с выделением фракции смеси пептидов с массой 3,4-6 кДа. Полученную смесь подвергают диализу на протяжении 24 часов против 0,9% раствора хлорида натрия, пропускают через фильтр и расфасовывают. Группа изобретений также относится к композиции антимикробных пептидов, содержащей смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, полученных указанным способом. Группа изобретений обеспечивает получение пептидов из личинок Musca domestica, обладающих антибактериальной активностью. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

 

Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica, и способ ее получения

Область применения

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для лечения инфекций бактериальной этиологии.

Одной из важных задач современного сельского хозяйства является интенсификация производства. Увеличение производства животноводческой продукции достигается, в том числе, и применением антибактериальных препаратов. Однако это приводит к селекции антибиотикорезистентных штаммов к известным антибактериальным препаратам, поэтому поиск новых альтернативных композиций является актуальной задачей.

Известно много различных инъекционных композиций для лечения инфекций бактериальной этиологии у животных, например, на основе: азитромицина (RU 2512683 С2, 10.04.2014 и CN 102846649), флуниксина и хлорамфеникола (MY 135791 А), флуниксина и энрофлоксацина (ЕР 1875913 и CN 102697784), флуниксина, энрофлоксацина, сульфадиазина, триметоприма и дексаметазона (CN 101829124), флуниксина, энрофлоксацина, триметоприма, тилозина и сульфаметоксазола (CN 102697784), флуниксина и окситетрациклина (PL 335878). Все приведенные композиции обладают широким спектром действия, стабильны при хранении, обладают пролонгированным действием и высоким лечебным эффектом, однако большого числа микроорганизмов на данный момент времени выработана резистентность к данным действующим веществам.

II. Предшествующий уровень техники

Одним из перспективных направлений в заявленной области применения является использование в качестве действующего вещества пептидов насекомых, обладающих высокой антибактериальной активностью. На данный момент времени получены некоторые антимикробные пептиды, обладающие высокой антимикробной активностью, которые выделены из различных организмов например: производных меланоцит-стимулирующего гормона (US 6887846), ретроциклинов (WO 044998), магайнина (US 6872705), производных муцина (US 6790833), биоцидный пептид (RU 103887, 06.08.2018 бюл. №22), рекомбинантный полипептид (RU 123977, 17.01.2018 бюл. №2), пептида аллоферон (RU 2667128, 02.07.2018 бюл. №19), рекомбинантного полипептида, обладающего серинпротеазной активностью (RU 142580, 07.05.2018 бюл. №13), дефензинов человека (WO 081486, US 034820, WO 9807833, JP 288105, WO 9421672), антимикробных пептидов ракообразных (US 6642203), криптдина (WO 9616075), синтетических катионных пептидов (US 6906035, US 6624140, US 6172185), дефензиноподобный пептид стрекозы Aeschna cyanea (FR 2695392), комплексантимикробных пептидов мухи Calliphora vicina (US 6337093), антибактериальные пептиды жука Oryctes rhinoceros (US 6476189).

В настоящее время применяются три основных метода получения антимикробных пептидов: химический синтез, экстракция из организма-хозяина, синтез в культуре клеток-продуцентов.

Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки.

Так технология химического синтеза не позволяет получать пептиды высокой массы, так как синтез пептида с последовательностью более, чем 30 аминокислот затруднителен, однако данный метод позволяет получать пептиды в больших количествах и высокой чистоты, но обладает высокой себестоимостью и трудностью в случае синтеза длинных цепей, обладающих трехмерной организацией.

Синтез в культуре клеток-продуцентов обычно сводится к применению генно-инженерных методов. Генная инженерия дает возможность получать пептиды любой длины, однако в ряде случаев не позволяет точно воспроизводить пространственную структуру пептида и обычно отличается значительной стоимостью конечного продукта.

Метод экстракции из организма-хозяина позволяет получать целые комплексы антимикробных пептидов и обеспечивает максимально точное воспроизведение структуры активных компонентов, однако данный метод не позволяет выделять пептиды в особо чистом виде и чаще всего представляют собой смесь, характеризующуюся определенным интервалом масс.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является заявка на изобретение №2017144051 «Способ получения комплекса антимикробных пептидов из биомассы личинок большой восковой моли (Galleria mellonella)», где в качестве исходного субстрата использовались личинки восковой моли.

III. Сущность изобретения

Целью данного изобретения является создание новой фармацевтической композиции антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica.

Заявленное изобретение использует последний метод выделения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica.

