Способ твердофазного синтеза пептидов

 

О П И С А Н И Е пц 539874

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 03.10,75 (21) 2177909/04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 25.12.76. Бюллетень Ме 47

Дата опубликования описания 11.02.77 (51) М. Кл. С07С 103/52

//А 61 К 37/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Ю. В. Митин, Н. П. Запевалова и Е. Е. Максимов

Институт белка АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ

Предлагается улучшенный твердофазный способ получения пептидов, который может найти применение в синтезе биологически активных пептидов, например гормонов.

В химии пептидов известны твердофазные методы синтеза пептидов, которые состоят в том, что исходную аминокислоту ковалентно связывают с полимерным носителем с последующим наращиванием пептидной цепи путем конденсации аминокислотных остатков (1) — (3) и (5). Готовые пептидные цепи снимаются с полимерного носителя только после завершения всего процесса с помощью реагентов, разрушающих ковалентную связь пептида с носителем.

Однако при осуществлении известного способа невозможно выделять продукт на отдельных этапах синтеза и очищать его.

При снятии готового пептида с полимерного носителя кроме расщепления ковалентной связи пептид †носите могут протекать другие побочные реакции, ведущие к загрязнению конечного продукта (4).

Целью изобретения являются упрощение процесса за счет использования легкодоступного, дешевого носителя — силикагеля — и улучшение качества целевого продукта благодаря тому, что на любом этапе синтеза продукт может быть выделен, очищен и проанализирован. При этом для образования пептидной связи можно использовать любые из существующих методов, Наиболее подходящим является метод активированных эфиров (5).

Предлагаемый способ твердофазного синтеза пептидов путем конденсации аминокислотных остатков на твердом носителе отличается тем, что в качестве твердого носителя используют силикагель, пропитанный полярным растворителем и суспендированный в неполярном

10 жидком предельном углеводороде.

В качестве полярного растворителя используют растворители, не смешивающиеся с жидкими углеводородами, например диметилформамид, ацетонитрил, гексаметилтриамид

15 фосфорной кислоты.

В качестве неполярных растворителей применяют гексан, петролейный эфир, гептан, октан.

Количество силикагеля, необходимое для

20 синтеза полимера, определяется размером конечного полимера.

Количество силикагеля зависит от размера конечного пептида, например для дипептидов достаточно брать 1 — 2 r силикагеля на

25 1 ммоль псптида, для декапептпдов 5 — 10 г, другими словами и граммов силикагеля на

1 ммоль пептида, состоящего из и аминокис лотных остатков.

Наносят исходные вещества на силикагель

30 следующим образом. 1 ммоль аминокомпонен539874

1О

20

25 зо

Аминокислотный

Цис(В !) Тир Иле Глю Асп Про Лей Гли

2 1 1 1 1 1 1 1

2,08 1,06 1,06 1,24 1,15 1,01 1,08 1,0 состав

Вычислено

Найдено

55 оо

65 та (эфира или амида аминокислоты или пептида) растворяют в спирте, в раствор добавляют силикагель (из расчета и граммов для синтеза пептида, состоящего из и аминокислотных остатков), тщательно перемешивают до образования однородной массы, затем растворитель удаляют в вакууме.

Прим еры.

А. Z — Вал — вал — OBz 1.

0,75 r (2 ммоль) толуолсульфоната бензилового эфира валина наносят на 5 г силикагеля, как указано выше. Полученную массу добавляют к раствору 0,9 г (2,16 ммоль) Z — Вал—

OC Fq в смеси 2,5 мл диметилформамида и

40 мл гексана и при энергичном перемешивании доводят рН до 8 — 8,5, добавляя 0,6 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 1 час, затем силикагель отфильтровывают и промывают несколько раз гексаном. Продукт реакции элюируют этилацетатом, полученный раствор промывают 5О/о-ной соляной кислотой, насыщеным раствором бикарбоната натрия, водой. После отгонки растворителя получают хром атографически чистый дипептид с выходом 0,82 г (93О/о), т. пл. 115—

116,5 С (по литературным данным т. пл. 111—

112 С) .

Б. Z — АСН вЂ” Сер — ОСНз.

Подготовку и синтез проводят аналогично пункту А. После синтеза силикагель промывают эфиром и этилацетатом, продукт реакции элюируют диметилформамидом, растворитель отгоняют в вакууме, остаток заливают водой и выдерживают в холодильнике несколько часов. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, тщательно промывают эфиром, сушат до поД. Вос-Цис (Bzl) -Про-Лей-Гли-NH>.

