Модифицированный макропористый кремнезем в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков и способ его получения

 

E О П

ИЗОБРЕТЕНИЯ п1 540870

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свпд-ву (22) Заявлено 24.10.75 (21) 219G534/04 (51) М. Кл. - С 07F 7/18

С 07G 7/00

В 01D 15/08 с присоединением заявки Ле

Госуаарстеенный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и отхрытнй (23) Приоритет

Опубликовано 30.12.76. Бюллетень М 48

Дата опубликования описания 08.02.77 (53) УДК 547.245.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Б. Ю. Заславский, В. И. Лозинский, Ю. А. Давидович и С. В. Рогожин

Ордена Ленина институт элементоорганических соединений АН СССР (71) Заявитель (54) МОДИФИЦИРОВАННЪ|Й МАКРОПОРИСТЫЙ

КРЕМНЕЗЕМ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ДИСУЛЬФИДНООБМЕННОЙ КОВАЛЕНТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

БЕЛКОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

СООН СΠ— МИ- СНз —.COOH

-о,,С= К-СН- СНД- CO-HH-CH-СН вЂ” Я вЂ” Я

Изобретение относится к области элементоорга нических соединений, а именно к носителю для дисульфидно-обменной кавалентной хроматографии белков и опособу его получения.

Дисульфидно-обменная ковалентная хроматография находит применение для выделения, Этот носитель используется для выделения и очистки индивидуальных белко в, но он имеет недостатки, ограничивающие возможности его применения как в лабораторных, так и в промышленных условиях.

Одним из главных недостатков такого носителя является низкая механическая проч ность его матрицы — агарозного геля и, кроме того, малая устойчивость к воздействию повышенных температур и органических растворителей.

Он разрушается микроорганизмами, его нельзя стерилизовать, набухаемость геля в большой степени зависит от условий среды. очистки и иммобилизации ферментов, а также инди|видуальных белков.

В качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии из|вестен продукт на основе гидрофильного геля агарозы, содержащей на поверхности группы

С пособ получения указанного носителя заключается в активации полисахаридного агарозного геля бромцианом с последующей обработкой полученного продукта восстановленным глутатионом, после чего тиолсодержащий носитель обрабатывают 2,2 -дипиридилдисульфидом.

К недостаткам этого способа следует отнести необходимость, работы с ядовитым веществом — бромцианом, а также использование природного гормона — восстановленного глутатиона.

20 Известно также взаимодействие 1-оксо-2-ме540870

3 тил-2-этокси-3-тиолан-4-метил - 5-она с лер вичным амином,,приводящее к лолучению амидов а-мерка1птокарбоновых кислот, а также использование модифицированного кремнезема для иммобилизации ферментов.

Однако аминоалкилиросванный крем незем не подвергался модификации 1-оксо-2-этокси-3тиолан-5-оном и в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии бе.тков не использовался.

Целью предлагаемого изобретения является получение носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хром атографии белков с улучшенными физико-механическими и биологическими овойствами, а также разработка способа его получения.

Эта цель достигается использованием в кас1остве носителя для дисульфпдно-обменной ковалентной хроматографии белков химически модифицированного макропористого кремнезема, содержащего на поверхности группу

Отличительными, признаками описываемого носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков является использование;в качестве матрицы макропористого

О 0

-1 СН, -, НН,. С,Н, - О -(11

4,СНДз МН вЂ” C0 — СН SH + $-8

М

СCC, НН-CO СН,— S-S-(N иаиропораеп ыи

)грбуиюе/у.pgpgonapuemwu регтегел ююопориспъа крепнегег

Пример 1. Получение носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматогр афии белков.

3 г аминоалкилировап ного макропористого кремнезема суспендируют в 10 мл сухого бензола, добавляют 0,5 мл l-оксо-2-этокси-3-тиолап-5-она (т. кпп. 7G С при 1 мм рт.cr.; п о

1,4805) и .перемешивают б часов при комнатной температуре. Растворитель отделяют декантацией, т1вердую фазу промы1ва1от бензолом (3)(20 мл) апиртом (ЗУ20 мл), деионизо ван ной водой (20 мл), буферным раствором (О,IM-Трис-НС1 — 1 мм этилендиаминотетрауксу сная:кислота (ЭДТА), рН 8,0) и суспендируют в 10 мл указанного буфера. К суспензии добавляют 5 мл раствора 0,5 г 2,2 дипиридилдисульфида в диметилформамиде и перемешивают реакционную смесь б «ас при комнатной температуре. Жидкую фазу отделяют, носитель промывают сухим бензолом (100 мл), водой (100 мл) и абсолюпным сниртом (200 мл); целевой продукт сушат в ва(CHg(g 8H — C0 -СН,-S — S

И кремнезема, а в качестве привитых групп группы.1СО НН вЂ” СΠ— СН вЂ” С вЂ” C<

Способ получения модифицированного макропористого кремнезема, содержащего на говерхности гру ппу

- СН,1; 1H — ÑÎ вЂ” СН,-i3 S-(N заключается в том, что макропористый кремнезем, модифицированный -ампiioIIpoпплтрпэтсксисиланом, подвергают взаимодейс1вшо с

l-оксо-2-этокси-3-тиолан-5-оном, предпочтительно взятом в пятикратном избытке по отHoiHeHи1о к амипогруппaм носителя, В среде инертного органического растворителя, например бензола, с последующей обработкой полуIcHHoã0 продукта 2,2 -,дипиридилдисульфидом в водноорганической среде при рН 7,2 — 8,5.