Технический результат изобретения состоит в выделении пептидов, обладающих антимикробной активностью, из личинок Musca domestica, методом дробного высаливания с дальнейшим разделением на хроматографической колонке BioSep SEC S2000.

Метод получения фармацевтической композиции на основе антимикробных пептидов из личинок Musca domestica состоит из трех основных стадий:

1. Высаливание

2. Хроматографическое разделение

3. Создание конечной фармацевтической композиции.

Высаливание или экстракция водорастворимых пептидов из биологического образца (личинок Musca domestica).

Навеску личинок (Musca domestica) массой 3 г растирают в ступке с песком 5 г до однородной массы. Далее в процессе растирания добавляем по частям раствор состоящий из 0,5 мл азида натрия 0,25% и 20 мл фосфатносолевого буфера и перемешивают четыре часа. Далее полученные образцы центрифугируют при 4200 об/мин и отбирают водный слой, содержащий антимикробные пептиды. Для высаливания необходимо добавить к выделенному раствору 2,8 г (NH4)2So4 из расчета на 10 мл раствора (образца). Далее добиваются полного растворения соли. После чего раствор помещают в морозильную камеру при температуре 5-10°С на 24 часа. Далее образцы центрифугируют в течение 40 минут при t=5°С со скоростью 4200 об/мин. После центрифугирования водный слой используют для хроматографического разделения.

Вторым этапом получения фармацевтической композиции является хроматографическое разделение пептидов и их очистка.

Разделение проводили в следующих условиях: колонка BioSep S2000 300×2120 мм, длина волны 280 нм, объем петли 1575 мкл, элюент - 0,1 М фосфатный буферный солевой раствор, скорость потока - 1,0 мл/мин, температура колонки 25°С.

Образец исследуемого раствора с помощью шприца вводили в хроматографическую колонку. Время анализа для одной пробы занимает 60 минут. Смесь пептидов, обладающую антимикробной активностью, выделяли при времени удерживания 18-22,5 минуты. Всего для исследований было собрано шесть фракций, представленных в таблице 1 и на рисунке 1.

Время удерживания определяли по стандартам, анализируемым перед введением исследуемой пробы индивидуально, время удерживания инсулина свиного со временем удерживания 18 минут и массой 6 кДа и инсулина из поджелудочной железы быка 22,5 минут, масса 3,4 кДа. Таким образом, выделена смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica с массой 3,4-6 кДа. Далее полученную смесь диализовали на протяжении 24 часов против 0,9% раствора хлорида натрия.

Третий этап

Для создании конечной фармацевтической композиции, полученный раствор разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия в воде до концентрации пептидов 1,12 мг/мл после чего добавляли в отношении 9:1 (по объему) 10% водный раствор бензилового спирта и полученную фармацевтическую композицию пропускали сквозь фильтр 0,45 мкм, а затем расфасовывали по стерильным флаконам.

Приготовление питательной среды и физиологического раствора

Приготовление МПБ. Для приготовления 1 л МПБ взвешивают 20 г питательной среды, добавляют в 1 л дистиллированной воды и перемешивают. Раствор ставят на огонь, нагревают до полного растворения и кипения.

Приготовление суспензии микроорганизмов

Антибактериальную активность определяли согласно методике МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания.

Для проведения опыта выбраны следующие культуры - Bacillus cereus АТСС 10702, Candida albicans РКПГУ-401/ИСТС-885-653, Staphylococcus aureus АТСС 6538 (209-P), Salmonella typhimurium 1626.

Выявлено, что белковая фракция №2, полученная от личинки Musca domestica, имеет противомикробную активность (табл. 2). Наблюдается, что указанная фракция активна по отношению ко всем исследованным штаммам.

Таким образом, выявлено, что белковая фракция №2, полученная из личинок Musca domestica обладает антимикробной активностью.

1. Способ получения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, включающий измельчение навески личинок массой 3 г в ступке с песком 5 г до однородной массы с добавлением по частям раствора, состоящего из 0,5 мл 0,25% азида натрия и 20 мл фосфатного буфера, перемешивание в течение 4 часов, центрифугирование при 4200 об/мин, отбор водного слоя, содержащего антимикробные пептиды, высаливание путем добавления к выделенному раствору 2,8 г (NH4)2SO4 из расчета на 10 мл раствора, помещение раствора в морозильную камеру при t=5-10°С на 24 ч, центрифугирование в течение 40 минут при t=5°С со скоростью 4200 об/мин, хроматографическое разделение пептидов в колонках BioSep S2000 300×2120 мм при длине волны 280 нм, объеме петли 1575 мкл, используя элюент - 0,1 М фосфатный буферный солевой раствор, при скорости потока - 1 мл/мин и температуре колонки 25°С, выделение фракции смеси пептидов с массой 3,4-6 кДа при времени удерживания 18-22,5 мин, диализ полученной смеси на протяжении 24 часов против 0,9% раствора хлорида натрия, пропускание через фильтр и расфасовку.

2. Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica, обладающая антибактериальной активностью, содержащая смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, полученных способом по п. 1, в концентрации 1,12 мг/мл, 10% водный раствор бензилового спирта и буферную систему, включающую 0,9% водный раствор хлорида натрия в качестве регулятора осмотического давления, причем раствор пептидов в 0,9% водном растворе хлорида натрия и 10% водный раствор бензилового спирта взяты в объемном соотношении 9:1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложен способ получения Fc-области класса IgG человека, содержащей первый вариантный полипептид Fc-области и второй вариантный полипептид Fc-области.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению биологически активных полипептидов, которые обладают модулирующим действием на участвующие в генерации болевого сигнала клеточные рецепторы, и может быть использовано для получения пептида РТ6 в системе экспрессии Е.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к антитромботической молекуле, обладающей как антитромбоцитарной, так и антикоагулянтной (АРАС) активностью, и может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложены новые варианты антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфично связываются с ММР9 и содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, каждая из которых характеризуется наличием по меньшей мере соответствующих CDRs1-3.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения Gd3+-связывающего белка. Комплекс белка с ионами Gd3+, в свою очередь, может быть использован для получения физиологически приемлемого Gd3+-содержащего агента, пригодного для контрастирования опухолей с помощью спектроскопии парамагнитного резонанса и для радиотерапии опухолей по принципу термоаблации.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывает рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), включающее антитело, маскирующий фрагмент, который в нерасщепленном состоянии ингибирует связывание антитела с EGFR, и расщепляемый фрагмент, который функционирует в качестве субстрата для протеазы.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к Fc-связывающему полипептиду с улучшенной щелочной стабильностью, содержащему мутант Fc-связывающего домена белка А Staphylococcus (SpA), где мутант имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-17.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к белковому комплексу агонист ИЛ-15, состоящему из растворимого слитого белка (I) и растворимого слитого белка (II), где слитый белок (I) представляет собой ИЛ-15(L52C) с SEQ ID NO: 2, а слитый белок (II), выбран из ИЛ-15Rα-ECD(S40C)-Fc с SEQ ID NO: 5, Fc-ИЛ-15Rα-ECD(S40C) с SEQ ID NO: 6, ИЛ-15Rα-Sushi+(S40C)-Fc с SEQ ID NO: 7 или Fc-ИЛ-15Rα-sushi+(S40C) с SEQ ID NO: 8, и может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-CD19 химерный антигенный рецептор, выделенная молекула анти-CD19 химерный антигенный рецептор, а также гуманизированный анти-CD19-связывающий домен.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и цитотоксина для доставки цитотоксина субъекту (варианты), композицию для терапевтического применения, содержащую вышеуказанный конъюгат, способ лечения нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества композиции, выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело для получения вышеуказанного конъюгата, вектор экспрессии, клетку-хозяина для продуцирования вышеуказанного конъюгата, способ получения конъюгата, конъюгат антитело-лекарственное средство для доставки группы лекарственного средства субъекту.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению антимикробной композиции для лечения или предупреждения инфекции, выбранной из бактериальной или грибковой.

Группа изобретений относится к области фармации, в частности к противопаразитарным пероральным композициям для лечения животных. Композиция содержит комбинацию, состоящую из эфирного масла, содержащего гамма-терпинен, корвакрол и тимол, выбранного из рода Origanum и рода Thymus, и эфирного масла, выбранного из рода Cinnamomum и Eugenia, или эфирного масла рода Cinnamomum и эфирного масла рода Eugenia.

Изобретение относится к средству на основе соединений формулы (1а, б), обладающему антибактериальной и протистоцидной активностью. 3 табл. .