К 0,32 г (1 ммоль) НС1 Про-Лей-Гли-КН, нанесенного на 5 r силикагеля, добавляют

40 мл гексана, затем при перемешивании приливают раствор 1 г (2,1 ммоль) Вос-Цис(Вк!)OCgFg в 2 мл ацетонитрила (или гексаметилтриамида фосфорной кислоты), рН раствора доводят до 8,5 — 9 добавляя триэтиламин.

Смесь перемешивают 1 час при комнатной температуре. Силикагель отфильтровывают, промывают эфиром (3; 50 мл). Пептид элюируют тремя порциями этанола (по 50 мл).

Этанол отноняют, остаток обрабатывают водой, выпавший осадок отфильтровывают, промываютт эфиром и сушат над фосфорным ангидридом. Получают у казанное соединение.

При использовании в качестве полярного расгворителя ацетонитрила выход 0,53 г (92 /о), т. пл. 172 — 174 С, при применении гексаметилтриамида фосфорной кислоты выход 0,54 г (93 5о/о), т. пл. 175 — 176 С. стоянного веса над фосфорным ангидридом.

Выход хроматографически однородного дипептида 97",о, т. пл. 199 — 202=С (по литературным данным т. пл. 195 — 196 С).

В. Вос — Трп — Мет — Асп (ОН) — Фе —,NH .

Указанный тетрапептид синтезируют, исходя из 0,16 г (1 ммоль) Н вЂ” Фе — NH2. Синтезированный тетрапептид элюируют диметилформамидом, растворитель удаляют почти полностью в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 5/о-ным KHSO4 и водой, содержащими 10 /о диметилформамида. Затем этилацетат отгоняют, остаток промывают эфиром и кипятят с абсолютным этилацетатом. Остаток отфильтровывают и промывают этилацетатом. Выход хроматографически чистого тетрапептида 0,51 г (71, т. е. в среднем 95 /о на стадию), т. пл. 205—

210 С (по литературным данным т. пл. 209—

210 С) .

Г. Н-Цис(Вк1) -Тир-Иле-Глн-Асн-Цис(Вк1)Про-Лей-Гли-ИН2.

Указанный нонапептид синтезируют, исходя из 0,32 r (1 ммоль) НС1 Про-Лей-Гли-NHq.

Конечный продукт элюируют горячим диметилформамидом, растворитель удаляют в вакууме, остаток промывают водой, эфиром и сушат над фосфорным ангидридом. Выход составляет 0,41 г (29 о/О ) . Полученный продукт обрабатывают HBr в уксусной кислоте (5,5 н.), высаживают в эфир и перекристаллизовывают из воды. Выход электрофоретически и хроматографически чистого продукта

0,25 r (19О/о, считая на исходный НС1 Н-ПроЛей-Гли-NH2) .

Е. В синтезе указанного в пункте Д тетрапептида с одинаковым успехом применяют петролейный эфир, гептан и октан. Во всех случаях выход тетрапептида практически одинаков ()90%).

Формула изобретения

1. Способ твердофазного синтеза пептидов путем конденсации аминокислотных остатков на твердом носителе, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества целевого продукта, в качестве твердого носителя используют силикагель, пропитанный полярным растворителем и суспендированный в неполярном жидком предельном углеводороде.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полярного растворителя ис539874

Составитель В. Волкова

Редактор О. Кузнецова

Корректор Е. Хмелева

Техред А. Камышникова

Заказ 3024/10 Изд. № 350 Тираж 575 Подпиг.one

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 пользуют растворители, не смешивающиеся с жидкими предельными углеводородами, например диметилформамид, ацетонитрил, гексаметилтриамид фосфорной кислоты.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неполярных растворителей используют гексан, петролейный эфир, гептан, октан.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент СССР № 250153, М. Кл. С 07С

103/52, 12.08.69.

2. Патент Швейцарии № 512439, класс

С 07С 103/52, 29.10.71.

3. Стюарт Д., Янг Д., «Твердофазный синтез пептидов», M., «Мир», 1971.

5 4. Feinberg R. S., Merrifield К. В., «Modification of Peptides Containing Glutamic Acid

by Hydrogen Fluoride — Anisole Mixtures, 1>-Acylation of Anisole or the Glutamyl Nitrogen», J. Amer, Chem. Soc., 97, № 12, 3485, 10 1975.

5. Шредер Э., Любке К., «Пептиды», т. 1, стр. 116 — 190, M., «Мир», 1969.