Способ получения полипептидов

 

пц 582246

ОПИСАНИЕ

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. спид-ву (22) Заявлено 05.07.76 (21) 2380584/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30,11.77. Бюллетень № 44 (45) Дата опубликования описания 03.03.78 (51) М. Кл. - С 07С 103/52

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) св делам изобретений и OTKpblTHr1 (72) Авторы изобретения

Г. А. Желтухина, Е. И. Филиппович, М. В. Сидорова и P. П. Евстигнеева

Московский ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДО — Ьец — N, 30

Изобретение относится к новому способу получения полипептидов; обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в биологии и медицине.

В настоящее время широкое распространение получил твердофазный метод пептидного синтеза. При этом чаще используют различные виды фрагментарной конденсации пептидов на полимере с последующей очисткой конечного продукта конденсации гель-хроматографи,ей.

Основная задача при синтезе пептидов, ооладающих специфической биологической активностью — сохранение их оптической чистоты.

Среди различных методов фрагментарных конденсаций как в растворе, так и в твердой фазе, наиболее надежным с точки зрения предотвращения рацемизации оптически активных аминокпслотнь х остатков, составляющих пептид, является азидный метод.

Однако известные примеры азидной конденсации, фрагментов на полимере описывают синтез сравнительно коротких пептидов, например конденсацию октапептида с пентапептидом, которая требует для своего осуществления длительного времени (6 дней) и высокой температуры (+5 С) и хотя выход продукта конденсации высок (90%), он загрязнен побочными продуктами, поскольку азиды пептидов при температуре около 0 С и выше подвергаются перегруппировке.

Кроме того, азидная конденсация защищенного трипептида с пентапептидилполимером при 0 — 4 С за 20 ч прошла лишь на боо/,.

Цель изобретения — создание нового более простого и эффективного способа проведе10 ния азидной конденсации больших фрагментов на полимере с хорошим выходом целевого пептидилполимера, за короткое время, без рацемизации, т. е. упрощение процесса.

Достигается это способом получения полипептида общей формулы

Вос — Lys(Z) — Gly — Thr — P he — Аlа — Thr—

20 — l.ец — Ser — Glu (Bzl) — Leu — His (Dnp)— — Gus — Asp (Bzl) — Lys (Z) — Ьец— — His (Dnp) — Val — Asp (Bzl) — PrO — P, где P — полимер, заключающийся в том, что конденсацию азида общей формулы

Boc — Lys (Z) — Gly — Thr — Phe — А1а — Thr—

Заказ 2910/1

Изд. № 1029

Тираж 563

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2 с пептидилполимером

Н вЂ” Ser — Glu (Bzl) — Leu — Iis(Dnp)— — Cys (Bzl) — Asp (Bzl) — Lys {Z) — Leu — His (Dnp) Val— — Asp (Bzl) — Pro — Р проводят в присутствии избытка пентафторфенола при температуре от — 5 до — 10"С.

Предпочтительный вариант способа заключается в том, что пентафторфенол берут в 1,6-кратном избытке.

Азидная конденсация пептидных фрагментов на полимере в присутствии пентафторфенола проходит за 20 ч, причем выход целевого нонадекапептидилполимера составляет более 75% и не наблюдается рацемизация коне шых аминокислотных остатков.

Описываемым способом получен нонадекапептид, последовательность амипокислотHbIx остатков в котором соответствует последовательности 82 — 100 13-цепи гемоглобина человека. Этот фрагмент входит в состав активного центра 1з-,öåïè гемоглобина, который вместе с заключенным в нем гемом, играет важнейшую роль в процессе обратимого связывания и переноса кислорода в организме человека, П р и мер. Получение нонадекапептидилполимера

Вос — Lys(Z) — Gly — Thr — Ph e — Ala — Thr— — Leu — Ser — Glu(Bzl) — Leu — His(Dnp)— — Gys(Bze) — Asp(Bzl) — Lys(Z) — Leu — His— — (Dnp) — Val — А sp(Bzl)- — PrO — P, соответствующего последовательности (82—

100) 1З-цепи гемоглобина человека.

К 25,0 мг (25,5 10 — ммоль)

Boc — Lys (Z) — Gly — Phe — Thr — Ala— — Thr — Leu N,Н, (четырехкратный избыток по отношению к аминокомпоненту) при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 0,17 мл диметилформамида. Образовавшуюся густую суспензию охлаждают до минус 30, минус

40 С, прибавляют 0 028 мл 5 0 н раствора

НС1 в тетрагидрофуране (5,5-кратный избыток по отношению к гидразиду) и 0,0055 мл (27,5 10 — моль) изоамилнитрита (1,07-кратный избыток по отношению к гидразиду). Перемешивают 50 мин при охлаждении до минус 35 — минус 40 С, нейтрализуют кислоту

0,0195 мл триэтиламина до рН 6 — 7. Полноту переходагидразидав азид определяют по исчезновению положительной качественной реакции реакционной смеси на гидразид. Через 5—

10 мин прибавляют 7,7 мг (41,8.10 — ммоль) пентафторфенола (1,65-кратный избыток по отношению к гидразиду), перемешивают

40 мин при температуре от — 30 до — 40 С, 30 мин при температуре от — 5 до — 10=С и прибавляют аминокомпонент — аминосвободный додекапептидилполимер. (Г1оследний

5 получен из соответствующего Вос-защищенного пептидилполимсра, N-концевая аминокислота, определенная дансильным методом — серии) .

Реакционную массу оставляют без пере10 мешивания при температуре от — 10 до — 5 С на 15 ч, затем перемешивают при той же температуре 4 — 5 ч. Далее температуру повышают до 20 С и перемешивание продолжают еще в течение 2 ч.

1о Пептидилполимер отделяют от раствора, промывают диметилформамидом (4+3 мин )(;; 2 мл), метанолом (3 > 3 мнн X 2 мл) и сушат. Получают 22 мг пептидилполимера; 1,8 мг пептидилполимера гидролизуют при температуре 130 — 140 С в смеси пропионовой и 12 н соляной кислот (1: 1) в течение 1 ч, Гидролизат упаривают в вакуумс.

Количественный анализ гидролизата нонадекапептидилполимера дает следующие соотношения аминокислот, входящих в гептапептид и неповторяющихся в додекапептидилполнмере, по отношению к глютаминовой кислоте:

Glu (1), Phe 0,85 (1), Gly 0,83 (1), Аlа 0,75 (1). Выход конденсации, считая на глютамиЗ0 новую кислоту, составляет 75 — 85% (на N— концевой серии не считают, так как он частично разрушается при гидролизе).

Фор мула .изобретения

1. Способ получения полипептидов общей формулы

Boc — Lys(Z) — Gly — Thr — Phe — AIa — Thr—

40 — Leu — Ser — Glu(Bzl) — Leu — His(Dnp)— — Gus — Asp{Bzl) — Lys(Zj) — Leu — His(Dnp)— — Val — Asp(Bzl) — P zO — P, где Р—.полимер, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, проводят конднсацию азида общей формулы II

Boc — Lys(Z) — G1y — Thr — P he — A la— — Thr — Leu — N, 50 с пептидилполимером формулы II

Н вЂ” S er — Glu (Bzl) — 1. ец — His(Dnp)— .— Cys(Bzl) — Asp(Bzl)— — Lys(Z) — L eu — His(Dnp) — Val—

55 — Asp(Bzl) — PrO — P в присутствии избытка пентафторфенола при (— ) 5 — (— ) 10 С.

2. Способ по п. 1, о тл и ч а ю шийся тем, 60 что пентафторфенол используют в 1,6-кратном избытке.