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к профилактике и лечению паразитарных болезней сельскохозяйственных животных и птиц. Способ заключается в том, что животным и птице при поражении экто- и/или эндопаразитами однократно или двукратно подкожно, или внутримышечно, или перорально в смеси с концентрированным кормом или с водой вводят лекарственное средство, содержащее в г на 100 мл: ивермектин - 0,4-0,6, празиквантел - 5,0-7,0, метилпирролидон - 24,0-26,0, спирт бензиловый - 0,5-1,5, пропиленгликоль - до 100, в дозе 0,6-1,2 мл на 15-20 кг живой массы.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой комбинацию, составленную для введения курице или индейке для обеспечения улучшения коэффициента кормоотдачи, продуктивности и/или сопротивляемости к инфекции кокцидиями у курицы или индейки, содержащую: от 200 ppm до 5000 ppm первой композиции, содержащей Quillaja saponaria в форме размолотых в порошок, раздавленных, измельченных или перетертых корней, стеблей, стволов, коры, листьев, цветков, стеблей цветов, семян, или их комбинации, и/или либо (i) его экстракт, полученный с помощью прессования, или (ii) его химический экстракт, либо (iii) оба указанных экстракта (i) и (ii), и Yucca schidigera в форме размолотых в порошок, раздавленных, измельченных или перетертых корней, стеблей, стволов, коры, листьев, цветков, стеблей цветов, семян, или их комбинации, и/или либо (i) его экстракт, полученный с помощью прессования, или (ii) его химический экстракт, либо (iii) оба указанных экстракта (i) и (ii); и вторую композицию, содержащую противомикробное средство, антибиотик, противококцидийное средство или их комбинации.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к средству для лечения кур, больных маллофагозом. Средство включает полисульфид калия, лимонную кислоту и воду дистиллированную.

Изобретение относится к области медицины, в частности, предназначено для оптимизации условий длительного хранения сыворотки крови и направлено на повышение стабильности диагностических параметров антител к возбудителям паразитарных болезней (токсокароз, эхинококкозы) при длительном хранении в низкотемпературных условиях.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и касается лечения протозойных инфекций у животных. Для этого вводят комбинацию толтразурила и комплекса железа.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способу производства мягкого жевательного ветеринарного фармацевтического препарата для перорального введения, содержащего по меньшей мере один активный фармацевтический ингредиент, который включает стадии: a) смешивания по меньшей мере одного активного фармацевтического ингредиента с одним или несколькими сухими и/или жидкими компонентами, включающими наполнитель(и), вкусовую(ые) добавку(и) и сахар(а), с получением предварительной смеси, b) нагревания формующего агента до плавления, c) смешивания предварительной смеси и формующего агента вместе с получением пасты, d) загрузки пасты в контейнер, связанный с роторной формовочной машиной; и e) формования пасты фармацевтического препарата в роторной формовочной машине с получением мягкого жевательного ветеринарного фармацевтического препарата в виде дозированных форм.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при оздоровлении организма человека. Для этого проводят комплекс процедур и сеансов, включающих лечебное голодание.
Изобретение относится к области нанотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Способ получения нанокапсул сухого экстракта прополиса характеризуется тем, что сухой экстракт прополиса добавляют в суспензию альгината натрия в изопропаноле в присутствии 0,01 г сложного эфира глицерина с одной-двумя молекулами пищевых жирных кислот и одной-двумя молекулами лимонной кислоты в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1000 об/мин, далее приливают бутилхлорид, полученную суспензию нанокапсул отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом массовое соотношение ядро : оболочка составляет 1:1, 1:2 или 1:3.

Группа изобретений относится к области ветеринарной медицины, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для лечения инфекций бактериальной этиологии. Способ получения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica включает измельчение навески личинок в ступке с песком до однородной массы с добавлением по частям раствора, состоящего из 0,25 азида натрия и фосфатного буфера, перемешивание в течение 4 часов, центрифугирование, отбор водного слоя, содержащего антимикробные пептиды. Затем осуществляют высаливание путем добавления к выделенному раствору 2SO4, помещение раствора в морозильную камеру при t5-10°С на 24 ч, центрифугирование в течение 40 минут при t5°С со скоростью 4200 обмин, и хроматографическое разделение пептидов с выделением фракции смеси пептидов с массой 3,4-6 кДа. Полученную смесь подвергают диализу на протяжении 24 часов против 0,9 раствора хлорида натрия, пропускают через фильтр и расфасовывают. Группа изобретений также относится к композиции антимикробных пептидов, содержащей смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, полученных указанным способом. Группа изобретений обеспечивает получение пептидов из личинок Musca domestica, обладающих антибактериальной активностью. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Наверх