Для ускорения этой реакции 2,2 -дипиридплдисульфид желательно брать в пятикратном избытке по отношеньчо к числу SH-групп носителя в виде концснтрирова нного раствора в смеши вающемся с водой органическом растворителе, например ди. ет1лформамиде, диЗ:1 oi ане, спирте.

Процесс протекаст по следующей схеме: куум-эксикаторе над Р,Он. Количество активHbIx к дпсульфидному обмену групп, определенное спектрофотометрированием 1выделившегося при исчерпыьающем восстановлении навсски EiocHTpëH 2-тиопиридона, составляет

40 ммоль — S — S-групп на 1 г полученного носителя J, IH Ho ." ьфпдно-обменной ковалентпой хроматографии.

Пример 2. Использование носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии .при очп тке лизоцима белка куриных яиц. 10 мл раствора буфера (0,1М трис-НС1—

0,15 М Ха-додецилсульфат — 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), содержащего 50 мг лизоцима белка куриных яиц (марки В), восстановленного в денатурирующих условиях (2-меркаптоэтанолом в присутствии Na-додецилсульфата) и освобожденного от избытка восстанавливающего агента гельхроматографией, в сосуде с мешалкой вводят в контакт с 1 г носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии и перемешивают 3 час при комнатной

540870

55 температуре. Затем отделяют твердую фазу, промывают ее и суспендируют в 5 мл буферного раствора (рН 8,0), содержащего 0,1 мл

2-меркаптоэтанола. Перемешивание ведут

4 час при комнатной температуре; фазы разделя| . центрифугированием при 3500 oo/мин в течение 10 мин, а надосадочную жидкость подвергают обессоливанию на сефадексе Г-25.

Выход очищенного от низко- и высокомолекулярных.примесей белка 39,6 мг.

Пример 3. Выделение бычьего сывороточного меркаптоальбумина из препарата белка прп помощи носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии.

100 мг бычьего сывороточного альбумина («Ciech», Польша) с содержанием остаточных липидов 2,7,> и ЬН-титром 0,49+ 0,02 моль

Н-групп на 1 моль белка растворяют в 20 мл буферного раствора (0,1 М трис-НС1 — 4,15М

Na-додецилсульфат — 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и в сосуде с мешалкой вводят в контакт с

2 г носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии. Перемешивают 2 час при комнатной температуре, промывают буфером (100 мл) дистиллированной водой (100 мл), 50%-ным этанолом (50 мл), деионизованной водой (100 мл) и окончательно буфером (100 мл). Далее суспензию вносят в хроматографическую колонку (1р, 10 см), промывают 20 мл буфера, а затем pBcTIBopBMH c линейным градиентом концентрации D,L-цистеина в том же буфере от О до 0,1 моль D,L-цистеина. Фракции, содержащие белок, объединяют, обессоливают электродиализом и высушивают лиофильно. Выход маркаптоальбумина с SH-титром 1,00 0,02 моль SH-групп на

1 моль белка; 41 мг. Он не содержит остаточных липидов, димерного альбуми на и альбумина с блокированной SH-группой.

Пример 4. Использование носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии при извлечении альдолазы из сильно разбавленного раствора.

500 мл сильно разбавленного раствора (10- М) альдолазы из скелетной мышцы кролика («Boehringer & Soehn», ФРГ) в буфере (5 М мочевина — 0,1 М Na-фосфат — 1 мМ

ЭДТЛ, рН 7,8) в течение 6 час интенсивно встряхивают при температуре 4 С с 0,5 r носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии.

Твердую фазу затем отделяют фильтрованием, промывают 50 мл буфера и вносят суспензию в хроматографическую колонку (1 10 см), При промывании колонки линей5

Ç0

35 ным градиентом концентрации Р,L-цистеина от 0 до 0,2 М раствора в том же буфере белок смывают в объеме 1,6 мл, т. е. в од ну стадию раствор белка удается сконцентрировать в

312 раз. После обессоливания диализом и лиофильной сушки выход белка составляет

13,9 мг. Гомогенность полученного препарата подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле.

Пример 5. Регенерация отработанного носителя.

3 г отработанного носителя, т. е. носителя, использованного в процессе дисульфиднообменной ковалентной хроматографии, суспендируют в 20 мл буфера (0,01 М Трис-НС1—

0,15 М Na-додецилсульфат — 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), добавляют 0,5 мл 2-меркаптоэтанола и перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют, промывают буфером, а затем обрабатывают 2,2 -дипиридилдисульфидом согласно методике, описанной в примере 1.

Носитель для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии согласно настоящему изобретению обладает вьгсокой механической прочностью, устойчивостью к условиям стерилизации и повышенным температурам (до

200 — 300 С), инертностью к органическим растворителям, отсутствием за висимости объема матрицы от применяемой жидкой фазы.

Этот носитель не разрушается микроорганизмами, может длительное время храниться в нестерильных уcJIQBHSIx, а после частичного срабатывания активной поверхности легко регенерируется.

Формула изобретения

1. Модифицированный макропористый кремнезем, содержащий на поверхности группу в качестве носителя для дисульфидно-обменной ковалентной хроматографии белков.

2. Способ получения соединения по п. 1, о тл и ч а ю шийся тем, что макропорпстый кремнезем, модифицированный у-аминопропилтриэтоксисиланом, подвергают взаимодействию с

1-оксо-2-этокси-3-тиолан-5-оном в среде инертного органического растворителя, с последующей обработкой полученного продукта 2,2 -дипиридилдисульфидом в водноорганической среде при рН 7,2 — 8,5.